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    牙齦卟啉單胞菌來源的外泌體對(duì)食管癌細(xì)胞增殖遷移作用的研究

    2020-01-07 01:26:26王浩潔齊義軍朱夢(mèng)璽蘭子君梁高峰高社干
    食管疾病 2019年4期
    關(guān)鍵詞:培養(yǎng)箱外泌體食管癌

    王浩潔,史 浩,齊義軍,朱夢(mèng)璽,陳 攀,蘭子君,,張 灝,梁高峰,,高社干,

    食管癌(esophageal cancer,EC)是常見的消化道腫瘤之一,全世界每年約有57.2萬人死于食管癌。中國是世界上食管癌高發(fā)地區(qū)之一,每年新增食管癌患者占全球一半以上,其中90%以上屬食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell cancer,ESCC)[1-2]。由于早期食管癌缺乏典型癥狀及食管癌高危預(yù)警標(biāo)志,5 a生存率較低(<25%)。研究表明:誘發(fā)食管癌的高危因素包括營養(yǎng)缺乏(經(jīng)濟(jì)貧困)、攝入霉變食物或含亞硝酸鹽腌菜等因素。然而,隨著經(jīng)濟(jì)和生活水平提高,我國食管癌的發(fā)病率依然較高,這提示其中還可能存在其它危險(xiǎn)因素。

    研究發(fā)現(xiàn):約20%的惡性腫瘤與感染性因素相關(guān),如幽門螺桿菌(Helicobacterpylori,HP)與胃癌[3]、人乳頭瘤病毒(Human Papillomavirus,HPV)與宮頸癌[4]、具核梭桿菌(Fusobacteriumnucleatum)與結(jié)腸癌[5]。牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis,P.gingivalis)是口腔關(guān)鍵致病菌之一[6],并且大量的文獻(xiàn)報(bào)道了P.gingivalis感染與口腔癌、胰腺癌、老年癡呆等疾病的發(fā)生有一定關(guān)系[7-9]。此外,本課題組在之前也發(fā)現(xiàn)牙齦卟啉單胞菌感染可能是食管癌發(fā)生的一個(gè)高危因素[10-12]。還發(fā)現(xiàn):ESCC組織中P.gingivalis含量明顯高于癌旁組織和正常食管黏膜組織,P.gingivalis含量與ESCC分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期呈正相關(guān),與ESCC患者總體生存期呈負(fù)相關(guān)[13]。因此,P.gingivalis可能是ESCC發(fā)生發(fā)展過程中的重要參與者。然而,目前對(duì)P.gingivalis促進(jìn)食管癌發(fā)生發(fā)展確切的分子機(jī)制尚不清楚。

    越來越多的證據(jù)表明,腫瘤細(xì)胞來源的外泌體(exosome)被認(rèn)為是腫瘤多階段演進(jìn)中的關(guān)鍵因素[14-15]。作為一種直徑為30~150 nm的納米級(jí)別的胞外囊泡,外泌體通過攜帶多種生物活性成分介導(dǎo)細(xì)胞間的“物質(zhì)和信息的交流”[16],進(jìn)而影響腫瘤進(jìn)展的許多階段,包括血管生成、侵襲轉(zhuǎn)移和耐藥[17-19]。因此,探究牙齦卟啉單胞菌來源的外泌體(P.gingivalis-Exo)對(duì)食管癌細(xì)胞的影響,對(duì)研究P.gingivalis促進(jìn)食管癌發(fā)生發(fā)展,揭示其確切的分子機(jī)制有著十分重要的意義。本研究通過MTT、Transwell、劃痕和Western blot等實(shí)驗(yàn)探究P.gingivalis-Exo如何通過TGF-β1/Smad2通路促進(jìn)食管癌細(xì)胞增殖遷移。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    1.1.1 儀器超速離心機(jī)(日立CP100WX,日本);透射電鏡(JEM-2100,日本電子有限公司);Zetasizer Nano(Malvern Panalytical,英國);激光共聚焦顯微鏡(Nikon公司,日本);全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(BioTek公司,美國);蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)(Bio-Rad公司,美國);全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(Tanon 5200,上海天能科技有限公司);微量臺(tái)式高速離心機(jī)(Beckman Coulter,美國);CO2培養(yǎng)箱(Thermo Fisher,美國);厭氧培養(yǎng)箱(COY,美國)。

