紅細胞膜電位的光學(xué)測定方法

高文杰 朱自嚴上海市血液中心 200051

細胞膜電位(membrane potential)是指以細胞膜相隔的細胞質(zhì)和細胞外液之間產(chǎn)生的電位差。通常認為這種跨膜電位主要來源于離子不對稱性所致的擴散電位，而這種離子不對稱性是通過主動泵以及不相同的離子通透性造成的。紅細胞膜電位對維持紅細胞正常的生理活動起著重要的作用，紅細胞的膜電位隨著年齡的增大其絕對值逐漸減小，許多疾病也反映在紅細胞膜電位的變化上，例如瘧原蟲感染的紅細胞膜電位絕對值比正常紅細胞要增加2～3倍，因此膜電位的相關(guān)研究具有重大意義，所有這些研究都涉及1個如何測定膜電位的問題。測定細胞膜電位最常用的方法是利用微電極或者膜片鉗技術(shù)直接進行測量，但是用膜片鉗測量如此微小紅細胞的跨膜電位是有一定困難的，而且這種方法費時費力，成本較高，不利于對紅細胞膜電位及其變化做出快速的檢測，現(xiàn)在越來越多的人用熒光光學(xué)技術(shù)測量紅細胞膜電位。iBAC4(3)為最常用的膜電位熒光染料，它是1種帶負電荷的陰離子慢反應(yīng)染料。該染料本身無熒光，當其進入細胞與胞漿內(nèi)的蛋白質(zhì)結(jié)合后才發(fā)出熒光，由于染料Di-BAC4(3)是一價的負離子，它在質(zhì)膜2側(cè)按照細胞膜電位分布，服從能斯特方程，膜電位可由下面的方程式估算:V=Edye=(其中V表示跨膜電位，R為氣體常數(shù)、T為絕對溫度、F為法拉第常數(shù)、Ci和Ce分別表示細胞內(nèi)和細胞外的染料濃度)。流式細胞儀測得細胞內(nèi)的熒光強度，同細胞吸收的染料的量成線性關(guān)系，由于紅細胞大小體積相當，所以細胞內(nèi)的熒光強度Fi與細胞內(nèi)染料的濃度Ci成線性關(guān)系。同時被紅細胞吸收的熒光染料相對紅懸液中的染料來說可以忽略不計，即紅細胞吸收染料后紅懸液中的Ce保持不變。Ce對應(yīng)的熒光強度Fe，可以通過固定細胞使其去極化從而使細胞內(nèi)外染料濃度相同，即Ce=Ci，對其進行流式細胞儀的測定。因此細胞膜電位計算公式又可以表示為:V=Edye=。由此通過熒光強度Fi和Fe可以定量的推算出任意Ce溶液的細胞內(nèi)的Ci，進而求細胞的膜電位V。我們由此方法測得紅細胞膜電位為(-9±0.8)mv，很好的對應(yīng)了膜片鉗的測定結(jié)果，而且這種方法的靈敏度很高，一般細胞膜電位改變1 mv則對應(yīng)的熒光值改變10%左右。此外，我們還對一些動物的紅細胞進行了測定結(jié)果如下:比格犬(-9.45 mv)、食蟹猴(-9.99 mv)、亞洲黑熊(-12.27 mv)、C57小鼠(-12.31 mv)。用熒光光學(xué)技術(shù)測量紅細胞膜電位也有一定的缺點，即只能測定一定數(shù)量的細胞膜電位的平均值，不能測定單個細胞的膜電位。