運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)對(duì)急性低壓低氧大鼠腦海馬線粒體生物合成的影響

劉 靜，張紅英，薄 海，康偉民

高海拔地區(qū)低氧暴露導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙，表現(xiàn)為反射活動(dòng)、學(xué)習(xí)能力、注意力、記憶力等認(rèn)知能力下降，是高原環(huán)境人體作業(yè)能力低下的重要因素之一。探尋低氧損害認(rèn)知能力的機(jī)制及干預(yù)措施是高原醫(yī)學(xué)重要研究課題[1]。腦海馬是負(fù)責(zé)處理學(xué)習(xí)與長(zhǎng)期記憶的大腦區(qū)域，血液供應(yīng)和線粒體較豐富，其功能依賴于線粒體有氧氧化能力。研究表明，低氧導(dǎo)致腦海馬線粒體呼吸鏈復(fù)合體活性及呼吸速率降低[2]，提示線粒體是提高腦海馬低氧耐受能力的關(guān)鍵靶位。將健康線粒體含量保持在一定水平是細(xì)胞應(yīng)對(duì)應(yīng)激的重要基礎(chǔ)，這個(gè)過(guò)程由調(diào)控線粒體新生的線粒體生物合成完成[3]。筆者前期在人體試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，平原運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)可明顯上調(diào)急進(jìn)高原后淋巴細(xì)胞線粒體自噬，改善線粒體呼吸鏈復(fù)合體活性[4]。本研究旨在探討常氧環(huán)境中運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)是否能改善急性低氧暴露對(duì)腦海馬線粒體生物合成的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 選取3月齡清潔級(jí)Sprague-Dawley大鼠24只，雄性，體重(215.39±18.66)g，由北京華阜康生物股份公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCKK(京)2015-0005，常規(guī)進(jìn)食水，人工光照12 h/d，室內(nèi)溫度(25±1)℃。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d后，隨機(jī)分為3組：對(duì)照組、急性低氧組(acute hypoxia group, AH)和運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)+急性低氧組(exercise preconditioning+ acute hypoxia group，EP+AH)，每組8只。EP+AH組大鼠在常氧環(huán)境中進(jìn)行6周動(dòng)物跑臺(tái)訓(xùn)練，坡度5°, 速度17 m/min，持續(xù)60 min，每日上午8:00～9:00訓(xùn)練一次，5次/周。末次運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后24 h，AH組和EP+AH組大鼠置于低壓低氧艙8 h，艙內(nèi)壓力0.06 MPa(模擬海拔7000 m氣壓)，氣流量0.10 m3/h，氧含量維持于10%±2%。大鼠出低氧艙后即刻處死，冰面分離雙側(cè)腦海馬，一側(cè)用于提取線粒體，另一側(cè)制備腦海馬組織勻漿，-80 ℃凍存待測(cè)。

1.3 腦海馬線粒體膜電位測(cè)定 腦海馬線粒體純化參照文獻(xiàn)[5]要求進(jìn)行。差速離心法提取腦海馬線粒體，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定樣品蛋白濃度。采用JC-1熒光探針標(biāo)記法檢測(cè)線粒體膜電位，嚴(yán)格按照線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司)說(shuō)明書操作，熒光分光光度計(jì)檢測(cè)。

1.4 腦海馬線粒體活性氧(ROS)生成速率測(cè)定 二氯熒光素雙醋酸鹽(DCFH-DA, Sigma)標(biāo)記線粒體ROS，熒光分光光度計(jì)連續(xù)監(jiān)測(cè)熒光強(qiáng)度變化(激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)設(shè)定488 nm/525 nm)，計(jì)算熒光強(qiáng)度變化速率。

1.5 腦海馬線粒體ATP合成活力測(cè)定 采用熒光素-熒光素酶發(fā)光法檢測(cè)線粒體ATP合成活力，在工作液中順序加入0.10 mg線粒體和40 μmol/L熒光素酶(Sigma)，繼而加入5 μM ADP啟動(dòng)反應(yīng)，記錄發(fā)光強(qiáng)度變化曲線。

1.6 腦海馬線粒體DNA(mtDNA)拷貝數(shù)測(cè)定 嚴(yán)格按照DNA提取試劑盒(Biovision)說(shuō)明書純化細(xì)胞總DNA。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)核基因18s rRNA和線粒體基因CytB的含量。引物序列：18s rRNA上游，5′-GGACCTGGAACTGGCAACAT-3′；下游：5′-GCCCTGAACTCTTTTGTGAAG-3′。CytB上游，5′-CGGCTGACTAATCCGATACC-3′；下游，5′-TGGGAGTACATAGCCCATGA-3′。將CytB與18s rRNA含量比值表示為mtDNA相對(duì)拷貝數(shù)。

1.7 腦海馬相關(guān)蛋白表達(dá)測(cè)定 Western blot法測(cè)定各組腦海馬PGC-1α、NRF1和Tfam蛋白表達(dá)，β-actin作為內(nèi)參標(biāo)記蛋白。SDS-PAGE電泳分離蛋白，對(duì)應(yīng)一抗標(biāo)記，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗結(jié)合后ECL顯色液顯影，X射線曝光記錄，掃描各條帶灰度值。NC組條帶灰度值定義為100%，AH組和EP+AH組灰度值表示為與NC組比較的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠腦海馬mtDNA拷貝數(shù)、線粒體膜電位、ROS產(chǎn)生速率和ATP合成活力比較 與對(duì)照組比較，AH組腦海馬mtDNA拷貝數(shù)和線粒體ROS產(chǎn)生速率均升高(P<0.05)，線粒體膜電位和ATP合成活力均降低(P<0.01)，EP+AH組線粒體ATP合成活力降低(P<0.05)。與AH組比較，EP+AH組腦海馬mtDNA拷貝數(shù)和線粒體ROS產(chǎn)生速率均降低(P<0.05)，線粒體膜電位和ATP合成活力均升高(P<0.05，表1)。

