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    miR-208a通過下調(diào)p21的表達(dá)促進(jìn)心肌肥厚

    2019-11-28 01:54:52吳佳易鄭行春
    關(guān)鍵詞:細(xì)胞株熒光素酶細(xì)胞周期

    陳 恩,蔡 煒,吳佳易,鄭行春

    心肌肥厚(cardiachypertrophy,CH)是心肌細(xì)胞對(duì)心臟長期超負(fù)荷工作的的代償過程,在維持心臟功能上有著重要作用,臨床上常發(fā)生于高血壓病、急性心肌梗死后及心肌病的患者。但是,隨著疾病的進(jìn)展,心臟負(fù)荷的持續(xù)存在或增加,CH在晚期將不可避免的走向失代償,最終導(dǎo)致心力衰竭而死亡[1-2]。目前CH的病因尚未完全明確,同時(shí)臨床也缺乏切實(shí)有效的治療策略。因此,尋找新的有效的治療靶點(diǎn)一直是研究的熱點(diǎn),近年的研究發(fā)現(xiàn),微小RNA(miRNA)參與調(diào)控CH,與心力衰竭的發(fā)生密切相關(guān)[3-6]。miRNA是一種大小為19~25個(gè)堿基的單鏈非編碼小分子RNA,通過其“種子序列”與靶mRNA 3′-端非翻譯區(qū)(UTR)的序列完全互補(bǔ)或不完全互補(bǔ)結(jié)合,導(dǎo)致靶mRNA 降解或翻譯抑制,從而在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)調(diào)控靶基因的表達(dá)[7-8]。有研究報(bào)道,心臟特異性的miR-208a過度表達(dá)將造成小鼠心肌β-肌球蛋白重鏈(β-myosin heavy chain, β-MCH)表達(dá)的增加,導(dǎo)致CH[9];而且通過抑制小鼠miR-208a的表達(dá),可以減少小鼠CH,從而改善心臟功能[10]。提示miR-208a有望作為逆轉(zhuǎn)CH的治療靶點(diǎn)。但是miR-208a在CH過程中的具體作用機(jī)制仍未完全明確。

    有研究發(fā)現(xiàn),miR-208a在HEK293細(xì)胞中能夠在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)調(diào)控p21的表達(dá)[11]。p21是一種重要的細(xì)胞周期抑制因子,能夠與cyclin D/CDK形成復(fù)合物使細(xì)胞周期停滯在G1期,抑制細(xì)胞的增殖,使其退出細(xì)胞周期[12]。哺乳動(dòng)物出生后不久,在正負(fù)細(xì)胞周期調(diào)控因子的共同作用下心肌細(xì)胞退出了細(xì)胞周期,大部分停滯于G0/G1期,成為高度分化的終末細(xì)胞,喪失了有絲分裂的能力[13]。即使在某些病理刺激下,心肌細(xì)胞可以通過下調(diào)p21等細(xì)胞周期負(fù)調(diào)控因子的表達(dá),重返細(xì)胞周期,促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)DNA和蛋白質(zhì)合成增加[14-16],但是,由于其喪失有絲分裂的能力,最終表現(xiàn)的是心肌細(xì)胞體積上增大(即CH),而并非數(shù)量上的增加[17]。因此,miR-208a可能通過調(diào)控細(xì)胞周期抑制因子p21的表達(dá),影響心肌細(xì)胞周期,從而影響CH的發(fā)生、發(fā)展過程。本研究將通過建立小鼠CH模型,明確miR-208a和p21的表達(dá)情況;通過體外細(xì)胞模型,明確miR-208a影響小鼠CH的調(diào)控靶基因,為CH的基因治療提供一條新的思路。

