高效液相色譜法檢測(cè)金線蓮中核苷類成分

吳萍萍， 黃麗英

金線蓮為蘭科開唇蘭屬多年生草本植物，是一種珍稀名貴藥材，在民間享有“藥王”、“金草”等盛譽(yù)。金線蓮性涼，味甘，微苦，具有清熱涼血、袪風(fēng)利濕、強(qiáng)心利尿、固腎，平肝、止痛鎮(zhèn)咳等功效。金線蓮全草皆可入藥，在東南亞及我國(guó)民間廣泛用于治療肝炎、高血壓病、腫瘤、腎炎、糖尿病、小兒驚風(fēng)高熱等癥[1-3]。近年來的研究表明，金線蓮中含有多種化學(xué)成分，如黃酮類、核苷類、多糖類、生物堿、氨基酸、酯類、甾醇、三萜類、微量元素等物質(zhì)[4-7]，但迄今為止，關(guān)于金線蓮中核苷類成分的研究較少。

核苷類化合物作為中藥材中的基礎(chǔ)類物質(zhì)之一，可以直接或間接作為藥物使用，在抗病毒、抗腫瘤方面展示了不可取代的獨(dú)特作用，備受研究者重視?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，核苷類成分具有保護(hù)機(jī)體組織和器官、調(diào)節(jié)免疫功能、抗癌等多種藥理作用[8-9]。本研究對(duì)不同產(chǎn)地、不同種類、不同生長(zhǎng)方式的金線蓮中的胞苷、次黃嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、腺嘌呤、胸苷6種核苷類物質(zhì)進(jìn)行定性分析和含量測(cè)定，研究不同金線蓮中各核苷類物質(zhì)含量的差異，為金線蓮的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1藥材 分別來自福建省內(nèi)的金線蓮，編號(hào)為A，B，C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，J，K及L，其中按照種植方式可以分為組培、種植、野生3類。金線蓮由福建醫(yī)科大學(xué)天然藥物化學(xué)學(xué)系張永紅教授鑒別。金線蓮樣本材料的相關(guān)信息見表1。

表1金線蓮樣本材料的相關(guān)信息

Tab 1The relevant information about tested samples ofAnoectochilusRoxburghii

樣本編號(hào)產(chǎn)地種植方式樣本種類A漳州南靖組培4月紅霞B漳州南靖種植5月紅霞C漳州南靖組培5月紅霞D漳州南靖種植12月紅霞E三明永安組培4月紅霞F三明永安種植5月紅霞G福清種植5月紅霞H福清種植6月紅霞I三明永安種植6月紅霞J三明永安野生有金色葉脈K三明永安野生無金色葉脈L三明永安野生有金色葉脈

A～L:為金線蓮不同樣本編號(hào).

1.1.2試劑 胞嘧啶核苷(99%，Lot#L1628034)、鳥嘌呤(98%，Lot#E1605104)、腺嘌呤(99%，Lot#C1727002)、次黃嘌呤(99%，Lot#H1603061)、胸腺嘧啶(98%，Lot#H1605062)、β-胸苷(99%，Lot#H1601064)對(duì)照品均購于阿拉丁公司；甲醇、三乙胺、乙酸銨(分析純)均購于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為自制雙蒸水。

1.1.3儀器 液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(LCMS-2020型，日本Shimadzu公司)；高效液相色譜儀(LC-15C型,日本SHIMADZU公司)；Agilent TC-C18(5 μm，4.6×250 mm)色譜柱(美國(guó)Agilent公司)；高速多功能粉碎機(jī)(XY-500A型,浙江省永康市松青五金廠)；醫(yī)用數(shù)控超聲清洗器(KQ-250DE型，昆山市超聲儀器有限公司)；高速冷凍離心機(jī)(Neofuge 18R型，力康發(fā)展有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-52AA型，上海亞榮生化儀器廠)。

1.2方法

1.2.1色譜分離條件 色譜柱：Agilent TC-C18柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)，流動(dòng)相：A-0.05%乙酸銨水溶液，B-甲醇，二元高壓梯度洗脫程序：0～5 min，1% B；5～10 min，1%～5% B，10～30 min，25% B。流速：0.8 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：260 nm，進(jìn)樣量：20 μL，柱溫：30 ℃。

1.2.2質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(Electron Spray Ionization, ESI)，掃描模式正離子ESI(+)，霧化氣流速：1.5 L/min，干燥氣流速：10 L/min，加熱塊溫度：400 ℃，進(jìn)樣量：10 μL，掃描范圍m/z：50～800。

