• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    胞苷合成途徑改造對(duì)大腸桿菌嘧啶核苷發(fā)酵的影響

    2021-07-06 13:06:54劉益寧秦臻李旋蔣帥吳鶴云謝希賢
    食品與發(fā)酵工業(yè) 2021年12期
    關(guān)鍵詞:胞苷核苷嘧啶

    劉益寧,秦臻,李旋,蔣帥,吳鶴云,謝希賢,3*

    1(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院,天津,300457)2(天津科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,天津,300457) 3(代謝控制發(fā)酵技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室,天津,300457)

    嘧啶核苷包括尿嘧啶核苷(尿苷,uridine)和胞嘧啶核苷(胞苷,cytidine),廣泛應(yīng)用在食品、保健品、化妝品和醫(yī)藥等諸多行業(yè)。作為抗病毒抗腫瘤藥物的前體[1],嘧啶核苷是生物醫(yī)藥研究必不可少的原料。隨著抗病毒抗腫瘤藥物研發(fā)的深入以及嘧啶核苷功能性研究的不斷拓展,嘧啶核苷的市場(chǎng)需求不斷擴(kuò)大,迫切需要開(kāi)發(fā)廉價(jià)的可規(guī)?;瘧?yīng)用的嘧啶核苷生產(chǎn)工藝。微生物發(fā)酵法具有原料來(lái)源廣泛、生產(chǎn)效率高和環(huán)境友好可持續(xù)等諸多優(yōu)勢(shì)[2],是當(dāng)前嘧啶核苷生產(chǎn)研究的重點(diǎn)。

    嘧啶核苷的生物合成可分為3部分(圖1):首先谷氨酰胺、碳酸氫鹽、腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)、天冬氨酸和5-磷酸核糖-1-焦磷酸(5-phosphoribosyl 1-pyrophosphate,PRPP)等前體物質(zhì)經(jīng)6步酶促反應(yīng)生成尿苷酸(uridylic monophosphate,UMP),然后一部分UMP直接脫去磷酸基團(tuán)生成尿苷,一部分UMP則經(jīng)過(guò)一系列的磷酸化,胺化再去磷酸后生成胞苷[3]。該合成途徑會(huì)受到嚴(yán)謹(jǐn)?shù)恼{(diào)控,如在大腸桿菌中,嘧啶核苷操縱子基因轉(zhuǎn)錄會(huì)受到尿苷酸或者胞苷酸的反饋?zhàn)瓒簦掖呋谝徊椒磻?yīng)的氨甲酰磷酸合成酶的活性還受到UMP的反饋抑制[4-5]。另外,胞苷合成的關(guān)鍵酶UMP激酶和三磷酸胞苷(cytidine triphosphate,CTP)合酶的活性還分別受到三磷酸尿苷(uridine triphosphate,UTP)和CTP的反饋抑制[5]。嚴(yán)謹(jǐn)?shù)姆答佌{(diào)控機(jī)制,冗長(zhǎng)復(fù)雜的反應(yīng)過(guò)程以及對(duì)多種重要前體物的需求是限制嘧啶核苷生物合成的主要因素。早期研究中,通過(guò)誘變篩選結(jié)構(gòu)類(lèi)似物抗性菌株是選育嘧啶核苷生產(chǎn)菌的主要方法,但是誘變菌株往往存在負(fù)向突變的累積,菌株的持續(xù)改良也受限制[6-7]。隨著系統(tǒng)生物學(xué)的發(fā)展,代謝工程等理性構(gòu)建的方法逐漸成為工業(yè)菌株從頭構(gòu)建和持續(xù)改良的首選方法[8-9]。WU等[4]和FAN等[10]綜合運(yùn)用高通量篩選和代謝工程的方法構(gòu)建了1株產(chǎn)尿苷的菌株UR6,5 L罐上發(fā)酵64 h,可生產(chǎn)70.3 g/L的尿苷。YANG等[11]通過(guò)阻斷降解途徑,促進(jìn)關(guān)鍵酶的表達(dá),增強(qiáng)前體物的供應(yīng)等代謝工程策略的運(yùn)用,成功構(gòu)建產(chǎn)胞苷的工程菌株。但是現(xiàn)存胞苷工程菌株的發(fā)酵性能還較低,很難應(yīng)用于胞苷的工業(yè)化生產(chǎn)。

    優(yōu)化胞苷合成途徑,構(gòu)建高產(chǎn)胞苷的微生物細(xì)胞工廠,逐步提高菌株的胞苷發(fā)酵指標(biāo),對(duì)胞苷發(fā)酵生產(chǎn)意義重大。課題組前期構(gòu)建的尿苷高產(chǎn)菌UR6的UMP從頭合成途徑已經(jīng)得到了有效強(qiáng)化,本研究接著對(duì)UR6的胞苷合成途徑進(jìn)行了系統(tǒng)的代謝工程改造(圖1),期望通過(guò)強(qiáng)化胞苷合成途徑,將UR6逐步改造為胞苷的高產(chǎn)菌株。主要考察了阻斷胞苷及其前體物的降解途徑,過(guò)表達(dá)關(guān)鍵酶增強(qiáng)胞苷合成途徑,以及融合蛋白表達(dá)改變UMP分別到胞苷和尿苷的流量分配對(duì)大腸桿菌嘧啶核苷發(fā)酵的影響,為胞苷高產(chǎn)菌株的構(gòu)建提供新的借鑒和參考。

    圖1 嘧啶核苷生物合成途徑和本研究的代謝工程改造策略Fig.1 Biosynthetic pathway of pyrimidine nucleoside and the metabolic engineering strategies used in this study 注:CMP為胞嘧啶核苷酸(cytidine monophosphate);CDP為二磷酸胞苷(cytidine diphosphate);UDP為二磷酸尿苷(uridine diphosphate); TCA為三羧酸循環(huán)(tricarboxylic acid cycle);PPP為磷酸戊糖途徑(pentose phosphate pathway)

    1 材料與方法

    1.1 菌株和質(zhì)粒

    本研究所涉及的菌株和質(zhì)粒見(jiàn)表1。

    表1 本研究中涉及的菌株和質(zhì)粒Table 1 Bacterial strains and plasmids used in this study.