    1.1.2 菌株及細(xì)胞P.gingivalisATCC 33277購自美國模式生物培養(yǎng)庫(American type culture collection,ATCC);人食管癌細(xì)胞系(KYSE-150/KYSE-30)購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

    1.1.3 試劑Roswell Park Memorial Institute-1640培養(yǎng)基(RPMI-1640,Life Technologies公司,美國);胎牛血清(FBS,Gibco公司,美國);胰蛋白酶(南京維森特生物技術(shù)有限公司);熒光染料DIR、DAPI(Sigma公司,美國);四甲基偶氮唑鹽(MTT,Sigma公司,美國);BCA蛋白濃度試劑盒(上海生工生物工程股份有限公司);Transwell小室(Corning公司,美國);PVDF膜(Millipore公司,美國);ECL發(fā)光液(上海天能科技有限公司);二甲基亞砜(DMSO);一抗Smad2(CST公司,美國);TGF-β1(Abcam公司,美國);GAPDH(上海生工生物工程股份有限公司)。

    1.2 方法

    1.2.1 細(xì)菌培養(yǎng)P.gingivalis菌株ATCC 33277在含5%羊血、1%氯化血紅素和0.1%維生素K的GAM肉湯液體培養(yǎng)基中培養(yǎng),放置37 ℃厭氧培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)(85%N2、10%H2和5%CO2)。

    1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)KYSE-150/KYSE-30在含有10%FBS,1%青鏈霉素的RPMI-1640中培養(yǎng),放置于37 ℃、5%CO2的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

    1.2.3 外泌體提取收集P.gingivalis的培養(yǎng)上清液,加入50 mL離心管中,4 000×g離心30 min去除碎片。然后將上清液移入超離管中,超速離心100 000×g離心60 min,棄去上清液,最后用PBS緩沖液重懸沉淀,并用0.22 μm的針頭式過濾器進(jìn)行過濾,分裝置于-80 ℃冰箱備用。

    1.2.4 電鏡鑒定P.gingivalis-Exo的結(jié)構(gòu)P.gingivalis-Exo經(jīng)無菌的PBS稀釋后,取20 μL的P.gingivalis-Exo懸液滴加于直徑2 mm載樣銅網(wǎng)上,濾紙吸去多余液體,室溫靜置3 min,于銅網(wǎng)上滴加3%磷鎢酸溶液約10 μL,負(fù)染5 min,在透射電子顯微鏡下觀察P.gingivalis-Exo并拍照。

    1.2.5 Zetasizer Nano分析P.gingivalis-Exo粒徑使用Zetasizer Nano分析提取的P.gingivalis-Exo,將1 mL的P.gingivalis-Exo加入到比色皿中,上機(jī),待其布朗運(yùn)動(dòng)1 min后,使用Zetasizer Nano軟件進(jìn)行分析后計(jì)算出納米粒子濃度和尺寸分布。

    1.2.6 細(xì)胞攝取P.gingivalis-Exo將1 μL濃度為5 mg·mL-1的DIR溶液加入到PBS重懸的P.gingivalis-Exo溶液中,37 ℃避光孵育30 min,100 000×g超速離心60 min,棄去游離的DIR染料,所得產(chǎn)物用PBS稀釋。