2.2 各組大鼠腦海馬過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α(PGC-1α)、核呼吸因子(NRF1)和Tfam蛋白表達(dá)的變化 與NC組比較，AH組腦海馬PGC-1α、NRF1和Tfam蛋白表達(dá)均升高(P<0.05)，EP+AH組PGC-1α和NRF1蛋白表達(dá)均升高(P<0.05)。與AH組比較，EP+AH組腦海馬PGC-1α、NRF1和Tfam蛋白表達(dá)均降低(P<0.05，表2)。

表1 急性低氧和運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)對(duì)大鼠腦海馬mtDNA拷貝數(shù)、線粒體膜電位、ROS產(chǎn)生速率和ATP合成活力的影響

注：與NC組比較，①P<0.05；與NC組比較，②P<0.01； 與AH組比較，③P<0.05

表2 各組大鼠腦海馬線粒體生物合成相關(guān)蛋白表達(dá)的變化

注：與NC組比較，①P<0.05；與NC組比較，②P<0.01；與AH組比較，③P<0.05

3 討 論

線粒體蛋白是由細(xì)胞核DNA和線粒體DNA共同編碼的，mtDNA拷貝數(shù)是線粒體數(shù)量標(biāo)志。三羧酸循環(huán)產(chǎn)生的質(zhì)子在經(jīng)過(guò)線粒體呼吸鏈傳遞時(shí)形成膜電位，后者通過(guò)復(fù)合體Ⅴ轉(zhuǎn)化為ATP，因而膜電位是線粒體健康水平金標(biāo)準(zhǔn)[6]。本研究中，急性低壓低氧暴露導(dǎo)致腦海馬mtDNA拷貝數(shù)顯著增加，但同時(shí)線粒體膜電位明顯降低。低氧狀態(tài)下，線粒體呼吸鏈上傳遞的電子多于末端氧原子，造成活性氧產(chǎn)生增多[7]。mtDNA靠近ROS產(chǎn)生位點(diǎn)，且缺乏組蛋白保護(hù)，極易受到攻擊。在衰老肝臟細(xì)胞中證明，mtDNA突變導(dǎo)致其編碼的呼吸鏈復(fù)合體亞基異常，線粒體膜電位降低，ATP供應(yīng)減少反饋性誘導(dǎo)線粒體生物合成，受損mtDNA復(fù)制增加，進(jìn)一步促進(jìn)ROS產(chǎn)生，形成惡性循環(huán)[8]。因而，異常線粒體增加是急性低氧損傷的病理機(jī)制之一。

PGC-1α是線粒體生物合成關(guān)鍵控制因子，通過(guò)上調(diào)NRF1和Tfam轉(zhuǎn)錄表達(dá)，協(xié)同調(diào)控細(xì)胞核DNA和mtDNA編碼線粒體蛋白的表達(dá)，促進(jìn)線粒體新生[9]。本研究中，急性低壓低氧暴露導(dǎo)致腦海馬PGC-1α及其下游NRF1和Tfam表達(dá)量降低，這與mtDNA變化趨勢(shì)一致。在腦皮質(zhì)缺血大鼠模型中證明，AMP/ATP比值降低活化單磷酸腺苷依賴性蛋白激酶(AMPK)，后者可增加PGC-1α轉(zhuǎn)錄活性[10]。此外，本研究表明ROS可激活絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)，進(jìn)而磷酸化修飾轉(zhuǎn)錄激活因子 2(ATF2)，后者結(jié)合PGC-1α啟動(dòng)子促進(jìn)其表達(dá)[11]。本研究中，急性低氧暴露導(dǎo)致線粒體ROS產(chǎn)生速率升高，ATP合成活力降低，這可能啟動(dòng)了PGC-1α介導(dǎo)的線粒體生物合成。

本研究中，常氧環(huán)境運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)顯著抑制了急性低壓低氧對(duì)線粒體生物合成的上調(diào)效應(yīng)，同時(shí)線粒體膜電位和ATP合成活力顯著升高，而ROS產(chǎn)生速率明顯降低。筆者前期在人體實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，移居高原3 d淋巴細(xì)胞mtDNA拷貝數(shù)升高，但mtDNA中氧化修飾堿基含量增加，而移居高原90 d淋巴細(xì)胞mtDNA拷貝數(shù)低于平原階段，同時(shí)mtDNA氧化損傷減少[12]。提示線粒體數(shù)量減少但質(zhì)量提高是低氧習(xí)服的標(biāo)志之一。研究表明，耐力運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可促進(jìn)腦海馬線粒體空間結(jié)構(gòu)趨向于融合，抗氧化酶水平升高，線粒體自噬增加[13]。Zhang等[14]也報(bào)道，運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)可提高腦皮質(zhì)抵抗缺血損傷的能力。我們推測(cè)，運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)提供了線粒體修復(fù)能力和異常線粒體清除能力，單個(gè)線粒體健康水平和供能能力提高，足以匹配能量需求，因而無(wú)需提高線粒體數(shù)量進(jìn)行代償，這也是一種生物節(jié)省化的表現(xiàn)。

綜上所述，運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)可抑制急性低壓低氧對(duì)線粒體生物合成的上調(diào)效應(yīng)，同時(shí)改善線粒體能量代謝能力，抑制氧化應(yīng)激，提高腦海馬對(duì)急性低氧暴露的抵抗力。