    1.2 主要試劑

    引物及基因,蘇州金唯智科技有限公司;Primer STAR HS DNA聚合酶,大連寶生物科技有限公司;2×Rapid Taq Mix、ClonExpress?Ⅱ One Step Cloning Kit,南京諾唯贊生物科技有限公司;質(zhì)??焖偬崛≡噭┖小NA凝膠純化回收試劑盒、胞苷和尿苷標(biāo)準(zhǔn)品,美國(guó)Omega公司;其余生化試劑為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

    1.3 培養(yǎng)基

    斜面培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖 1,蛋白胨 10,牛肉膏 10,酵母粉 5,NaCl 2.5,瓊脂 20。

    種子培養(yǎng)基(g/L):酵母粉 5,蛋白胨 3,KH2PO4·3H2O 1.2,MgSO4·7 H2O 0.5,F(xiàn)eSO4·7 H2O 0.01,MnSO4·H2O 0.01,苯酚紅 0.008,VB1、VB3、VB5、VB12、VH各0.001。

    發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):酵母粉 4,蛋白胨 5,檸檬酸鈉 2,KH2PO4·3 H2O 2,MgSO4·7 H2O 2, FeSO4·7 H2O 0.02,MnSO4·H2O 0.02,苯酚紅 0.008,VB1、VB3、VB5、VB12、VH各0.002。

    1.4 基因編輯方法

    本研究采用LI等[12]報(bào)道的CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因組編輯方法進(jìn)行工程菌株的構(gòu)建。該方法中CRISPR-Cas9系統(tǒng)包括pGRB和pREDCas9兩個(gè)質(zhì)粒,其中pREDCas9攜帶pGRB的消除系統(tǒng)、λ噬菌體的Red重組系統(tǒng)及Cas9蛋白表達(dá)系統(tǒng),攜帶奇霉素抗性(工作質(zhì)量濃度為100 mg/L),32 ℃培養(yǎng)。pGRB以pUC18為骨架,包含gRNA-Cas9結(jié)合區(qū)域序列和終止子序列,攜帶氨芐青霉素抗性(工作質(zhì)量濃度為100 mg/L),37 ℃培養(yǎng)。

    1.4.1 pGRB質(zhì)粒和重組片段的構(gòu)建

    為構(gòu)建含有不同靶位點(diǎn)序列的重組pGRB質(zhì)粒,首先使用工具CRISPR RGEN Tools選擇靶序列(PAM:5′-NGG-3′),設(shè)計(jì)合成2條完全反向互補(bǔ)的單鏈DNA,然后通過(guò)退火形成雙鏈DNA,該雙鏈DNA中間序列是靶位點(diǎn)的特定gRNA間隔序列,兩端序列與pGRB具有同源序列。利用ClonExpress?Ⅱ One Step Cloning Kit,將雙鏈DNA與線性化pGRB通過(guò)同源重組構(gòu)建出含有靶點(diǎn)序列的重組pGRB質(zhì)粒。

    構(gòu)建重組片段時(shí),先利用引物設(shè)計(jì)軟件primer 5,以待敲除基因或待整合位點(diǎn)的上下游序列為模板,設(shè)計(jì)上下游同源臂引物(擴(kuò)增長(zhǎng)度約400~500 bp)。以待整合基因?yàn)槟0?,設(shè)計(jì)整合基因的擴(kuò)增引物,擴(kuò)增上下游同源臂和目的基因片段后,通過(guò)重疊PCR的方法連接成重組片段。

    1.4.2 DNA片段重組

    制備出發(fā)菌株的感受態(tài)細(xì)胞,先將pREDCas9質(zhì)?;D(zhuǎn)至感受態(tài)細(xì)胞,平板培養(yǎng)并篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。將陽(yáng)性菌株接種到含LB培養(yǎng)基的搖管中培養(yǎng)12 h,再接種于2 XYT培養(yǎng)基(蛋白胨16 g/L,酵母粉10 g/L,NaCl 5 g/L,奇霉素100 mg/L)中培養(yǎng),待OD600值為0.1~0.2時(shí)加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷,OD600增至0.3~0.4時(shí)收集菌體,用10%(體積分?jǐn)?shù))的甘油洗滌,制備電轉(zhuǎn)化感受態(tài)。將重組pGRB質(zhì)粒和重組片段同時(shí)電轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞中,復(fù)蘇2 h后涂布在含氨芐青霉素和奇霉素抗性的LB平板上,32 ℃培養(yǎng)。待長(zhǎng)出單菌落后,通過(guò)菌落PCR篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子,再消除pGRB和pREDCas9質(zhì)粒,獲得目標(biāo)菌株。

    1.5 搖瓶培養(yǎng)方法

    用接種環(huán)刮取1環(huán)斜面種子接種于裝有30 mL種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中,9層紗布封口,37 ℃,200 r/min振蕩培養(yǎng)8 h;按10%接種量接種到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中(終體積為30 mL),9層紗布封口,37 ℃,200 r/min振蕩培養(yǎng);發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)補(bǔ)加氨水維持pH值為7.0~7.2;初始葡萄糖耗盡后,補(bǔ)加600 g/L葡萄糖溶液維持發(fā)酵進(jìn)行,發(fā)酵周期為24 h。

    1.6 檢測(cè)方法

    利用分光光度計(jì)測(cè)量發(fā)酵液在600 nm處的吸光度(OD600)表征生物量;采用HPLC對(duì)尿苷和胞苷濃度進(jìn)行定量分析:所用儀器為T(mén)hermo U3000,色譜柱為phenomenex Gemini 5u C18110A(150 mm×4.6 mm);流動(dòng)相為V(乙腈)∶V(水)=2∶98;流速為1.0 mL/min;柱溫為30 ℃;進(jìn)樣量為20 μL;紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)為270 nm。

    1.7 數(shù)據(jù)分析方法

    發(fā)酵數(shù)據(jù)代表3組平行發(fā)酵數(shù)據(jù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。利用T檢驗(yàn)雙尾分布對(duì)改造菌和對(duì)應(yīng)出發(fā)菌的2組發(fā)酵參數(shù)進(jìn)行單向方差分析?!?”表示P<0.05,說(shuō)明結(jié)果具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;“**”表示P<0.01,說(shuō)明結(jié)果具有極顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 阻斷胞苷及前體物降解途徑對(duì)嘧啶核苷發(fā)酵的影響

