黃芪湯對腎臟集合管細(xì)胞ENaC活性的影響作用研究

陳駿良 王利 臧贏君 王浩

摘 要 目的：研究黃芪湯對腎集合管上皮鈉離子通道（ENaC）活性的影響，探索其治療腎病綜合征（NS）水腫的藥理機(jī)制。方法：將體外培養(yǎng)的小鼠腎集合管M-1細(xì)胞分為空白對照組、黃芪湯組和阿米洛利組，分別予純化的纖溶酶刺激后，以膜片鉗測定其膜電流變化。結(jié)果：纖溶酶刺激后，空白對照組的膜電流顯著增強(qiáng)（P<0.001），黃芪湯組和阿米洛利組的膜電流雖也有升高趨勢，但幅度均未達(dá)統(tǒng)計學(xué)顯著水平（P>0.05）。該兩組的膜電流增幅間無顯著差異（P>0.05），但均顯著低于空白對照組（P<0.05）。結(jié)論：黃芪湯可抑制腎集合管細(xì)胞的ENaC活性，該方治療NS水腫的藥理機(jī)制可能與此有關(guān)。

關(guān)鍵詞 黃芪湯 上皮鈉離子通道 膜片鉗

中圖分類號：R289.5； R256.51 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1006-1533（2019）03-0034-04

Study on the effect of Huangqi decoction on ENaC activity in renal collecting duct cell*

CHEN Junliang**， WANG Li， ZANG Yingjun， WANG Hao（Department of Nephrology， Putuo Hospital， Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai 200062， China）

ABSTRACT Objective： To investigate the effect of Huangqi decoction on epithelial sodium channel （ENaC） activity in renal collecting duct cell， and to explore the pharmacological mechanism of Huangqi decoction in ameliorating nephrotic edema. Methods： The cultured M-1 mouse collecting duct cells were divided into a blank control group， a Huangqi decoction group and an amiloride group. The changes of their membrane current intensity were measured by patch clamp after stimulation by purified plasmin. Results： After plasmin stimulation， the cell membrane current intensity increased significantly in the blank control group （P<0.001） and increased in the Huangqi decoction group and the amiloride group， however their changes did not reach statistically significant level in the latter two groups （P>0.05）. There were no significant differences in the increase of cell membrane current between the Huangqi decoction group and the amiloride group （P>0.05）， but they both were significantly lower than that of the blank control group （P<0.05）. Conclusion： Huangqi decoction can inhibit ENaC activity in renal collecting duct cell， which may be related to its pharmacological mechanism in ameliorating nephrotic edema.

KEy WORDS Huangqi decoction； epithelial sodium channel （ENaC）； patch clamp

水腫是腎病綜合征（nephrotic syndrome， NS）的常見臨床表現(xiàn)，嚴(yán)重時可危及生命。傳統(tǒng)觀點多用“低灌注假說”來解釋其發(fā)病機(jī)制：大量蛋白尿引起低蛋白血癥，導(dǎo)致血漿膠體滲透壓下降，組織間隙發(fā)生水腫[1]。但在臨床實踐中，人們發(fā)現(xiàn)許多現(xiàn)象往往與該假說相悖[2-3]，故進(jìn)一步深入探索并發(fā)現(xiàn)了NS水腫的新型發(fā)病機(jī)制：NS時蛋白尿可通過腎內(nèi)原發(fā)機(jī)制引起鈉潴留，導(dǎo)致有效血容量增加和水腫形成，其核心環(huán)節(jié)是腎臟集合管頂膜側(cè)的上皮鈉離子通道（epithelial sodium channel， ENaC）激活[4-5]。ENaC由α、β、γ三亞基組成，其中γ亞基含有纖溶酶的剪切位點，負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)通道開閉[6]。NS發(fā)病時腎小球濾過膜受損，纖溶酶的前體纖溶酶原可自血循環(huán)異常濾過進(jìn)入原尿，轉(zhuǎn)化為纖溶酶并通過蛋白剪切作用去除ENaC γ亞基上的抑制性肽段，從而大幅提高通道的開放率，促進(jìn)鈉離子重吸收，導(dǎo)致水鈉潴留和水腫形成[7-8]。