1.2.3混合對(duì)照品溶液的配制 分別精密稱取胞苷12.6 mg、次黃嘌呤12.1 mg、鳥嘌呤5.2 mg、胸腺嘧啶6.2 mg、腺嘌呤5.6 mg、胸苷8.4 mg置于25 mL量瓶中，加適量的0.1%氫氧化鈉水溶液溶解混勻，定容至刻度，配制成含胞苷、次黃嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、腺嘌呤、胸苷的濃度分別為504，484，208，248，224，336 μg/mL的混合對(duì)照品溶液，置于4 ℃的冰箱內(nèi)待用。

1.2.4藥材供試品的制備 取金線蓮粉末(過80目篩)約1.0 g，精密稱定，置于超聲-微波協(xié)同萃取儀容器中，精密加入0.1%氫氧化鈉水溶液20 mL，于超聲-微波協(xié)同萃取儀50 ℃恒溫條件下提取45 min，萃取2次，合并兩次萃取液，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得浸膏，用少量水溶解定容于25 mL量瓶中， 0.45 μm微孔濾膜濾過，即為得到的供試品溶液。

2 結(jié) 果

2.1線性范圍的考察 對(duì)“1.2.3”中配制的混合對(duì)照品溶液進(jìn)行1/5，1/10，1/25，1/50 ，1/125，1/250，1/500 濃度稀釋，得到7個(gè)不同濃度的混合對(duì)照品溶液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析測(cè)定。取線性范圍內(nèi)最低濃度混合對(duì)照品溶液不斷等倍稀釋進(jìn)行分析，以信噪比S/N=3作為檢出限(limit of detection, LOD)，S/N=10作為定量限(limit of quantitation, LOQ)，結(jié)果見表2。

表2 線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)

LOD:檢出限; LOQ:定量限.

2.2HPLC鑒定金線蓮中核苷類物質(zhì) 由混合對(duì)照品溶液和金線蓮供試品溶液色譜圖(圖1，2)可知，胞苷、次黃嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、腺嘌呤的保留時(shí)間分別是5.39，6.76，8.23，9.60，14.31和14.92 min。根據(jù)保留時(shí)間，圖2的1，2，3，4，5，6號(hào)色譜峰初步鑒定為胞苷、次黃嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、腺嘌呤和胸苷。

2.3LC-ESI(+)/MS鑒定金線蓮中核苷類物質(zhì) 為進(jìn)一步確認(rèn)這些色譜峰的歸屬，必須考察對(duì)應(yīng)化合物在相同條件下的結(jié)構(gòu)信息。在設(shè)定的HPLC-ESI(+)/MS條件下，分別對(duì)胞苷、次黃嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、腺嘌呤、胸苷的對(duì)照品和供試品溶液進(jìn)樣，經(jīng)色譜分離后對(duì)保留時(shí)間分別是5.39，6.76，8.23，9.60，14.31和14.92 min色譜峰進(jìn)行質(zhì)譜分析，得到各離子峰的精確質(zhì)量數(shù)，6個(gè)核苷類成分的質(zhì)譜特征碎片峰歸屬見表3。

1：胞苷；2：次黃嘌呤；3：鳥嘌呤；4：胸腺嘧啶；5：腺嘌呤；6：胸苷.圖1 混合對(duì)照品的高效液相色譜圖Fig 1 Chromatography of standard sample

1：胞苷；2：次黃嘌呤；3：鳥嘌呤；4：胸腺嘧啶；5：腺嘌呤；6：胸苷.圖2 供試品高效液相色譜圖Fig 2 Chromatography of sample

Tab 3The belonging of secondary mass spectrum of six nucleosdies

準(zhǔn)分子特征化合物[M+H]+碎片峰歸屬m/zm/z胞苷244.2111.8[M+H-rib]+94.6[M+H-rib-NH3]+68.5[M+H-rib-NH3-CN]+次黃嘌呤137.1119[M+H-H2O]+110[M+H-HCN]+鳥嘌呤152.2135.1[M+H-H2O]+109.9[M+H-NH2CN]+胸腺嘧啶127.1110[M+H-NH3]+84[M+H-NH3-CN]+腺嘌呤136.1119[M+H-NH3]+91.9[M+H-NH3-HCN]+64.8[M+H-NH3-HCN-HCN]+胸苷243.2127.1[M+H-rib]+99[M+H-rib-CO]+

m/z:質(zhì)子數(shù)/電荷數(shù)的比值.