    阻斷降解途徑是促使目標(biāo)產(chǎn)物過(guò)量積累的重要方法。胞苷或尿苷可由核苷水解酶(rihA/B/C,UR6中此3個(gè)基因已被敲除)水解為胞嘧啶或尿嘧啶,也可被胞苷/尿苷激酶(udk,UR6中此基因也已敲除)磷酸化為CMP和UMP,同胞苷或者尿苷的合成方向相悖[4]。此外,胞苷還可被胞苷脫氨酶(cdd)降解為尿苷[13]。另外,胞苷合成的直接前體物CMP可在核苷酶(ygdH)的作用下降解為胞嘧啶[14],也可在胞苷酸激酶(cmk)的作用下磷酸化成CDP[15],是胞苷合成的逆向反應(yīng)。

    分別敲除UR6中的cdd,cmk和ygdH基因,構(gòu)建了菌株CYT1-1,CYT1-2和CYT1-3。搖瓶發(fā)酵結(jié)果如圖2所示,搖瓶發(fā)酵24 h后,4株菌的尿苷產(chǎn)量基本相同,且只有CYT1-1積累了0.2 g/L胞苷,說(shuō)明胞苷脫氨酶的敲除是胞苷積累的關(guān)鍵因素,而cmk基因和ygdH基因的單敲除對(duì)發(fā)酵結(jié)果基本無(wú)影響。逐一敲除CYT1-1的cmk和ygdH基因后,所得菌株CYT1-4和CYT1-5的胞苷產(chǎn)量分別提高1.3和2.8 g/L,尿苷產(chǎn)量變化不明顯。結(jié)果表明,胞苷脫氨酶催化的反應(yīng)是胞苷的主要降解途徑,同先前的研究報(bào)道相符[11]。而cmk基因和ygdH基因的敲除,切斷胞苷合成主要前體物質(zhì)CMP的主要分支代謝,有利于提高胞內(nèi)CMP的濃度,進(jìn)而促進(jìn)胞苷的生成。

    圖2 cdd、cmk和ygdH基因的敲除對(duì)嘧啶核苷 發(fā)酵的影響Fig.2 Effect of knockout of cdd, cmk and ygdH genes on pyrimidine nucleoside fermentation 注:“*”代表差異顯著(P<0.05);“**”代表差異極顯著(P<0.01)(下同)

    2.2 加強(qiáng)胞苷合成途徑對(duì)嘧啶核苷發(fā)酵的影響

    為進(jìn)一步提高胞苷產(chǎn)量,本研究接著對(duì)CYT1-5胞苷合成途徑的主要限速步驟進(jìn)行了強(qiáng)化。UMP由尿苷酸激酶(pyrH基因編碼)催化生成UDP是UMP合成胞苷的第一個(gè)限速步驟,而尿苷酸激酶的催化活性受三磷酸鳥(niǎo)苷 (guanosine triphosphate, GTP)的變構(gòu)激活和UTP的變構(gòu)抑制。研究表明,將大腸桿菌尿苷酸激酶第93位的天冬氨酸替換為丙氨酸可降低該酶與UTP的結(jié)合從而減弱尿苷酸激酶所受的反饋抑制作用[16]。胞苷合成途徑的第二個(gè)限速步驟是pyrG基因編碼的CTP合酶所催化的反應(yīng),該反應(yīng)受到CTP的反饋抑制。據(jù)報(bào)道,在谷氨酸棒狀桿菌的CTP合酶中引入3個(gè)位點(diǎn)的突變(D160E,E162A,E168K),所得CTP合酶突變體所受CTP的抑制作用大幅減弱[17]。另外,由nudG編碼的CTP二磷酸酶可催化CTP至CMP的反應(yīng)。強(qiáng)化nudG基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)理論上也有利于胞苷的生成。

    本研究首先在CYT1-5中的ilvG、tehB和yeeP3個(gè)假基因位點(diǎn)分別整合了PyrHecj(D93A)、PyrGcgl(D160E、E162、E168K)的編碼基因pyrH*和pyrG*,以及nudG基因,并都由啟動(dòng)子Ptrc啟動(dòng),構(gòu)建了菌株CYT2-1、CYT2-2和CYT2-3。搖瓶發(fā)酵結(jié)果如圖3所示,CYT2-1的胞苷和尿苷產(chǎn)量分別為4.2和7.4 g/L,相比于CYT1-5,胞苷產(chǎn)量提高了50%,尿苷產(chǎn)量降低了35.1%。另外,CYT2-1的OD600值為27.5,較CYT1-5降低了29%;CYT2-2的發(fā)酵結(jié)果同CYT1-5基本無(wú)變化;CYT2-3的胞苷產(chǎn)量為4.4 g/L,較CYT1-5提高了57.1%,而尿苷產(chǎn)量和OD600值與CYT1-5相比基本無(wú)變化。結(jié)果表明,PyrHecj(D93A)的表達(dá)有效促進(jìn)了胞苷的積累,但是中間代謝物如UDP或UTP的濃度也可能提高,從而造成代謝不平衡妨礙了菌體的生長(zhǎng);PyrGcgl(D160E、E162A、E168K)在CYT1-5中的表達(dá)對(duì)其嘧啶核苷的發(fā)酵基本無(wú)影響,分析可能是底物UTP供應(yīng)不足,于是本研究對(duì)PyrHecj(D93A)和PyrGcgl(D160E、E162A、E168K)進(jìn)行了組合表達(dá),構(gòu)建了菌株CYT2-4,搖瓶發(fā)酵結(jié)果顯示,CYT2-4的胞苷和尿苷產(chǎn)量分別為4.9和8.4 g/L,相較于CYT2-2,胞苷產(chǎn)量有了顯著提升,而尿苷產(chǎn)量和菌體生長(zhǎng)情況也得以恢復(fù),說(shuō)明這2個(gè)酶的組合過(guò)表達(dá)更有利于胞苷合成途徑的強(qiáng)化,有效促進(jìn)了胞苷的積累。最后在CYT2-4上對(duì)nudG基因進(jìn)行了雙拷貝,構(gòu)建了菌株CYT2-5,搖瓶結(jié)果顯示CYT2-5的胞苷和尿苷產(chǎn)量分別為5.6和9.3 g/L,OD600值為34.5。相較于CYT2-4,CYT2-5的胞苷產(chǎn)量提升了14.3%,尿苷產(chǎn)量提升了12.0%,菌體生長(zhǎng)基本無(wú)變化。

    圖3 pyrH*、pyrG*和nudG基因的整合對(duì) 嘧啶核苷發(fā)酵的影響Fig.3 Effect of integration of pyrH*、pyrG* and nudG genes on pyrimidine nucleoside fermentation

