2例類孟買血型的分子機制研究及家系調(diào)查

黃丹丹(寧波市中心血站，浙江 寧波 315040)

H抗原是紅細胞上的A和B抗原的前體。ABO基因決定A和B抗原，而α-1，2巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因FUT1(或H)和分泌基因FUT2(或Se)決定H抗原的表達。FUT1基因決定H抗原在紅細胞上的表達，F(xiàn)UT2基因決定H抗原在分泌腺和消化液中的表達。類孟買血型在ABO血型系統(tǒng)中為罕見的稀有血型，典型特征為H抗原部分或完全缺失，分泌液中存在H物質(zhì)。我們發(fā)現(xiàn)了2例類孟買型，對其進行了血清學和分子遺傳學檢測。

1 材料與方法

1.1 對象 先證者1為男性，64歲，浙江漢族，因“肝炎肝硬化失代償期”被寧波市第二醫(yī)院收治。入院檢查發(fā)現(xiàn)患者ABO血型正反定型不符，故來寧波市中心血站協(xié)助進一步鑒定。先證者2為男性，60歲，浙江漢族，因術前檢查發(fā)現(xiàn)ABO血型正反定型不符而送至寧波市中心血站協(xié)助進一步鑒定。

1.2 家系調(diào)查 在征得先證者及家人同意后，采集其外周血血樣，進行相關檢測。

1.3 血型血清學實驗 ABO正反定型、直接抗球蛋白試驗、吸收放散試驗、唾液中ABH血型物質(zhì)測定試驗、Lewis血型鑒定按照相關試劑說明書及文獻［1］進行?？?A、抗-B、抗-H、ABO標準紅細胞、直接抗球蛋白試劑盒由上海血液生物醫(yī)藥有限責任公司提供，抗-AB、抗-A1、抗-Lea、抗-Leb單克隆抗體由荷蘭Sanquin公司提供。

1.4 抗體篩查及抗體鑒定 按文獻［1］方法進行。將被檢者血清與篩選細胞采用鹽水介質(zhì)分別在4℃、室溫、37℃下進行反應，如有凝集，進一步做抗體鑒定。被檢者血清與標準譜細胞反應，在鹽水介質(zhì)和抗球蛋白中試驗，同時進行抗-H效價測定。

1.5 流式檢測紅細胞上A、B抗原 向微孔板中每孔加入約500000個紅細胞，0.1%戊二醛室溫持續(xù)振蕩固定10 min，加入抗-A［Sanquin，Pelikloon抗-A(IgM)單克隆抗體］或抗-B［Sanquin，Pelikloon抗-B(IgM)單克隆抗體］，室溫持續(xù)振蕩孵育30 min后，用PBS洗滌3次。加入二抗(phycoerythrin［PE］-labeled rat anti-mouse Ig κ light chain，BD Pharmingen 公司)，室溫避光振蕩孵育30 min后，洗滌2次。用PBS重懸后，將細胞轉(zhuǎn)移至流式試管中上機檢測。采用流式細胞儀(Beckman Coulter，Cytomics FC 500)進行檢測，利用 CXP 2.2軟件(BECKMAN公司)建立檢測方案，用未加熒光抗體的紅細胞空白管調(diào)節(jié)電壓，觀察紅細胞群區(qū)域，設門，獲取數(shù)據(jù)。每次實驗均設立陰性(O型紅細胞)、陽性對照(同型紅細胞)。

1.6 外周血基因組DNA提取 用TIANGEN公司的血液基因組DNA提取系統(tǒng)試劑盒提取外周血標本DNA，具體操作參照產(chǎn)品說明書。

1.6.1 ABO基因測序 針對ABO血型基因多態(tài)性位點多位于第6、7號外顯子，采用蔡曉紅等［2］設計的2對引物:5'tggaagggtggtcagagga 3'和5'ctggagaaggagctgggtt 3';5'tgggaagaggatgaagtgaat 3'和5'caacaggacggacaaagga 3'，分別擴增 ABO基因第6外顯子和第7外顯子DNA片段。PCR產(chǎn)物割膠純化后，采用美國ABI 3730測序儀進行直接測序。用Chromas軟件將測序結果與 NCBI基因文庫 A1.01.1.2(GI:156148258)序列進行比對(Blast search)分析。