黃芪湯始載于北宋楊士嬴的《仁齋直指方論》卷十七，方中黃芪益氣固表、利水消腫；茯苓利水滲濕、健脾和胃；麥門冬滋陰生津、清心除煩；五味子收斂固澀、補(bǔ)腎寧心；生地黃清熱生津、滋陰養(yǎng)血；瓜蔞根清熱潤肺、消腫排膿；炙甘草益氣補(bǔ)中、調(diào)和諸藥。諸藥合而成方，有益氣扶正之功，又兼具養(yǎng)陰之效，可治“消渴”，是臨床上治療糖尿病腎病的良方。我們在臨床實踐中發(fā)現(xiàn)，黃芪湯對于NS水腫也具有良好的治療效果，但其現(xiàn)代藥理學(xué)機(jī)制尚不明確。本研究基于體外細(xì)胞實驗，研究黃芪湯對ENaC活性的干預(yù)作用，以初步探索其利水作用的藥理機(jī)制，為改善NS水腫的臨床療效提供研究基礎(chǔ)和啟示。

1 對象與方法

1.1 研究對象和分組

選用M-1細(xì)胞（小鼠腎皮質(zhì)集合管上皮細(xì)胞，購自美國菌種保藏中心ATCC）作為研究對象，培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2環(huán)境下含有5%胎牛血清和5 mmol/L 地塞米松的DMEM：F12中。將M-1細(xì)胞分為空白對照組、黃芪湯組和阿米洛利陽性對照組，其中阿米洛利是ENaC的特異性抑制劑。開始檢測前，用胰蛋白酶分離M-1細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至含有5 mmol/L 地塞米松的DMEM：F12中，在37 ℃、5% CO2環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)，其中黃芪湯組予1 000 mg/ml黃芪湯提取物預(yù)孵，阿米洛利組予2 μmol/L 阿米洛利（英國Abcam公司）預(yù)孵，24 h后開始檢測。三組細(xì)胞分別給予純化的纖溶酶（美國Sigma公司）刺激后，采用膜片鉗技術(shù)測定其膜電流強(qiáng)度變化。

1.2 含黃芪湯培養(yǎng)基的制備

黃芪湯方劑組成（kg）：黃芪2、茯苓2、麥門冬2、五味子1、生地黃3、瓜蔞根2和炙甘草1，共計13 kg。加4倍量水，熱回流提取2 h后過濾，擠干濾渣內(nèi)水分，再重復(fù)上述提取、過濾流程2次。合并總共3次所得提取液，減壓濃縮為稠浸膏，以95%乙醇調(diào)節(jié)含醇量為70%，靜置過夜。吸取上清液，置于減壓干燥箱中，105℃下減壓干燥48 h，得干粉提取物。每克提取物相當(dāng)于7.5 g處方量。稱取適量黃芪湯干粉提取物，經(jīng)渦旋、超聲、水浴等方法使其充分溶解于前述培養(yǎng)基中，經(jīng)0.22 mm濾器過濾并配制成1 000 mg/ml的溶液。

1.3 膜片鉗實驗方法

細(xì)胞內(nèi)液組成：135 mmol/L 谷氨酸鉀，10 mmol/L 氯化鉀，10 mmol/L 氯化鈉，1 mmol/L氯化鎂，10 mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES），0.3 mmol/L 三磷酸鳥苷鈉， 0.5 mmol/L 三磷酸腺苷鎂，2 mmol/L 乙二醇二乙醚二胺四乙酸（EGTA）。

細(xì)胞外液組成：10 mmol/L HEPES-氫氧化鈉，140 mmol/L 氯化鈉，2.8 mmol/L氯化鉀，1 mmol/L 氯化鎂，2 mmol/L 氯化鈣，11 mmol/L 葡萄糖，10 mmol/L 蔗糖。