    突變體PyrHecj(D93A)和PyrGcgl(D160E、E162A、E168K)的組合表達(dá)以及內(nèi)源nudG基因表達(dá)的強(qiáng)化有效促進(jìn)了胞苷的積累。但是盡管胞苷產(chǎn)量得到了顯著提升,CYT2-5中主要產(chǎn)物仍舊是尿苷,需進(jìn)一步改變UMP的流量分配,將更多地UMP導(dǎo)向胞苷的合成。

    2.3 5′-核苷酸酶對(duì)嘧啶核苷發(fā)酵的影響

    從前述結(jié)果來(lái)看,在嘧啶核苷合成代謝中,尿苷是優(yōu)先合成的,原因可能有兩方面:一是因?yàn)榘蘸铣傻闹苯忧绑wCMP來(lái)源于尿苷合成的直接前體UMP,且UMP向CMP的合成還受到嚴(yán)謹(jǐn)?shù)恼{(diào)控,因此相比CMP,胞內(nèi)更容易積累UMP,從而有利于尿苷的合成;二是大腸桿菌中,5′-核苷酸酶的專(zhuān)一性較弱,嘌呤和嘧啶核苷酸都可被5′-核苷酸酶催化生成相應(yīng)的核苷,而且相對(duì)于胞苷酸,大腸桿菌中的5′-核苷酸酶可能對(duì)UMP的親和力更強(qiáng),因此在前體物UMP充足的條件下,細(xì)胞更容易積累尿苷。選擇對(duì)UMP親和力較弱,而對(duì)CMP具有更高親和力,甚至專(zhuān)一性結(jié)合CMP的5′-核苷酸酶會(huì)更有利于胞苷的合成。

    大腸桿菌中已被注釋的編碼5′-核苷酸酶的基因有4個(gè),分別是ushA、yrfG、yjjG和surE。為了驗(yàn)證這4個(gè)基因所編碼的4種5′-核苷酸酶對(duì)UMP和CMP的親和力,本研究首先將CYT2-5中ushA、yrfG、yjjG和surE4個(gè)基因進(jìn)行了組合敲除,構(gòu)建了只含1種5′-核苷酸酶的菌株CYT3-1、CYT3-2、CYT3-3和CYT3-4。搖瓶結(jié)果如圖4所示,由于3個(gè)5′-核苷酸酶基因的敲除會(huì)導(dǎo)致胞內(nèi)5′-核苷酸酶活力大幅降低,所以相對(duì)CYT2-5,4株菌的胞苷和尿苷產(chǎn)量都顯著降低,而且4株菌的胞苷產(chǎn)量在總的嘧啶核苷產(chǎn)量的占比也都呈現(xiàn)了明顯的降低趨勢(shì),說(shuō)明菌株自身的4種5′-核苷酸酶都對(duì)UMP表現(xiàn)出了更高的親和力。

    圖4 不同5′-核苷酸酶對(duì)嘧啶核苷發(fā)酵的影響Fig.4 Effect of different 5′-nucleotidases on pyrimidine nucleoside fermentation

    XU等[18]的研究報(bào)道指出,來(lái)源于酵母菌的5′-核苷酸酶(phm8基因編碼)對(duì)CMP的親和力更強(qiáng),于是本研究在CYT2-5的假基因mbhA位點(diǎn)上整合了酵母菌的phm8基因,構(gòu)建了菌株CYT3-5,發(fā)酵結(jié)果顯示,CYT3-5的尿苷產(chǎn)量為11.5 g/L,較CYT2-5提高了23.7%,但是胞苷產(chǎn)量變化不大。和XU等[18]的研究報(bào)道不同,5′-核苷酸酶PHM8在大腸桿菌中的表達(dá)顯著提高了尿苷的產(chǎn)量,可能的原因是CYT3-5胞內(nèi)UMP的濃度遠(yuǎn)高于CMP的濃度,UMP會(huì)競(jìng)爭(zhēng)性地與PHM8結(jié)合,從而有利于尿苷的生成。

    2.4 融合蛋白的表達(dá)對(duì)嘧啶核苷發(fā)酵的影響

    由于本研究所用出發(fā)菌株含有2個(gè)PyrF編碼基因,來(lái)源于枯草芽孢桿菌的pyrFbsu基因以及本源的pyrFecj基因,所以分別敲除CYT3-5中的pyrFbsu基因和pyrFecj基因,構(gòu)建了菌株CYT4-1和CYT4-2,以驗(yàn)證這2個(gè)基因?qū)︵奏ず塑蘸铣伤鸬淖饔?。搖瓶結(jié)果如圖5所示,3株菌的生長(zhǎng)情況基本相同;相比于CYT3-5,CYT4-1的胞苷和尿苷產(chǎn)量變化不大,而CYT4-2的胞苷產(chǎn)量和尿苷產(chǎn)量都有了顯著下降,表明CYT3-5自身的PyrF對(duì)嘧啶核苷合成起主要的作用。于是本研究選擇將PyrFecj同尿苷酸激酶突變體PyrHecj(D93A)進(jìn)行了融合表達(dá)??紤]到融合蛋白中2個(gè)功能蛋白在表達(dá)過(guò)程中的先后順序?qū)φw催化效率的影響,本研究構(gòu)建了2個(gè)融合蛋白:PyrFecj-(Gly4Ser)3-PyrHecj(D93A)和PyrHecj(D93A)-(Gly4Ser)3-PyrFecj。對(duì)應(yīng)的編碼基因分別為pyrFecj-[(GGT)4(TCA)]3-pyrH*和pyrH*-[(GGT))4(TCA)]3-pyrFecj(前一個(gè)蛋白編碼基因的終止密碼子已去除)。將這2個(gè)基因分別整合在CYT4-2的假基因yjiT位點(diǎn),并由啟動(dòng)子Ptrc啟動(dòng),構(gòu)建了菌株CYT4-3和CYT4-4。另外在CYT3-5中的相同位點(diǎn)整合了pyrH*基因,構(gòu)建菌株CYT4-5。將CYT3-5、CYT4-3、CYT4-4和CYT4-5進(jìn)行搖瓶發(fā)酵,結(jié)果如圖5所示,這幾株菌的生長(zhǎng)情況基本無(wú)差別;CYT4-3的胞苷和尿苷產(chǎn)量分別為5.9和11.9 g/L,和CYT3-5相比,胞苷產(chǎn)量提高了7.2%,尿苷產(chǎn)量降低了6.1%;CYT4-4的胞苷和尿苷產(chǎn)量分別為7.2和8.2 g/L,和CYT3-5相比,胞苷產(chǎn)量提高了30.9%,尿苷產(chǎn)量降低了28.7%;CYT4-5的胞苷和尿苷產(chǎn)量分別為6.2和8.8 g/L,較CYT3-5相比,胞苷產(chǎn)量提高了14.8%,尿苷產(chǎn)量降低了23.5%。