    1 材料與方法

    1.1主要材料 8~10周齡的雄性C57BL/6L小鼠[上海斯萊克實(shí)驗(yàn)有限公司,許可證SCXK(滬)2007-00005];小鼠心肌細(xì)胞株(HL-1)、HEK293T購至中科院上海細(xì)胞所;慢病毒載體系統(tǒng)pWPXL,psPAX2,pDM2G(上海腫瘤研究所黃勝林博士贈(zèng)送)。胚胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司);miR-208a模擬物和抑制物(廣州市銳博生物科技有限公司);定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)試劑盒(日本TaKaRa公司);Dual-Luciferase Reporter Assay System(美國Promega公司),SuperSignal Western-blot化學(xué)發(fā)光底物系統(tǒng)(美國Pierce公司),p21單克隆抗體及GADPH(美國Sigma公司),山羊抗小鼠二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)等。

    1.2小鼠CH模型 55只清潔級(jí)小鼠,體質(zhì)量(20±5)g,分為假手術(shù)組(Sham組,n=20)和CH組(n=35)。(1)CH組:將經(jīng)腹腔注射3%戊巴比妥鈉(35 mg/kg)麻醉的小鼠仰臥位固定,氣管插管接呼吸機(jī)控制呼吸,胸前正中區(qū)備皮、消毒,切開皮膚,分離組織,暴露主動(dòng)脈弓,26~27 G墊扎針頭墊扎,對(duì)主動(dòng)脈及墊扎針用5號(hào)絲線結(jié)扎,結(jié)扎確實(shí)后抽出墊扎針,檢查主動(dòng)脈弓近心端波動(dòng)增強(qiáng),逐層關(guān)胸,縫皮。手術(shù)切口處用紅霉素眼膏涂敷,待小鼠自主呼吸恢復(fù)后脫機(jī)拔管,觀察至蘇醒。(2)Sham組同期開胸但不進(jìn)行主動(dòng)脈弓結(jié)扎。(3)4周后再次麻醉小鼠,開胸取心臟,一部分做成蠟塊用于石蠟切片,另一部分保存于-80 ℃冰箱中,用于后續(xù)的RT-qPCR和Western-blot檢測(cè)。所有的小鼠試驗(yàn)均遵守相關(guān)的操作指南[18]。

    1.3H-E染色 石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟,依次梯度乙醇水化;蘇木精液染色5 min后,流水沖洗1~3 min;然后加1%鹽酸乙醇2 s,流水沖洗3~5 min,伊紅染液復(fù)染30 s后脫水,最后用中性樹膠封片。

    1.4細(xì)胞培養(yǎng) 將小鼠心肌細(xì)胞株(HL-1)和HEK293T細(xì)胞放置于含10%胎牛血清、50 μg/mL鏈霉素和50 U/mL青霉素的DMEM培養(yǎng)基中,培養(yǎng)條件為體積分?jǐn)?shù)為0.05、37 ℃的CO2飽和濕度。

    1.5慢病毒載體構(gòu)建、包裝和滴度測(cè)定 根據(jù)miR-208a的基因序列設(shè)計(jì)引物(表1),以小鼠基因組DNA為模板,采用巢式PCR擴(kuò)增獲得包含pre-miR-208a序列在內(nèi)的基因序列,凝膠電泳分離目的片段,膠回收片段,酶切,純化,連接入pWPXL慢病毒載體上,構(gòu)建pWPXL-miR-208a。酶切、測(cè)序鑒定。采用脂質(zhì)體法(脂質(zhì)體2000試劑,轉(zhuǎn)染效率85%以上)按一定比例將pWPXL,pLVTHM,pWPXL-miR-208a與包裝質(zhì)粒psPAX2、包膜質(zhì)粒pMDG2共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞,要求轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞融合度為60%,包裝產(chǎn)生慢病毒顆粒,連續(xù)稀釋法測(cè)定病毒滴度。測(cè)定后病毒顆粒感染心肌細(xì)胞,而后根據(jù)熒光強(qiáng)度判斷感染效果。

    表1 RT-PCR的引物序列

    WT:野生型;M86:突變型.