    1.2.7 MTT實(shí)驗(yàn)根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組,收集對(duì)數(shù)期的食管癌細(xì)胞消化、離心,用完全培養(yǎng)基重懸成單個(gè)細(xì)胞懸液,接種于96孔板中(每孔5×103細(xì)胞),待其貼壁后加入P.gingivalis-Exo,每個(gè)樣設(shè)置5個(gè)復(fù)孔,放置在5%CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中孵育,分別在12、24、48、72 h后每孔加入15 μL的MTT(5 mg·mL-1),繼續(xù)孵育。4 h后終止反應(yīng),棄上清液,加入150 μL DMSO,避光振蕩10 min。用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)490 nm處測(cè)量OD值,并繪制生長(zhǎng)曲線圖。

    1.2.8 劃痕實(shí)驗(yàn)將5×105個(gè)細(xì)胞接種于六孔板中,放置在5%CO2、37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中孵育。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%,在每個(gè)孔中心用100 μL槍頭尖端刮擦細(xì)胞,PBS洗滌3遍,并加入無血清的培養(yǎng)基和P.gingivalis-Exo進(jìn)行共培養(yǎng),然后分別在0、12、24 h進(jìn)行拍照。通過Image J軟件確定無細(xì)胞區(qū)域。

    1.2.9 Transwell實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)前,先將50 mg·mL-1的基質(zhì)凝膠稀釋(50 mg·mL-1的基質(zhì)凝膠:PBS=1∶8),并將其加入到24孔Transwell小室的上室,放置在5%CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中過夜使基質(zhì)膠充分干燥。收集對(duì)數(shù)期的食管癌細(xì)胞,在無血清培養(yǎng)基中重懸,均勻混合。在Transwell上室中加入1×104個(gè)細(xì)胞,待其完全貼壁后加入P.gingivalis-Exo。最后,將500 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基添加到下室。37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,棄去上、下室培養(yǎng)液,PBS洗滌,晾干,取出小室用4%多聚甲醛固定2 h,PBS洗3次,4 g·L-1結(jié)晶紫染色30 min,再用PBS清洗3次,Transwell小室在顯微鏡下觀察和拍攝。

    1.2.10 Western Blot實(shí)驗(yàn)將5×106個(gè)細(xì)胞接種于直徑為6 cm的培養(yǎng)皿中,KYSE-150/KYSE-30細(xì)胞與P.gingivalis-Exo共培養(yǎng),37 ℃、5%CO2的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。24 h后,用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞3次,在細(xì)胞中加入300 μL RIPA裂解液(含3 μL的PMSF),冰上充分裂解,14 000 r·min-1、4 ℃離心15 min,收集上清液。BCA試劑盒測(cè)定樣品蛋白濃度后,調(diào)整至一定濃度,放置-80 ℃?zhèn)溆谩DS-PAGE電泳:取100 μL的細(xì)胞裂解液加入25 μL的5×Loading buffer,100 ℃沸水浴加熱10 min 以充分變性蛋白。冷卻至室溫后,將蛋白樣品加入10%SDS-PAGE膠的上樣孔內(nèi),先80 V后120 V恒壓電泳,然后300 mA恒流轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜完畢后,5%脫脂牛奶室溫封閉2 h,加入一抗GAPDH(1∶1 000)、Smad2(1∶1 000)、TGF-β1(1∶1 000),4 ℃搖床過夜,二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h,ECL顯色并拍照。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    2 結(jié)果

    2.1P.gingivalis-Exo的物理表征收集P.gingivalis的培養(yǎng)上清液,然后采用超速離心法提取外泌體。透射電子顯微鏡觀察P.gingivalis-Exo,如圖1所示,外泌體形狀如卵圓形或“碟形”的雙層的結(jié)構(gòu),大小均勻,直徑在100 nm左右(圖1A)。納米粒度儀分析顯示外泌體的粒徑主要分布在130 nm左右(圖1B)。

    A:電鏡下觀察P. gingivalis-Exo的形態(tài);B:Zetasizer Nano分析P. gingivalis-Exo粒徑分布。圖1 P. gingivalis-Exo的物理表征