    圖5 PyrF和PyrH融合表達(dá)對(duì)嘧啶核苷發(fā)酵的影響Fig.5 Effect of fusion expression of PyrF and PyrH on pyrimidine nucleoside fermentation

    結(jié)果表明,pyrH*基因表達(dá)的強(qiáng)化和融合蛋白的表達(dá),都有利于UMP流向胞苷的合成,從而促進(jìn)胞苷的積累,降低尿苷的合成。比較而言,融合蛋白的表達(dá)對(duì)胞苷的合成更有利,且PyrHecj(D93A)-(Gly4Ser)3-PyrFecj的表達(dá)效果更好。融合蛋白的表達(dá)之所以比pyrH*基因的單獨(dú)過(guò)表達(dá)效果更為顯著,原因可能在于pyrH*基因的單獨(dú)過(guò)表達(dá)只是通過(guò)提高胞內(nèi)PyrHecj(D93A)的酶量,促進(jìn)UMP流向胞苷的合成,而融合蛋白的表達(dá)不僅增加了胞內(nèi)PyrHecj(D93A)的酶量,還通過(guò)融合蛋白所具有的“鄰近效應(yīng)”使PyrHecj(D93A)與其相融合的PyrFecj所催化的產(chǎn)物UMP有更高的碰撞幾率,從而更有效地促進(jìn)了胞苷合成前體物UTP的合成,顯著促進(jìn)了胞苷的積累,相應(yīng)地,UMP流向尿苷的合成通量顯著降低。

    3 討論與結(jié)論

    UR6是1株經(jīng)過(guò)系統(tǒng)代謝工程改造所得的尿苷高產(chǎn)菌株,其UMP合成途徑較強(qiáng),適合作為構(gòu)建胞苷高產(chǎn)菌株的出發(fā)菌株。為將UR6由只產(chǎn)尿苷的菌株改造為胞苷高產(chǎn)菌,本研究從4個(gè)方面入手,對(duì)UR6的胞苷合成途徑進(jìn)行了系統(tǒng)改造。

    (1)阻斷胞苷及其前體物的降解途徑。cdd基因的敲除切斷了胞苷的主要降解途徑,使菌株開(kāi)始積累胞苷。cmk基因和ygdH基因的敲除切斷了胞苷合成途徑中的主要支路途徑,減少了胞苷合成前體物的額外消耗,也促進(jìn)了胞苷的積累。(2)組合強(qiáng)化胞苷合成關(guān)鍵酶的表達(dá)。本研究引入了調(diào)控作用減弱的UMP激酶和CTP合酶突變體,并對(duì)本源的CTP二磷酸酶的編碼基因進(jìn)行了雙拷貝,通過(guò)關(guān)鍵酶的組合表達(dá)有效地加強(qiáng)了胞苷的合成途徑,使得胞苷的產(chǎn)量大幅提升。(3)比較不同5′-核苷酸酶對(duì)嘧啶核苷發(fā)酵的影響。尿苷和胞苷合成途徑的競(jìng)爭(zhēng)主要在于5′-核苷酸酶所催化的反應(yīng)。本研究構(gòu)建了只含其中1種5′-核苷酸酶的菌株,考察了大腸桿菌自身的4種核苷酸酶分別在嘧啶核苷發(fā)酵中所起的作用。結(jié)果證實(shí)這4種核苷酸酶的專(zhuān)一性較差,并且相對(duì)于CMP,4種核苷酸酶都更傾向于和UMP結(jié)合,從而催化其合成尿苷。PHM8是來(lái)源于酵母菌的5′-核苷酸酶,先前有報(bào)道稱(chēng)其對(duì)CMP有更高的親和力。但是和報(bào)道的結(jié)果不同,該酶在大腸桿菌的表達(dá),顯著促進(jìn)了尿苷的積累,而對(duì)胞苷積累的影響不大。說(shuō)明在UMP相對(duì)過(guò)量的條件下,PHM8還是優(yōu)先結(jié)合UMP,催化其生成尿苷。(4)通過(guò)蛋白的融合表達(dá)增強(qiáng)胞苷合成。本研究將乳清酸核苷-5-磷酸脫羧酶同尿苷酸激酶進(jìn)行融合表達(dá),利用融合蛋白的“鄰近效應(yīng)”,促進(jìn)前體物UMP流向胞苷的合成,使胞苷的產(chǎn)量得到了顯著提升。

    最終所得菌株CYT4-4搖瓶發(fā)酵24 h可積累7.2 g/L胞苷和8.2 g/L尿苷,說(shuō)明本研究通過(guò)對(duì)胞苷合成途徑的一系列改造,成功改變了UMP向胞苷和尿苷合成的流量分配,使約46.7%的UMP流向了胞苷的合成。多種可分離產(chǎn)物的聯(lián)產(chǎn)是提高原料利用率、降低發(fā)酵生產(chǎn)成本的有效方法[24]。胞苷和尿苷可以通過(guò)色譜分離等技術(shù)進(jìn)行分離純化,因此該菌可用來(lái)聯(lián)產(chǎn)尿苷和胞苷,具有一定的工業(yè)化應(yīng)用價(jià)值。為進(jìn)一步提升胞苷產(chǎn)量,最終獲得只高產(chǎn)胞苷的工程菌,需要繼續(xù)強(qiáng)化菌株的胞苷合成途徑,如篩選對(duì)CMP有更高親和力甚至專(zhuān)一親和CMP的5′-核苷酸酶和完全解調(diào)控的UMP激酶和CTP合酶等。