1.6.2 PCR擴增FUT1和FUT2基因并測序 擴增先證者及家人FUT1基因第4外顯子，正向擴增/測序引物和反向擴增/測序引物分別為 Hi7F1(5'-CATTTGCTAATTCGCCTTTCCTC-3')和Hi8R1(5'-GATCAGGCTACATCAGAAAGTCTCC-3')，PCR反應體系及反應循環(huán)參數(shù)按照參考文獻［3］。擴增先證者及家人FUT2基因第2外顯子，正向擴增/測序引物和反向擴增/測序引物分別為Sei1F1(5'-CCATCTCCCAGCTA-ACGTGTCC-3')和 See1R7(5'-GGGAGGCAGAGAAGGAGAAAAGG-3')，PCR反應循環(huán)參數(shù)按參考文獻［3］。PCR產(chǎn)物割膠純化后，采用美國ABI 3730測序儀進行直接測序。用Chromas軟件將測序結果分別于與NCBI基因文庫NG_007510.1 序列(GI:183076549)和 NG_007511.1 序列(GI:183076550)進行比對(Blast search)分析。

1.6.3 FUT1基因TOPO TA克隆 嚴格按試劑(美國Invitrogen公司)說明進行操作，挑取10個陽性克隆，提取質(zhì)粒，以質(zhì)粒DNA為模板測序鑒定FUT1基因突變。

2 結果

2.1 血型血清學鑒定 2例先證者的血型血清學結果見表1。先證者1的女兒和兒子均為正常B型，無類孟買型;先證者2的女兒和胞姐分別為正常A型和O型，無類孟買型。家系圖見圖1。吸收放散試驗顯示，先證者1和先證者2紅細胞上均不含有A抗原和B抗原。唾液中和抑制試驗證實，先證者1唾液中含有A和B抗原，先證者2唾液中含有A抗原，2者均為分泌型。

表1 2例類孟買血型者的ABO、H、Lewis血型鑒定結果

圖1 先證者1和先證者2家系調(diào)查示意圖

2.2 抗體篩選及抗體鑒定 抗體篩選結果見表2。血清中抗-H效價:先證者1血清抗-H效價分別是:4℃，1∶2;室溫，0;37℃，0。先證者2血清抗-H效價分別是:4℃，1∶64;室溫，1∶16;37℃，1∶4。

2.3 流式檢測紅細胞上A、B抗原 通過流式細胞術檢測標本紅細胞上A抗原和B抗原的表達水平，具體結果見圖2。

2.4 ABO基因測序分析 先證者1基因型為A101B101(即261G/G、297A/G、526C/G、657C/T、703G/A、796C/A、803G/C和930G/A);先證者2基因型為A101O01(即261G/del雜合)。

表2 2例類孟買血型標本血清與標準譜紅細胞反應結果

圖2 流式細胞術檢測紅細胞上的A抗原和B抗原

2.5 FUT1和FUT2基因測序分析 先證者1測序發(fā)現(xiàn)FUT1基因存在547～552位 AG純合缺失(AGAGAG→AGAG)，基因型為h1h1型;先證者兒子和女兒FUT1基因均存在547～552位AG雜合缺失(圖3)。先證者2測序發(fā)現(xiàn)FUT1基因有2處雜合突變，分別為547～552位AG雜合缺失和658位C→T雜合突變;TA克隆進一步證實1條染色體上FUT1基因存在547～552位AG兩堿基缺失，另1條染色體上存在C658T錯義突變，基因型均為h1h3。先證者2的女兒和胞姐均存在658位C→T雜合突變(圖4)。

圖3 家系1的FUT1基因片段測序圖

3 討論

典型的類孟買型為H抗原缺乏分泌型(H基因無活性而SE基因有活性)，其紅細胞上ABH抗原缺失，血清中通常存在抗-H或抗-HI，其分泌液中含有正常的ABH物質(zhì)。有些可通過吸收放散試驗測得紅細胞上含有少量ABH物質(zhì)，一般認為可能是因為血漿中的ABH物質(zhì)吸附到紅細胞上所致，并不是紅細胞自身表達產(chǎn)生的。。國內(nèi)已報道的類孟買型個例已超過30例，其中2例是本實驗室報道的［4］。本文中2個被檢者的血清學試驗結果與類孟買ABhm和Ahm血型特點相符。