    2.2P.gingivalis-Exo進(jìn)入食管癌細(xì)胞為進(jìn)一步研究P.gingivalis-Exo對(duì)食管癌細(xì)胞的影響,采用共聚焦顯微鏡觀察KYSE-150/KYSE-30細(xì)胞對(duì)P.gingivalis-Exo的攝取情況。P.gingivalis-Exo與食管癌細(xì)胞共培養(yǎng)4 h后,拍照觀察。紅色熒光表示被DIR染色的外泌體,藍(lán)色熒光表示被DAPI染色的細(xì)胞核,合并為明場(chǎng)、紅色熒光、藍(lán)色熒光的疊加圖。結(jié)果顯示,大部分紅色熒光定位在食管癌細(xì)胞胞質(zhì)中,說明P.gingivalis-Exo可以被食管癌細(xì)胞攝取。見圖2。

    圖2 食管癌細(xì)胞對(duì)P. gingivalis-Exo的攝取

    2.3P.gingivalis-Exo促進(jìn)食管癌的增殖、遷移和侵襲MTT實(shí)驗(yàn)常用于檢測(cè)細(xì)胞活力。MTT結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,P.gingivalis-Exo共培養(yǎng)的食管癌細(xì)胞增殖能力顯著增加(P<0.05,圖3A)。采用Transwell法檢測(cè)P.gingivalis-Exo對(duì)食管癌細(xì)胞侵襲能力的影響。結(jié)果表明,與空白對(duì)照組相比,P.gingivalis-Exo共培養(yǎng)組侵襲數(shù)量較多(P<0.05,圖3B)。通過劃痕實(shí)驗(yàn)評(píng)估了P.gingivalis-Exo對(duì)食管癌細(xì)胞遷移能力的影響,從圖3C可以看出,P.gingivalis-Exo處理后,細(xì)胞愈合率明顯加快(P<0.05),說明P.gingivalis-Exo顯著提高了細(xì)胞的遷移能力。以上結(jié)果表明,P.gingivalis-Exo對(duì)食管癌的增殖、遷移和侵襲具有明顯的促進(jìn)作用。

    2.4P.gingivalis-Exo通過TGF-β1/Smad2通路調(diào)控食管癌的增殖、遷移Western blot結(jié)果如圖4所示,與空白對(duì)照組相比,P.gingivalis-Exo處理組的食管癌細(xì)胞TGF-β1、Smad2蛋白表達(dá)呈上升趨勢(shì),這表明P.gingivalis-Exo對(duì)食管癌細(xì)胞惡性行為的調(diào)控可能與TGF-β1/Smad2通路有關(guān)。

    3 討論

    P.gingivalis是口腔關(guān)鍵致病菌之一,其含量異常增加能夠?qū)е驴谇晃⑸鷳B(tài)失衡[6]。口腔微生態(tài)失衡不僅能夠引起口腔部分組織破壞,還能夠通過異常免疫反應(yīng)損傷遠(yuǎn)處組織,造成人體多種疾病的發(fā)生和發(fā)展,如慢性牙周炎、呼吸系統(tǒng)疾病、心血管疾病、糖尿病及多種腫瘤等[20-21]。最近的研究表明,P.gingivalis與食管癌的發(fā)生有著密切的關(guān)系[22]。牙齦卟啉單胞菌存在于61%的食管鱗狀細(xì)胞癌組織中,其在癌旁組織中只有12%的患者能夠被檢測(cè),但在正常人的食管組織中尚未發(fā)現(xiàn)[13]。這說明P.gingivalis在食管癌發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色。然而,目前對(duì)P.gingivalis促進(jìn)食管癌發(fā)生發(fā)展確切的分子機(jī)制尚不清楚。