    猜你喜歡
    胞苷核苷嘧啶
    Gilteritinib聯(lián)合阿扎胞苷 vs. 單用阿扎胞苷治療新診斷的FLT3mut+AML
    阿扎胞苷對(duì)中高危骨髓增生異常綜合征的臨床有效性及安全性探討
    紫紅獐牙菜對(duì)四氧嘧啶性糖尿病小鼠的降糖作用
    三七青黛膏預(yù)防阿扎胞苷皮下注射治療所致不良反應(yīng)的效果觀察
    磺胺嘧啶銀混懸液在二度燒傷創(chuàng)面治療中的應(yīng)用
    阿扎胞苷治療MDS的研究進(jìn)展
    RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定猴頭菌片中5種核苷
    中成藥(2017年5期)2017-06-13 13:01:12
    HPLC法同時(shí)測(cè)定新疆貝母中3種核苷類(lèi)成分
    中成藥(2017年5期)2017-06-13 13:01:12
    N-甲基嘧啶酮類(lèi)化合物的綠色合成研究
    蛹蟲(chóng)草中4種核苷的含量分析
    国产成人福利小说| 亚洲精品,欧美精品| 最近中文字幕2019免费版| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 秋霞伦理黄片| 成人美女网站在线观看视频| 观看免费一级毛片| 国产高清三级在线| 亚洲av在线观看美女高潮| 亚洲久久久久久中文字幕| 国产91av在线免费观看| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 久久99热6这里只有精品| 欧美丝袜亚洲另类| 女人被狂操c到高潮| 女人被狂操c到高潮| 免费看av在线观看网站| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 亚洲美女搞黄在线观看| 精品人妻一区二区三区麻豆| 老女人水多毛片| 十八禁国产超污无遮挡网站| 观看免费一级毛片| av在线老鸭窝| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 中文字幕av在线有码专区| 午夜免费男女啪啪视频观看| 免费看不卡的av| 日韩国内少妇激情av| 搞女人的毛片| 少妇熟女aⅴ在线视频| 看免费成人av毛片| 久久久久久久久久久免费av| av福利片在线观看| 肉色欧美久久久久久久蜜桃 | 天天躁日日操中文字幕| 好男人视频免费观看在线| 97热精品久久久久久| 亚洲综合精品二区| 一区二区三区乱码不卡18| 毛片女人毛片| 简卡轻食公司| 国产视频内射| 18禁动态无遮挡网站| 久久精品国产亚洲av天美| 国产大屁股一区二区在线视频| 日本一本二区三区精品| 精品国内亚洲2022精品成人| 成人欧美大片| 中文字幕av在线有码专区| 欧美激情国产日韩精品一区| 国产精品.久久久| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 寂寞人妻少妇视频99o| 男女边摸边吃奶| 日韩欧美精品v在线| 国内揄拍国产精品人妻在线| 亚洲精品色激情综合| 亚洲欧洲日产国产| 观看美女的网站| 国产精品久久久久久av不卡| 免费观看的影片在线观看| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 色视频www国产| 午夜精品国产一区二区电影 | 亚洲欧美清纯卡通| 51国产日韩欧美| 91精品国产九色| 日日啪夜夜爽| 免费人成在线观看视频色| 日韩成人伦理影院| 免费无遮挡裸体视频| 免费观看av网站的网址| 午夜日本视频在线| 国产一区二区在线观看日韩| 日韩欧美三级三区| 久久久精品94久久精品| 久久精品久久精品一区二区三区| 欧美日韩国产mv在线观看视频 | 纵有疾风起免费观看全集完整版 | 久久综合国产亚洲精品| 国产精品久久久久久av不卡| 亚洲国产精品成人久久小说| 嘟嘟电影网在线观看| 国产日韩欧美在线精品| 18+在线观看网站| 少妇高潮的动态图| 欧美xxⅹ黑人| 国产亚洲5aaaaa淫片| 国产伦精品一区二区三区视频9| 亚洲精品色激情综合| 国产高清国产精品国产三级 | 亚洲电影在线观看av| 亚洲av日韩在线播放| 国产一区二区三区av在线| 亚洲综合色惰| 嫩草影院精品99| 午夜免费激情av| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 午夜老司机福利剧场| 秋霞在线观看毛片| 久久久久久久久久久丰满| 少妇的逼水好多| 伊人久久精品亚洲午夜| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 岛国毛片在线播放| 欧美三级亚洲精品| 成人国产麻豆网| 日本爱情动作片www.在线观看| av女优亚洲男人天堂| 欧美 日韩 精品 国产| 赤兔流量卡办理| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 日韩av在线大香蕉| 如何舔出高潮| 免费看光身美女| 亚洲乱码一区二区免费版| 亚洲国产欧美人成| 男人爽女人下面视频在线观看| 一级av片app| 搞女人的毛片| 人人妻人人澡欧美一区二区| 亚洲av.av天堂| 一级毛片久久久久久久久女| 亚洲综合精品二区| 女人被狂操c到高潮| 日韩电影二区| 国产精品.久久久| 婷婷色麻豆天堂久久| 日日撸夜夜添| 在线观看美女被高潮喷水网站| 久久久久九九精品影院| 麻豆av噜噜一区二区三区| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 欧美+日韩+精品| 禁无遮挡网站| 超碰97精品在线观看| 日韩电影二区| 成人亚洲欧美一区二区av| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 午夜亚洲福利在线播放| 好男人在线观看高清免费视频| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 国产亚洲精品av在线| 精品熟女少妇av免费看| av国产免费在线观看| 少妇的逼好多水| 一个人观看的视频www高清免费观看| 精品人妻熟女av久视频| 国产乱人偷精品视频| 人妻一区二区av| 永久免费av网站大全| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 成人漫画全彩无遮挡| 在现免费观看毛片| 久久久久久久国产电影| 亚洲精品一二三| 成人毛片60女人毛片免费| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 久久久精品欧美日韩精品| 午夜精品在线福利| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 人妻一区二区av| 国产爱豆传媒在线观看| 国产成人免费观看mmmm| 日本av手机在线免费观看| 国产美女午夜福利| 国产 一区 欧美 日韩| 精品少妇黑人巨大在线播放| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 国产亚洲精品久久久com| 欧美日韩亚洲高清精品| 国产又色又爽无遮挡免| 国内精品美女久久久久久| 久久这里只有精品中国| 欧美性感艳星| 午夜爱爱视频在线播放| 在线观看人妻少妇| 亚洲欧美日韩东京热| 