超高壓(等靜水壓)滅活血漿病毒的研究

周錫鵬 賈培起 馬平 呂麗萍 閆舫 張艷宇 肖軍 鄧江 康瓊 許金波(.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院野戰(zhàn)輸血研究所，北京 00850;.天津華泰森淼生物工程技術(shù)有限公司)

輸血有感染病毒性疾病的風(fēng)險(xiǎn)，雖然血液篩查方法的不斷改進(jìn)大大降低了病毒經(jīng)輸血傳播的幾率，但由于病毒傳播“窗口期”和檢測(cè)試劑靈敏度的限制，血液輸注仍無法保證“零風(fēng)險(xiǎn)”。通過病毒滅活可降低輸血風(fēng)險(xiǎn)。目前技術(shù)成熟應(yīng)用較多的是亞甲藍(lán)光化學(xué)方法。其他一些方法還處在實(shí)驗(yàn)室研究階段。自1895年Rogar等首次報(bào)道了超高壓可以殺死微生物以來，有關(guān)應(yīng)用超高壓技術(shù)的研究報(bào)道在國外陸續(xù)出現(xiàn)。超高壓技術(shù)作為1種有效的滅菌消毒的物理手段已成功地應(yīng)用于食品加工及生物工程的多個(gè)領(lǐng)域［1，2］。近年來，時(shí)有超高壓技術(shù)滅活病毒的報(bào)道。但主要是圍繞滅活病毒與對(duì)其免疫原性影響的研究，未見該病毒滅活技術(shù)在血液病毒滅活方面的報(bào)道。我們就超高壓技術(shù)按“血液制品去除/滅活病毒技術(shù)方法及驗(yàn)證指導(dǎo)原則”的要求，對(duì)滅活血漿中模型病毒的滅活條件及滅活效果進(jìn)行探索性研究。

1 材料與方法

1.1 儀器 超高壓試驗(yàn)機(jī)，由天津市華泰森淼生物工程技術(shù)有限公司與軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院野戰(zhàn)輸血研究所聯(lián)合研制。凈化工作臺(tái)、高壓滅菌器、干熱滅菌器、CO2恒溫培養(yǎng)箱、細(xì)菌濾器、離心機(jī)、微型震蕩器、微量移液器、96孔微量培養(yǎng)板、倒置生物顯微鏡、日立電子顯微鏡等。

1.2 病毒與細(xì)胞株 偽狂犬病毒(PRV)和辛德畢斯(Sindbis)病毒，為“血液制品去除/滅活病毒技術(shù)方法及驗(yàn)證指導(dǎo)原則”中規(guī)定的HBV和HCV的指示病毒，水泡性口炎病毒(VSV)為常用的包膜病毒的指示病毒，脊髓灰質(zhì)炎病毒(PV1)為HAV的指示病毒，豬細(xì)小病毒(PPV)為B19的指示病毒。細(xì)胞株為Vero、BHK21和PK-15細(xì)胞。病毒的毒種均是從中國藥品生物制品檢定所和中國獸藥監(jiān)察所引入，本實(shí)驗(yàn)室傳代擴(kuò)增。

1.3 方法 取正常人血漿按10%的比例分別加入PRV、PRV、VSV、PV1、PPV等指示病毒混勻，留出對(duì)照樣品。將含病毒血漿裝入小型血漿袋中20 mL/袋，排盡氣泡，用熱合機(jī)封口。分別放進(jìn)超高壓試驗(yàn)機(jī)的樣品倉中，以不同的壓力和不同的時(shí)間處理樣品。處理后的樣品和未經(jīng)超高壓處理的對(duì)照樣按10倍系列稀釋，分別加入已接種病毒敏感細(xì)胞的96孔微量培養(yǎng)板中，100 μL/孔，每個(gè)樣品做8個(gè)復(fù)孔，置5%CO2孵箱中孵育72 h，顯微鏡下觀察并記錄各孔細(xì)胞病變(CPE)情況。病毒滴度按Karber氏方法計(jì)算。