    A:MTT實(shí)驗(yàn);B:細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn);C:細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)。①P<0.05;②P<0.01。圖3 P. gingivalis-Exo對(duì)食管癌惡性生物學(xué)行為的影響

    圖4 P. gingivalis-Exo通過TGF-β1/Smad2通路調(diào)控食管癌的增殖、遷移

    腫瘤-微環(huán)境在腫瘤進(jìn)展、轉(zhuǎn)移和治療耐藥中發(fā)揮重要作用。外泌體是一種能被大多數(shù)細(xì)胞分泌的直徑大約為30~150 nm的具有脂質(zhì)雙層膜的微小膜泡。它在體內(nèi)的傳遞具有廣泛性,是細(xì)胞與細(xì)胞間通訊的重要分子,能夠攜帶RNA、DNA、蛋白質(zhì)以及其他信號(hào)分子參與細(xì)胞間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。有研究表明,結(jié)核桿菌分泌的外泌體能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞釋放的促炎因子TNF-α、IL-10、IL-6表達(dá)上升,從而影響巨噬細(xì)胞的免疫功能[23]。在2017年,Jessica探究了P.gingivalis-OMV在炎性免疫細(xì)胞中的作用,發(fā)現(xiàn)P.gingivalis-OMV在體內(nèi)可以募集免疫細(xì)胞,引發(fā)巨噬細(xì)胞中的TNFα、IL-1β和IL-8分泌,從而產(chǎn)生更強(qiáng)的免疫反應(yīng),導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生[24]。本研究通過電鏡、粒徑等物理表征證明成功提取了牙齦卟啉單胞菌來源的外泌體,粒徑約為130 nm,形狀如典型的外泌體“圓碟”狀,這兩種儀器測(cè)得的粒徑差異可能是由于納米粒度儀測(cè)的是外泌體納米粒的水動(dòng)力直徑,略大于電鏡的結(jié)果。采用共聚焦顯微鏡觀察到了DIR標(biāo)記的外泌體可以進(jìn)入細(xì)胞并通過MTT、Transwell、劃痕等體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了P.gingivalis-Exo對(duì)食管癌細(xì)胞的增殖、遷移具有顯著的促進(jìn)作用。

    轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β (TGF-β) 信號(hào)通路在生物體和胚胎發(fā)育過程中起著至關(guān)重要的作用。它們協(xié)調(diào)著許多細(xì)胞過程,包括細(xì)胞增殖、分化、遷移和侵襲等[25-26]。大量的文獻(xiàn)報(bào)道了TGF-β與腫瘤的發(fā)生進(jìn)展有一定的關(guān)系,可以促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[27-29]。其中TGF-β1/Smad信號(hào)通路是TGF發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的主要通路。Smads蛋白是目前所知的唯一的TGF-β受體的胞內(nèi)激酶底物。研究已經(jīng)證實(shí)Smad2是TGF-β/Smads通路中一個(gè)關(guān)鍵的分子[30-31]。為了進(jìn)一步探究P.gingivalis-Exo對(duì)食管癌的作用機(jī)制,通過Western Blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),與空白對(duì)照組相比,P.gingivalis-Exo處理后TGF-β1、Smad2蛋白表達(dá)明顯上升,這說明P.gingivalis-Exo可能通過調(diào)控TGF-β1/Smad2通路來促進(jìn)食管癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。

    綜上所述,本文首次以P.gingivalis-Exo為對(duì)象,探討了P.gingivalis-Exo對(duì)食管癌細(xì)胞惡性行為的調(diào)控。通過MTT、Transwell、劃痕和Western blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了P.gingivalis-Exo在體外促進(jìn)食管癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲,并初步探究了P.gingivalis-Exo對(duì)食管癌的影響機(jī)制,這些發(fā)現(xiàn)為治療食管癌提供了一個(gè)新的思路,但是P.gingivalis-Exo對(duì)食管癌調(diào)控的具體分子機(jī)制還有待深入研究。

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