2022亚洲国产成人精品| 国产男人的电影天堂91| 欧美成人a在线观看| 欧美丝袜亚洲另类| 天堂网av新在线| h日本视频在线播放| 亚洲欧美日韩无卡精品| 淫秽高清视频在线观看| 久久久久网色| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 高清视频免费观看一区二区 | 国内精品宾馆在线| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 边亲边吃奶的免费视频| av免费在线看不卡| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 成人亚洲精品av一区二区| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 国内精品美女久久久久久| 精华霜和精华液先用哪个| 久久这里只有精品中国| av在线播放精品| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 亚洲最大成人中文| 国产亚洲5aaaaa淫片| 一级a做视频免费观看| 免费观看的影片在线观看| 精品久久久久久久久久久久久| 欧美不卡视频在线免费观看| 亚洲精品日韩av片在线观看| 嫩草影院精品99| 亚洲人与动物交配视频| 精品国内亚洲2022精品成人| 成年女人看的毛片在线观看| 日日撸夜夜添| 欧美日韩国产mv在线观看视频 | 国国产精品蜜臀av免费| 久久国内精品自在自线图片| 99久久人妻综合| 一个人看的www免费观看视频| 欧美日韩精品成人综合77777| 天美传媒精品一区二区| 麻豆av噜噜一区二区三区| 亚洲无线观看免费| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 有码 亚洲区| 精品人妻熟女av久视频| 日韩一区二区视频免费看| 91久久精品电影网| 亚洲av福利一区| 午夜福利视频1000在线观看| 最近最新中文字幕大全电影3| 九九在线视频观看精品| 精品一区二区免费观看| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 大香蕉久久网| 美女主播在线视频| 日韩成人av中文字幕在线观看| 啦啦啦啦在线视频资源| 人妻一区二区av| 中文欧美无线码| 69人妻影院| 高清毛片免费看| 亚洲成色77777| 国产成人91sexporn| 美女内射精品一级片tv| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 黄色配什么色好看| 男人舔女人下体高潮全视频| 丝袜美腿在线中文| 丝袜喷水一区| 寂寞人妻少妇视频99o| av又黄又爽大尺度在线免费看| 国内精品宾馆在线| 国产探花在线观看一区二区| 国产免费一级a男人的天堂| 亚洲内射少妇av| 最近2019中文字幕mv第一页| av专区在线播放| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 丰满乱子伦码专区| 亚洲成人一二三区av| 国产成人freesex在线| 欧美日韩精品成人综合77777| 国产av国产精品国产| 欧美极品一区二区三区四区| 国产毛片a区久久久久| 亚洲av成人精品一二三区| 亚洲国产最新在线播放| 亚洲天堂国产精品一区在线| 亚洲国产高清在线一区二区三| 美女黄网站色视频| 五月天丁香电影| 免费观看精品视频网站| 国产免费一级a男人的天堂| 色哟哟·www| 青春草国产在线视频| 国产探花极品一区二区| 日本午夜av视频| 男女视频在线观看网站免费| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 大香蕉久久网| 七月丁香在线播放| 国产片特级美女逼逼视频| 午夜精品一区二区三区免费看| 我的老师免费观看完整版| 丰满乱子伦码专区| 国产69精品久久久久777片| 免费看光身美女| 搡女人真爽免费视频火全软件| 国产在视频线精品| 成人欧美大片| 蜜臀久久99精品久久宅男| 嫩草影院新地址| 别揉我奶头 嗯啊视频| 夫妻性生交免费视频一级片| 高清日韩中文字幕在线| 老司机影院成人| 中文字幕av在线有码专区| 亚洲乱码一区二区免费版| 91在线精品国自产拍蜜月| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 床上黄色一级片| 国产乱来视频区| 国产伦一二天堂av在线观看| 男女下面进入的视频免费午夜| 能在线免费看毛片的网站| 日韩电影二区| 国产永久视频网站| 深爱激情五月婷婷| 久久久久久久国产电影| 熟女电影av网| 午夜激情久久久久久久| 国产黄色视频一区二区在线观看| av专区在线播放| 精华霜和精华液先用哪个| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 午夜精品一区二区三区免费看| 午夜日本视频在线| 欧美激情国产日韩精品一区| eeuss影院久久| 禁无遮挡网站| 免费看不卡的av| 男女下面进入的视频免费午夜| 久久久久九九精品影院| 午夜免费观看性视频| 哪个播放器可以免费观看大片| 嫩草影院入口| 联通29元200g的流量卡| 日本色播在线视频| 美女cb高潮喷水在线观看| 蜜桃久久精品国产亚洲av| av.在线天堂| 听说在线观看完整版免费高清| 中文字幕免费在线视频6| 亚洲第一区二区三区不卡| 国产成人精品婷婷| 成人鲁丝片一二三区免费| 久久久久久久久久人人人人人人| 2018国产大陆天天弄谢| 又爽又黄无遮挡网站| 欧美区成人在线视频| 久久久精品94久久精品| 婷婷色av中文字幕| 最近中文字幕2019免费版| 久久精品综合一区二区三区| 亚洲av不卡在线观看| 寂寞人妻少妇视频99o| 国产综合精华液| 最近最新中文字幕大全电影3| 男人舔奶头视频| 午夜福利视频精品| 欧美97在线视频| 91aial.com中文字幕在线观看| 久久午夜福利片| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 男人舔女人下体高潮全视频| 好男人在线观看高清免费视频| 免费看光身美女| 精品午夜福利在线看| a级毛色黄片| 在线天堂最新版资源| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 亚洲av在线观看美女高潮| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 两个人视频免费观看高清| 国产成人a区在线观看| 国产精品福利在线免费观看| 丰满少妇做爰视频| 人人妻人人看人人澡| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 能在线免费观看的黄片| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 丰满人妻一区二区三区视频av| 日本黄色片子视频| 亚洲国产高清在线一区二区三| 一夜夜www| 黄色欧美视频在线观看| 欧美日韩精品成人综合77777| 好男人在线观看高清免费视频| 九草在线视频观看| 床上黄色一级片| 国产久久久一区二区三区| 日韩一本色道免费dvd| 国产成人a∨麻豆精品| 日韩欧美一区视频在线观看 | 一级毛片电影观看| 免费av不卡在线播放| 国产成人福利小说| 亚洲不卡免费看| 