2 結(jié)果

2.1 600 Mpa處理不同時(shí)間對(duì) PRV、VSV、Sindbis、PV1、PPV病毒的滅活效果 見表1，2。

表1 600Mpa處理不同時(shí)間對(duì)PRV、VSV、Sindbis病毒的滅活效果

表2 600Mpa處理不同時(shí)間對(duì)PV1、PPV的無包膜病毒的滅活效果

2.2 500Mpa處理不同時(shí)間對(duì)PRV、VSV、Sindbis病毒的滅活效果 見表3。

2.3 400Mpa處理不同時(shí)間對(duì)PRV、VSV、Sindbis病毒的滅活效果 見表4。

2.4 350Mpa處理不同時(shí)間對(duì)PRV、VSV、Sindbis病毒的滅活效果 見表5。

2.5 300Mpa處理不同時(shí)間對(duì)PRV、VSV、Sindbis病毒的滅活效果 見表6。

表3 500Mpa處理不同時(shí)間對(duì)PRV、VSV、Sindbis病毒的滅活效果

表4 400Mpa處理不同時(shí)間對(duì)PRV、VSV、Sindbis病毒的滅活效果

表5 350Mpa處理不同時(shí)間對(duì)PRV、VSV、Sindbis病毒的滅活效果

表6 300Mpa處理不同時(shí)間對(duì)PRV、VSV、Sindbis病毒的滅活效果

2.6 400Mpa處理VSV病毒60min電鏡觀察對(duì)病毒形態(tài)的影響 對(duì)照病毒為典型的彈狀病毒，包膜完整，觸須清晰的與病毒體連在一起。經(jīng)超高壓處理的病毒包膜已不完整，觸須也從病毒體脫落(圖1)。

圖1 400Mpa處理VSV病毒60min電鏡圖

3 討論

本研究觀察了超高壓對(duì)《血液制品去除/滅活病毒技術(shù)方法及驗(yàn)證指導(dǎo)原則》中規(guī)定的幾種主要指示病毒的滅活作用。試驗(yàn)結(jié)果顯示，350Mpa處理含指示病毒的血漿樣品90min或400Mpa處理60min可滅活所加入的 PRV、VSV、Sindbis等指示病毒。PRV、VSV、Sindbis等均為脂包膜病毒對(duì)超高壓滅活處理敏感，而經(jīng)血液傳播的HBV、HCV、HIV等均是脂包膜病毒。所以超高壓處理血漿可以阻斷這幾種主要病毒的血液傳播途徑。有包膜病毒的包膜是包圍在病毒核衣殼外面的雙層膜。它主要含有蛋白質(zhì)、多糖及脂類。包膜是有包膜病毒感染的必須結(jié)構(gòu)。病毒有無包膜對(duì)壓力的敏感性不同。超高壓能改變某些生物高分子物質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，使之發(fā)生不可逆變化。對(duì)蛋白質(zhì)的一、二級(jí)結(jié)構(gòu)影響不大，對(duì)三、四級(jí)的立體結(jié)構(gòu)影響較大。使蛋白質(zhì)變性、酶失活，導(dǎo)致微生物被滅活［3］。但是用600Mpa超高壓處理含PV1、PPV病毒的血漿，對(duì)這2種病毒幾乎沒有滅活作用。PV1、PPV病毒為無包膜病毒，直徑小于30nm，衣殼為二十面體立體對(duì)稱，無包膜。其衣殼主要成分為蛋白質(zhì)，要使其表面結(jié)構(gòu)發(fā)生改變比有包膜的病毒需要更高的壓力，即此類病毒對(duì)壓力因素不敏感。超高壓技術(shù)用于病毒滅活與常用的光化學(xué)技術(shù)相比，沒有任何外源性物質(zhì)加入，屬于純物理方法。超高壓技術(shù)可應(yīng)用于疫苗的制備。蛋白質(zhì)的共價(jià)鍵結(jié)構(gòu)完整性是保持免疫原性的必要條件。超高壓對(duì)病毒的滅活不引起共價(jià)結(jié)構(gòu)的改變。有報(bào)道顯示對(duì)不同病毒進(jìn)行了超高壓處理后經(jīng)免疫動(dòng)物所產(chǎn)生的抗體同未加壓處理的病毒產(chǎn)生的抗體是一樣有效的［4］。而且對(duì)有包膜病毒來說，經(jīng)超高壓處理的病毒有免疫原性的提高。因?yàn)閴毫蓪?dǎo)致原本埋藏在膜內(nèi)或隱蔽在致密的亞單位結(jié)合結(jié)構(gòu)中的抗原位置得以充分暴露［5］。

［1］Bradley DW，Hess RA，Tao F，et a1.Transfusion，2000，40(2):193-200.

［2］Silva J，F(xiàn)oguel D，Royer C.Trends Biochem.Sci，2001，26(10):612-618.

［3］Vadim V.et al.Tibtech dicember，1994，12:493-501.

［4］Elke J urkiewicz，et al.Biophysics，1995，92:6935-6937.

［5］Jerson L.et al.Joural of Virology，1992，66:2111-2117.