    1.6野生型和突變型熒光素酶報(bào)告載體構(gòu)建及活性檢測(cè) (1)野生型熒光素酶報(bào)告載體構(gòu)建:采用PCR 分別擴(kuò)增p21基因全長的3′-UTR,凝膠電泳分離目的片段,膠回收片段,酶切,純化,連接到熒光素酶報(bào)告載體pCDNA-luciferase-MCS,構(gòu)建pCDNA-luciferase-p21。酶切、測(cè)序鑒定。(2)突變型熒光素酶報(bào)告載體構(gòu)建:分析miR-208a 對(duì)p21基因全長3′-UTR 的結(jié)合位點(diǎn),設(shè)計(jì)引物突變這個(gè)位點(diǎn)(表1)。采用搭橋PCR 擴(kuò)增特異片段,凝膠電泳分離目的片段,膠回收片段,酶切,連接到熒光素酶報(bào)告載體pCDNA-luciferase-MCS,構(gòu)建pCDNA-luciferase-p21-mut。酶切、測(cè)序鑒定。(3)雙熒光素酶檢測(cè)實(shí)驗(yàn):將pCDNA-luciferase-p21及miR-208a模擬物與對(duì)照載體及陰性對(duì)照與熒光素酶報(bào)告載體(野生型或突變型)、Renilla 共感染小鼠心肌細(xì)胞,雙熒光素酶檢測(cè)試劑檢測(cè)熒光素酶活性,根據(jù)熒光強(qiáng)度判斷感染效果。

    1.7總RNA 提取和實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)miR-208a和p21-mRNA水平表達(dá) 總RNA提取參照TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書反轉(zhuǎn)錄。以GAPDH為內(nèi)參,使用qPCR試劑盒及特異性引物通過PCR儀擴(kuò)增檢測(cè)合成的cDNA,采用2-△△Ct方法,計(jì)算每個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量。

    Real-time PCR 對(duì)小鼠心肌細(xì)胞株進(jìn)行miR-208a的表達(dá)檢測(cè),用pWPXL-miR-208a 慢病毒顆粒感染表達(dá)miR-208a 的小鼠心肌細(xì)胞株;流式細(xì)胞儀分選表達(dá)綠色熒光蛋白的陽性細(xì)胞,完全培養(yǎng)基培養(yǎng),獲得可以傳代的穩(wěn)定細(xì)胞株。

    1.8Western-blot法檢測(cè)p21蛋白水平表達(dá) 提取細(xì)胞總蛋白后,取等量蛋白,在12%的SDS-PAGE凝膠中電泳后,轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素濾膜上,封閉2 h后,孵育一抗,4 ℃過夜。PBS室溫漂洗4次,孵育二抗,1 h后洗膜,曝光。

    1.9細(xì)胞周期分析 將生長狀態(tài)良好的心肌細(xì)胞接種于6孔板內(nèi),待細(xì)胞長至50%融合度,轉(zhuǎn)染小RNA,24 h后加入Nocodazole,使細(xì)胞同步化,16 h后換成完全培養(yǎng)基,釋放6 h后收集細(xì)胞。細(xì)胞用胰酶消化,冷PBS洗2次,用300 μL PBS重懸細(xì)胞,再緩緩加入-20 ℃預(yù)冷的無水乙醇700 μL,混勻后置于-20 ℃固定過夜。次日,先用1 000 r/min離心5 min,棄去乙醇,冷PBS洗2次,再用含有RNA酶(終濃度5 mg/L)的PBS 500 μL重懸細(xì)胞,37 ℃處理30 min;后加入PI 5 μL,室溫避光染色30 min,流式細(xì)胞儀FACSCalibur檢測(cè),記錄激發(fā)波長488 nm處紅色熒光,并用ModFit LT V3.0軟件分析結(jié)果。