神马国产精品三级电影在线观看| 日韩欧美精品免费久久| 十八禁网站网址无遮挡 | 在线观看免费高清a一片| 午夜免费观看性视频| 热99在线观看视频| 久久精品国产亚洲网站| 最近中文字幕2019免费版| 青春草亚洲视频在线观看| 久久久久久久久久久丰满| 只有这里有精品99| 禁无遮挡网站| 日韩国内少妇激情av| 国产成人福利小说| 亚洲美女搞黄在线观看| 亚洲av中文av极速乱| 男插女下体视频免费在线播放| 十八禁网站网址无遮挡 | 久久韩国三级中文字幕| 久久久精品免费免费高清| 成人国产麻豆网| 国产乱来视频区| 天堂中文最新版在线下载 | 亚州av有码| 极品教师在线视频| 中文字幕av成人在线电影| 好男人视频免费观看在线| 国产午夜精品论理片| 亚洲精品色激情综合| 精品久久久久久成人av| 午夜福利在线在线| 一本一本综合久久| 白带黄色成豆腐渣| 欧美性感艳星| 国产淫语在线视频| 婷婷六月久久综合丁香| 人妻系列 视频| 天堂中文最新版在线下载 | xxx大片免费视频| 亚洲国产成人一精品久久久| 国产爱豆传媒在线观看| 丰满少妇做爰视频| 亚洲最大成人中文| 久久精品综合一区二区三区| 乱码一卡2卡4卡精品| 哪个播放器可以免费观看大片| 成人性生交大片免费视频hd| 欧美日韩综合久久久久久| 日本爱情动作片www.在线观看| 久久久精品免费免费高清| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 久久精品人妻少妇| 一本一本综合久久| 国产精品一区二区在线观看99 | 如何舔出高潮| 国产极品天堂在线| av女优亚洲男人天堂| 高清午夜精品一区二区三区| 午夜福利视频精品| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 欧美性感艳星| 亚洲人成网站在线观看播放| 国产成人精品婷婷| 国产综合懂色| 亚洲伊人久久精品综合| 亚洲国产精品国产精品| 国产成人免费观看mmmm| 嫩草影院精品99| 韩国高清视频一区二区三区| 日本黄大片高清| 男女视频在线观看网站免费| 久久精品国产亚洲av涩爱| 国产精品爽爽va在线观看网站| 免费观看精品视频网站| 99久久中文字幕三级久久日本| 精品久久久久久成人av| 亚洲欧美精品专区久久| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 亚洲电影在线观看av| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 99久久九九国产精品国产免费| av在线天堂中文字幕| 日韩一区二区视频免费看| 中文精品一卡2卡3卡4更新| av女优亚洲男人天堂| 欧美97在线视频| 两个人的视频大全免费| 国产国拍精品亚洲av在线观看| av女优亚洲男人天堂| 99久久精品一区二区三区| 中文天堂在线官网| 夫妻午夜视频| 亚洲精品成人av观看孕妇| 欧美日本视频| 欧美日韩在线观看h| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 我的老师免费观看完整版| 国产在视频线精品| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 日韩成人av中文字幕在线观看| 欧美高清成人免费视频www| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 久久久欧美国产精品| 青青草视频在线视频观看| 日韩在线高清观看一区二区三区| 一级毛片 在线播放| 亚洲av在线观看美女高潮| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 免费黄网站久久成人精品| 国产真实伦视频高清在线观看| 嘟嘟电影网在线观看| 欧美日韩精品成人综合77777| 欧美极品一区二区三区四区| 精品国产三级普通话版| 久久久久久久大尺度免费视频| 少妇被粗大猛烈的视频| 欧美成人午夜免费资源| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 99久久人妻综合| 日本wwww免费看| 高清在线视频一区二区三区| 婷婷六月久久综合丁香| 极品少妇高潮喷水抽搐| 亚洲怡红院男人天堂| 99热这里只有精品一区| 男女下面进入的视频免费午夜| 欧美成人精品欧美一级黄| 3wmmmm亚洲av在线观看| 午夜精品国产一区二区电影 | 黄色日韩在线| 国模一区二区三区四区视频| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 精品不卡国产一区二区三区| 国产成人a∨麻豆精品| 国产男女超爽视频在线观看| 久久久久九九精品影院| 身体一侧抽搐| 午夜老司机福利剧场| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 最近手机中文字幕大全| 高清午夜精品一区二区三区| 性插视频无遮挡在线免费观看| 久久久久久久久久久免费av| 美女内射精品一级片tv| .国产精品久久| 国产成人a∨麻豆精品| 大香蕉久久网| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 在线天堂最新版资源| 好男人在线观看高清免费视频| 在线天堂最新版资源| 午夜老司机福利剧场| 插逼视频在线观看| 日韩欧美精品免费久久| 亚洲成人av在线免费| 国产精品久久视频播放| 九九在线视频观看精品| 亚洲最大成人手机在线| 永久免费av网站大全| 亚洲成人久久爱视频| 日韩av在线免费看完整版不卡| 国产黄色视频一区二区在线观看| 人人妻人人澡欧美一区二区| 国产69精品久久久久777片| 久久国产乱子免费精品| 麻豆乱淫一区二区| 国产永久视频网站| 午夜激情欧美在线| 亚洲乱码一区二区免费版| 国产一级毛片在线| 婷婷色综合大香蕉| 别揉我奶头 嗯啊视频| 男人舔女人下体高潮全视频| 亚洲国产精品国产精品| 亚洲av免费在线观看| 免费观看精品视频网站| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 日韩电影二区| 偷拍熟女少妇极品色| 国产伦精品一区二区三区四那| 淫秽高清视频在线观看| 中文资源天堂在线| 啦啦啦中文免费视频观看日本| av天堂中文字幕网| 午夜精品在线福利| 午夜日本视频在线| 婷婷色av中文字幕| 欧美日韩精品成人综合77777| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 欧美精品国产亚洲| 少妇的逼水好多| 日本av手机在线免费观看| 亚洲成色77777| 麻豆成人午夜福利视频| 只有这里有精品99| 午夜福利成人在线免费观看| 美女国产视频在线观看| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 久久久精品欧美日韩精品| 黄色配什么色好看| 婷婷色综合www| 日日啪夜夜撸| av线在线观看网站| 九色成人免费人妻av| 日韩成人伦理影院| 国产成人a∨麻豆精品| 国内精品美女久久久久久| 久久精品夜色国产| 久久亚洲国产成人精品v| 人妻系列 视频| 全区人妻精品视频| 国产人妻一区二区三区在| 街头女战士在线观看网站| 国产精品久久久久久久久免| 色综合亚洲欧美另类图片| 国产免费又黄又爽又色| 99九九线精品视频在线观看视频| 伊人久久精品亚洲午夜|