基于m/z值、結(jié)合各成分在色譜中出峰時(shí)間、對(duì)照品和文獻(xiàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較和分析，保留時(shí)間為5.39，6.76，8.23，9.60，14.31和14.92 min處的色譜峰對(duì)應(yīng)的物質(zhì)分別鑒定為胞苷、次黃嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、腺嘌呤和胸苷。

2.4精密度實(shí)驗(yàn) 選取同一濃度的混合對(duì)照品溶液，按照“1.2.1”中色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6針，測(cè)定各成分的相應(yīng)信號(hào)并計(jì)算其RSD值。胞苷、次黃嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、腺嘌呤和胸苷的RSD值(n=6)分別為1.74%，1.97%，1.67%，1.06%，1.89%，1.37%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.5穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一供試品溶液分別于0，2，4，6，8，12，24 h進(jìn)樣，測(cè)定胞苷、次黃嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、腺嘌呤和胸苷的含量并計(jì)算RSD值分別為1.42%，1.31%，1.25%，1.14%，1.27%及1.84%，說明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.6重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取A金線蓮粉末(過80目篩)，每份1 g，分別精密稱定6份。按照“1.2.4”方法制備6份供試品溶液，按“1.2.1”中色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定胞苷、次黃嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、腺嘌呤和胸苷的含量并計(jì)算RSD值，結(jié)果分別為1.61%，0.62%，0.69%，0.82%，1.32%及0.75%，表明本法重復(fù)性良好。

2.7加樣回收實(shí)驗(yàn) 取A金線蓮粉末(過80目篩)9份，每份約0.5 g，精密稱定。分別按照80%，100%，120%濃度水平加入對(duì)應(yīng)量的對(duì)照品溶液，按“1.2.4”中的方法制備9份供試品溶液，按“1.2.1”中色譜條件進(jìn)樣，計(jì)算樣本的加樣回收率，結(jié)果如表4所示。

2.8樣品含量測(cè)定 將12種金線蓮分別精密稱量3份，按照“1.2.4”中制備方法制備供試品溶液，按照“1.2.1”中液相色譜條件進(jìn)樣分析測(cè)定，測(cè)得6種核苷成分在各樣本中的平均含量(表5)。

3 討 論

本研究考察了分別以甲醇-水、乙腈-水、甲醇-乙酸、甲醇-乙酸銨水溶液為流動(dòng)相時(shí)6種核苷成分的分離效果，其中單純以甲醇-水、乙腈-水為流動(dòng)相時(shí)，色譜峰峰形較差；當(dāng)有機(jī)相為乙腈時(shí)，目標(biāo)色譜峰出峰較快，難以與其他雜質(zhì)峰分離，因此有機(jī)相選用甲醇。選用甲醇-乙酸作為流動(dòng)相時(shí)，腺嘌呤和胸苷色譜峰嚴(yán)重拖尾；選定甲醇-乙酸銨水溶液作為流動(dòng)相時(shí)，各色譜峰得到較好的分離。

在進(jìn)行供試品溶液的制備時(shí)，本研究考察了甲醇-水、乙醇-水、純水3種提取溶劑的不同比例的溶劑對(duì)核苷及堿基類成分提取的影響。結(jié)果表明，甲醇及乙醇提取核苷類的成分含量低，色譜峰較少，無法真實(shí)有效地反映出金線蓮中含有的核苷類成分的含量。由于鳥嘌呤、次黃嘌呤、腺嘌呤對(duì)照品在純水中的溶解度較差，易溶于堿性溶液，所以提取溶劑也嘗試了不同pH的溶劑，包括水、0.1%氨水、1%氨水、0.1%氫氧化鈉水溶液、0.1%乙酸、1%乙酸等；提取效果順序?yàn)?.1%氫氧化鈉水溶液、0.1%氨水、1%氨水、0.1%乙酸、1%乙酸，結(jié)果表明0.1%氫氧化鈉水溶液作為提取溶劑，各核苷類成分測(cè)得的含量較高，故最終采用0.1%氫氧化鈉水溶液作為提取溶劑。

表4 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

RSD：相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差.

表5 6種成分在各樣本中平均含量

n=3. A～L為金線蓮不同樣本編號(hào).

12種金線蓮樣本經(jīng)測(cè)定均含有胞苷、次黃嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、腺嘌呤、胸苷6種成分，但各成分的含量差異較大。鳥嘌呤和腺嘌呤在各金線蓮樣本中含量整體較為均衡。以生長(zhǎng)方式分類時(shí)，總核苷的含量由高到低順序依次為:組培>種植>野生，可能因?yàn)榻M培金線蓮的人工生長(zhǎng)環(huán)境優(yōu)越、營(yíng)養(yǎng)更加豐富，使得金線蓮代謝更加迅速，有利于核苷類成分在藥材中的累積。以產(chǎn)地分類時(shí)，不同產(chǎn)地的總核苷的含量沒有較大的差異，幾種金線蓮樣本均來自福建省，各種栽培管理技術(shù)以及生長(zhǎng)環(huán)境都相對(duì)類似，因此核苷的總量并沒有顯示較大的差異。

本研究采用LC-MS法分析金線蓮中6種核苷類成分，建立HPLC-UV法測(cè)定金線蓮中6種核苷類成分的含量，能夠?yàn)榻鹁€蓮品質(zhì)評(píng)價(jià)和藥效作用的深入研究以及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的進(jìn)一步完善提供參考。