    1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism 6統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P<0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    2.1CH小鼠miR-208a和p21的表達(dá) 病理組織學(xué)H-E染色可見:與Sham組比較,CH組的心肌細(xì)胞體積增大;Western-blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn),與Sham組比較,CH組的p21表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05,圖1)。

    心臟組織RNA水平檢測(cè)發(fā)現(xiàn),CH組中的miR-208a明顯增多,而p21-mRNA明顯減少,且二者呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)(圖2)。

    A:H-E染色結(jié)果(上:4×;下:40×);B:p21蛋白檢測(cè),與假手術(shù)組比較,☆☆:P≤0.001.圖1 假手術(shù)組和心肌肥厚組H-E染色結(jié)果和p21蛋白的表達(dá)情況Fig 1 The difference of H-E staining and p21 protein expression between Sham group and CH group

    A:miR-208a; B:p21-mRNA; C:miR-208a和p21-mRNA關(guān)系.圖2 miR-208a和p21-mRNA在小鼠假手術(shù)組和心肌肥厚組的表達(dá)Fig 2 The difference expression of miR-208a and p21-mRNA between Sham group and CH group

    2.2miR-208a通過結(jié)合p21 3′-UTR下調(diào)p21表達(dá) miR-208a可以下調(diào)野生型p21-3′-UTR-熒光素酶的活性,但不影響突變型p21-3′-UTR-熒光素酶的活性(圖3A)。同時(shí),在心肌細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染miR-208a模擬物及miR-208的抑制劑,從而使得心肌細(xì)胞中miR-208a過表達(dá)或表達(dá)下調(diào),結(jié)果表明,過表達(dá)miR-208a后心肌細(xì)胞中p21的mRNA及蛋白水平均出現(xiàn)明顯下調(diào)(圖3B,C);相反,抑制miR-208a的表達(dá)后心肌細(xì)胞中p21的蛋白水平則呈上調(diào)(圖3C)。

    2.3miR-208a促進(jìn)心肌細(xì)胞周期G1-S期的轉(zhuǎn)化

    流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn),過表達(dá)miR-208a時(shí),G1期的細(xì)胞數(shù)明顯減少,S期細(xì)胞數(shù)明顯增加;抑制miR-208a表達(dá)后,G1期細(xì)胞數(shù)增多,S期細(xì)胞數(shù)減少(圖4)。

    A:雙熒光素酶檢測(cè);B:過表達(dá)miR-208a后p21的mRNA水平的檢測(cè); C:過表達(dá)miR-208a和抑制miR-208a表達(dá)后的p21蛋白水平的檢測(cè). NC:對(duì)照組;miR-208a:過表達(dá)miR-208a組;anti-NC:陰性對(duì)照組;anti-miR-208a:抑制miR-208a組. 兩兩比較,☆☆☆:P≤0.000 1.圖3 miR-208a通過結(jié)合p21 3′-UTR下調(diào)p21的表達(dá)Fig 3 miR-208a down-regulates p21 expression by directly targeting p21 3′-UTR

    過表達(dá)miR-208a和抑制miR-208a表達(dá)后, G1期(A)、S期(B)及G2/M期(C)細(xì)胞數(shù)的變化. 兩兩比較,☆:P≤0.05,☆☆:P≤0.001.圖4 miR-208a促進(jìn)心肌細(xì)胞周期G1-S期的轉(zhuǎn)化Fig 4 miR-208a promotes cell cycle G1/S transition in cardiomyocyte