在室溫下進(jìn)行檢測，采用全細(xì)胞記錄模式。拉制、拋光微玻管電極。低通濾波頻率設(shè)為2.9 kHz，采樣頻率設(shè)為20 kHz。鉗制電位設(shè)為–60 mV，鉗制時間設(shè)為200 ms，由–60 mV向–150 mV給予10 mV步階電壓的脈沖刺激，頻率為1次/s，記錄–150 mV時的細(xì)胞膜電流。經(jīng)軟件處理，計算細(xì)胞膜電流強(qiáng)度的變化。

用給藥系統(tǒng)將10 μg/ml 纖溶酶緩慢加入至待測M-1細(xì)胞附近的細(xì)胞外液中，30～60 s后重復(fù)檢測細(xì)胞膜電流，從而計算纖溶酶對M-1細(xì)胞膜電流強(qiáng)度的影響。每項測定均取3個不同的細(xì)胞重復(fù)進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

使用PASW Statistics 18.0（IBM，美國）軟件。計量資料中符合正態(tài)分布的使用獨立樣本t檢驗，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示結(jié)果；不符合正態(tài)分布的使用獨立樣本非參數(shù)檢驗，用中位數(shù)（下限，上限）表示結(jié)果。P<0.05時認(rèn)為差異達(dá)到統(tǒng)計學(xué)顯著水平。

2 結(jié)果

采用全細(xì)胞記錄模式對M-1細(xì)胞的膜電流強(qiáng)度進(jìn)行測定。在基線狀態(tài)下，M-1細(xì)胞膜上可測得內(nèi)向電流，予纖溶酶刺激后，膜電流強(qiáng)度明顯升高。若予黃芪湯或阿米洛利預(yù)孵后再予纖溶酶刺激，其膜電流強(qiáng)度也有小幅增加，但均較預(yù)孵前明顯減弱（圖1）。

分別檢測空白對照組、黃芪湯組和阿米洛利陽性對照組的M-1細(xì)胞在加入纖溶酶前、后的膜電流強(qiáng)度，并計算其增幅大小。結(jié)果顯示，予纖溶酶刺激后，空白對照組的膜電流強(qiáng)度顯著升高（P<0.001），而黃芪湯組和阿米洛利陽性對照組的膜電流雖也有升高趨勢，但其強(qiáng)度變化均未達(dá)統(tǒng)計學(xué)顯著水平（P>0.05）。黃芪湯組和阿米洛利陽性對照組的膜電流增幅間無顯著差異（P>0.05），但均顯著低于空白對照組（P<0.05）（表1，圖2）。

3 討論

中醫(yī)理論認(rèn)為水腫的形成與正氣不足、氣水失運(yùn)有關(guān)?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》曰“氣為血帥，血為氣母，氣行則血行，氣滯則血瘀”；《金匱要略》曰“血不利則為水”。若正氣不足，氣運(yùn)失調(diào)，則水液氣化不利，再加諸外邪因素，可致水液潴留，泛溢肌膚，從而形成水腫[9]。在水腫的治法上，張景岳認(rèn)為“凡治腫者，必先治水，治水者必先治氣”。臨床上以益氣扶正為治法，氣行則水行，水腫自消，是中醫(yī)治療水腫的重要原則和方法。本研究中的黃芪湯具有益氣扶正之功，又兼具養(yǎng)陰之效，可生精化氣，氣行則水行，故有利水消腫之效。其治療NS水腫的作用符合中醫(yī)理論的相關(guān)認(rèn)知，值得進(jìn)一步深入研究以探索其現(xiàn)代藥理學(xué)作用機(jī)制。