圖4 家系2的FUT1基因片段測序圖

在臨床工作中，類孟買型常因正反定型不一致，需進行進一步檢測而被發(fā)現(xiàn)，其紅細胞與抗-H試劑反應呈陰性，與抗-A、抗-B、抗-AB反應也呈陰性。這種時候就需要用更敏感、更全面的方法來檢測紅細胞上的 ABO。近年來有文獻［5，6］報道采用流式細胞技術對紅細胞表面的ABO抗原進行定量和定性測定，有助于研究人員能夠更好地檢測抗原的表達量。流式細胞術測定抗原表達的減少是1種敏感方法，因為它可以解決細胞群的問題，測出部分或全部抗原表達的減少，還可以計數(shù)涉及的細胞，能更客觀和全面地反映紅細胞上ABO抗原的表達狀況。在ABO血型檢測中，流式細胞技術在某種程度上補充了常規(guī)血清學和基因檢測的不足［6］。本實驗室為了更好地檢測紅細胞上弱表達的A/B抗原，采用了流式細胞術檢測紅細胞上的ABO抗原。結果顯示，流式細胞技術未檢測到本研究中2例類孟買型紅細胞上的A/B抗原，這和常規(guī)血清學試驗及吸收放散試驗結果相吻合，進一步表明標本紅細胞上無A/B抗原表達。這是國內(nèi)首次用流式細胞技術檢測類孟買型紅細胞上的A/B抗原。

研究表明，類孟買型主要是由于FUT1基因的突變引起的，目前已報道的相關突變已超40種，包括錯義、缺失和插入突變等［7，8］。本研究中的先證者1的FUT1基因第547～552位AG純合缺失(為h1h1)，為常見的類孟買型，該突變導致閱讀框架發(fā)生移碼，提前形成終止密碼，造成第184位到267位氨基酸發(fā)生改變，并在氨基酸第268位處合成鏈被終止，從而突變后的多肽鏈長度為267個氨基酸，只有野生型的73.2%，且氨基酸序列發(fā)生改變，使α1，2巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶失去活性，不能合成H抗原［9］。先證者1的女兒和兒子都存在547～552位AG雜合缺失，進一步證實了該突變的存在。測序表明，先證者2存在復合雜合突變，除上述的547～552位AG缺失外，還存在658位C→T雜合突變，TA克隆證實2種突變位于不同的染色體上，為h1h3。C658T錯義突變將導致第220位精氨酸(Arg)→半胱氨酸(Cys)，精氨酸為堿性氨基酸，氨基酸等電點(pI)值為10.76;半胱氨酸為中性氨基酸，pI值為5.07，這2個氨基酸的物理化學性質(zhì)差異很大，推測這個氨基酸的取代可能降低α1，2巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的生物活性。我們檢測了先證者2的胞姐和女兒，都存在658位C→T雜合突變，進一步證實了該突變的存在。

本研究從分子水平和家系調(diào)查證實了這2例類孟買型的基因突變位點，但只能推測基因突變對氨基酸的影響，并不能真正反映下游蛋白質(zhì)的結構與功能關系，因此本研究中發(fā)現(xiàn)的2種突變對H抗原的表達以及α1，2巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性的影響仍有待今后進行體外表達研究。

［1］中華人民共和國衛(wèi)生部醫(yī)政司.全國臨床檢驗操作規(guī)范.3版.南京:東南大學出版社，2006:246-270.

［2］Cai XH，Jin S，Liu X，et al.Molecular genetic analysis for the Bx subgroup revealing two novel alleles in the ABO gene.Transfusion，2008，48(11):2442-2447.

［3］Yip SP，Chee KY，Chan PY，et al.Molecular genetic analysis of para-Bombay phenotypes in Chinese:a novel non-functional FUT1 allele is identified.Vox Sang，2002，83(4):258-262.

［4］許德義，鄧剛，黃丹丹，等.兩例類孟買型血型的FUT1基因突變分析.中華醫(yī)學遺傳學雜志，2011，28(7):694-698.

［5］Hult AK，Yazer MH，J?rgensen R，et al.Weak A phenotypes associated with novel ABO alleles carrying the A2-related 1061C deletion and various missense substitutions.Transfusion，2010，50(6):1471-1487.

［6］Hult AK，Yazer MH，J?rgensen R.Many genetically defined ABO subgroups exhibit characteristic flow cytometric patterns.Transfusion，2010，50(1):308-323.

［7］Cai XH，Jin S，Liu X，et al.Molecular genetic analysis for the para-Bombay blood group revealing two novel alleles in the FUT1 gene.Blood Transfus，2011，9(3):466-468.

［8］Xu X，Tao S，Ying Y，et al.A novel FUT1 allele was identified in a Chinese individual with para-Bombay phenotype.Transfus Med，2011，21(2):385-393.

［9］和艷敏，許先國，朱發(fā)明，等.2例類孟買表型的分子機理研究.中國實驗血液學雜志，2007，15(7):626-629.