    3 討 論

    miR-208a是miR-208家族成員之一,由α-心肌β-MCH基因的內(nèi)含子編碼。早期的研究發(fā)現(xiàn),在miR-208a轉(zhuǎn)基因小鼠模型中,隨著miR-208a的過表達(dá),小鼠心肌細(xì)胞體積明顯增大,心室壁增厚,出現(xiàn)明顯的CH,在此過程中,β-MCH也隨著增加。當(dāng)miR-208a缺失時(shí),甲狀腺激素核受體輔助因子(Med13)受到抑制,從而抑制β-MCH的表達(dá),也就不會(huì)出現(xiàn)CH[9]。還有研究發(fā)現(xiàn),miR-208a通過靶向作用于CATA結(jié)合蛋白4(GATA4),參與CH[19]。miR-208a在CH的機(jī)制探討上,有研究還發(fā)現(xiàn),miR-208a能通過上調(diào)內(nèi)皮素的表達(dá)水平而發(fā)揮促進(jìn)CH的作用[20],但是現(xiàn)有的研究仍然沒有完全明確miR-208a促進(jìn)CH的機(jī)制。本研究著眼于CH的直觀表現(xiàn)——心肌細(xì)胞體積增大,通過miR-208a和細(xì)胞周期調(diào)控因子p21的表達(dá)水平,探討其機(jī)制。

    由于現(xiàn)有的研究已經(jīng)明確miR-208a促進(jìn)CH的進(jìn)展,所以本研究未建立miR-208a轉(zhuǎn)基因小鼠模型,僅通過主動(dòng)脈縮窄手術(shù)建立CH的小鼠模型,以此檢測(cè)miR-208a和p21的表達(dá)水平。而且近年的研究表明,在大鼠心肌細(xì)胞中,通過AngⅡ或血清誘導(dǎo)細(xì)胞肥大損傷后,可以看到p21的表達(dá)下調(diào),細(xì)胞內(nèi)的DNA和蛋白質(zhì)合成增多,最終出現(xiàn)CH的表現(xiàn)[21-22]。結(jié)合本研究的結(jié)果,無論是蛋白質(zhì)水平,還是RNA水平,p21在CH的小鼠中表達(dá)均減少。提示p21可能參與CH的進(jìn)程。

    有學(xué)者通過高通量篩選能調(diào)控p21表達(dá)的miRNA發(fā)現(xiàn),28個(gè)miRNA中就包含了心臟特異性表達(dá)的miR-208a[11]。結(jié)合本研究的結(jié)果,在CH的小鼠中,miR-208a的表達(dá)增加,且與p21-mRNA負(fù)相關(guān)。提示miR-208a促進(jìn)CH的發(fā)生、發(fā)展可能是通過下調(diào)p21的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。因此,本研究還在體外設(shè)計(jì)了可穩(wěn)定表達(dá)miR-208a的心肌細(xì)胞株,通過對(duì)miR-208a過表達(dá)和抑制miR-208a的表達(dá)后,對(duì)心肌細(xì)胞株行Western-blot檢測(cè),發(fā)現(xiàn)miR-208a可以在轉(zhuǎn)錄后水平靶向負(fù)調(diào)控p21的表達(dá)。

    p21作為細(xì)胞周期負(fù)調(diào)控因子,下調(diào)p21的表達(dá),能夠促進(jìn)細(xì)胞周期G1-S期的轉(zhuǎn)化,促使細(xì)胞分裂增殖。但由于心肌細(xì)胞喪失了有絲分裂的能力,心肌細(xì)胞數(shù)量并不會(huì)增加,表現(xiàn)出的是體積增大(CH)。若miR-208a是通過下調(diào)p21的表達(dá)來促進(jìn)CH,miR-208a必然也能促進(jìn)細(xì)胞周期轉(zhuǎn)化。因此,本研究還對(duì)體外細(xì)胞株使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)miR-208a過表達(dá)后處于G1期的細(xì)胞數(shù)明顯減少,S期數(shù)量明顯增多,而抑制miR-208a表達(dá)后,這種趨勢(shì)不再存在。這與前期設(shè)想是一致的。

    綜上所述,本研究表明了miR-208a靶向負(fù)調(diào)控p21的表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞周期G1-S期轉(zhuǎn)化,以此參與CH的發(fā)生、發(fā)展過程,為CH的基因治療提供新思路。

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