本研究顯示，纖溶酶刺激M-1細(xì)胞后其膜電流強(qiáng)度可顯著增強(qiáng)，而若予阿米洛利預(yù)孵后再予纖溶酶刺激，膜電流強(qiáng)度則較預(yù)孵前明顯減弱，說明纖溶酶刺激M-1細(xì)胞所產(chǎn)生的膜電流可被阿米洛利——ENaC的特異性阻斷劑所抑制，證實了該膜電流主要來源于ENaC，纖溶酶對腎臟集合管細(xì)胞ENaC具有激活作用，與既往的研究結(jié)果相符[4，7]。M-1細(xì)胞予黃芪湯預(yù)孵后再予纖溶酶刺激，膜電流強(qiáng)度同樣較預(yù)孵前大幅下降，說明黃芪湯可顯著減弱纖溶酶對ENaC電流的刺激效應(yīng)，其作用強(qiáng)度與陽性對照藥物阿米洛利相類似，提示黃芪湯具有對ENaC活性的強(qiáng)效抑制作用。ENaC受抑后腎臟集合管重吸收鈉離子減少，可減輕水鈉潴留，促進(jìn)NS水腫消退，這可能是該方利水消腫作用的現(xiàn)代藥理學(xué)機(jī)制所在。

關(guān)于黃芪湯抑制ENaC的具體內(nèi)在機(jī)制，既往研究顯示其成分之一茯苓可抑制腎臟集合管ENaC的表達(dá)水平，使NS大鼠的腹水量減少[10]，但黃芪湯整體方劑的作用機(jī)制目前尚未完全明確。ENaC的活性取決于其在腎臟集合管頂膜上的表達(dá)量和開放率。研究發(fā)現(xiàn)，ENaC的膜表達(dá)量與泛素通路和網(wǎng)格蛋白（clathrin）依賴性內(nèi)吞通路有關(guān)[11]。腎臟集合管細(xì)胞中的泛素連接酶Nedd4-2可與ENaC各亞基的PPxY模體特異性結(jié)合，使ENaC發(fā)生泛素化并轉(zhuǎn)入clathrin依賴性內(nèi)吞通路，在clathrin的介導(dǎo)下形成內(nèi)體囊泡，并最終轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體內(nèi)降解，從而下調(diào)其膜表達(dá)量[12]。在這一過程中，Epsin蛋白和磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸（PIP2）是聯(lián)系泛素通路和clathrin依賴性內(nèi)吞通路的核心“橋梁”因子，其中PIP2還可直接結(jié)合ENaC從而影響通道開閉，對ENaC的表達(dá)量和開放率均具有調(diào)控作用。

進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，上述調(diào)控機(jī)制的上游影響因子是腺苷酸激活蛋白激酶（AMP-activated protein kinase， AMPK）。AMPK可使Nedd4-2發(fā)生磷酸化，增強(qiáng)其與ENaC間的結(jié)合作用，促使ENaC發(fā)生泛素化并經(jīng)Epsin、PIP2承接轉(zhuǎn)入內(nèi)吞降解通路，導(dǎo)致其膜表達(dá)量下降。同時AMPK也可干擾ENaC和PIP2間的結(jié)合作用，從而直接下調(diào)ENaC的開放率[13-14]。由此形成了AMPK-泛素-PIP2/clathrin通路，是引起ENaC活性下降的重要調(diào)控機(jī)制。

本科室研究團(tuán)隊的前期研究發(fā)現(xiàn)，黃芪湯可激活A(yù)MPK[15]。由此推測，黃芪湯可通過激活A(yù)MPK-泛素-PIP2/clathrin通路以下調(diào)腎臟集合管ENaC的表達(dá)量和開放率，這可能是黃芪湯抑制ENaC活性的藥理機(jī)制所在（圖3），但尚須進(jìn)一步深入研究以資明確。

本研究以膜片鉗（全細(xì)胞模式）測定了黃芪湯對腎臟集合管細(xì)胞ENaC總體活性的影響，后續(xù)研究將進(jìn)一步采用Western Blot、PCR及免疫熒光測定ENaC的表達(dá)分布情況，并采用膜片鉗（外面向外模式）檢測ENaC的開放率，以進(jìn)一步探索黃芪湯影響ENaC活性的具體機(jī)制。

綜上所述，本研究基于體外細(xì)胞實驗，發(fā)現(xiàn)黃芪湯具有對腎臟集合管細(xì)胞ENaC活性的強(qiáng)效抑制作用，提示該方利水作用的現(xiàn)代藥理學(xué)機(jī)制可能與此有關(guān)，為臨床上應(yīng)用黃芪湯治療NS水腫提供了一定的研究基礎(chǔ)和啟示。

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