miR-144靶向Bcl-2抑制兒童急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞增殖并促進(jìn)凋亡的分子機(jī)制研究

魏 偉 杜建慧 朱 航 李俊蘭 吳 瑩

兒童急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)為兒童常見(jiàn)的惡性腫瘤，其發(fā)病率呈逐年增加趨勢(shì)[1]。由于早期診斷和治療策略的進(jìn)步，近10年間其5年生存率從50%上升到90%。但仍有部分患者存在預(yù)后不良或復(fù)發(fā)[2-4]。因此，目前仍需要有效的藥物防治兒童ALL。miRNAs為一類長(zhǎng)度為19-25個(gè)核苷酸組成的非編碼小RNA分子,其通過(guò)抑制靶基因mRNA的翻譯調(diào)控基因表達(dá)。miR-144與肺癌、腎癌、前列腺癌、甲狀腺癌等多種癌癥均有關(guān)[5,6],也有報(bào)道顯示，miR-144在兒童ALL中低表達(dá)[7]，但其具體作用機(jī)制尚未完全清楚。細(xì)胞凋亡是調(diào)節(jié)體內(nèi)細(xì)胞新陳代謝平衡的生理機(jī)制，凋亡障礙是腫瘤發(fā)生的重要分子機(jī)制之一[8]。大量研究已證實(shí)，Bcl-2作為抑凋亡因子在很多腫瘤中發(fā)揮作用[9]。有研究報(bào)道，Bcl-2在B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞白血病中高表達(dá)[10]，但其在兒童ALL中的作用機(jī)制尚未完全清楚。本研究將檢測(cè)非惡性血液病患兒骨髓組織、ALL患兒骨髓組織、人T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞(CEM/C1細(xì)胞)及其它ALL癌細(xì)胞珠(MOLT-4細(xì)胞和CCRF-CEM細(xì)胞)中miR-144、Bcl-2的表達(dá)，觀察過(guò)表達(dá)miR-144、沉默Bcl-2、過(guò)表達(dá)Bcl-2對(duì)CEM/C1細(xì)胞增殖、凋亡的影響，并初步探討其作用機(jī)制，為兒童ALL的治療提供新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑和儀器

CEM/C1(編號(hào)：CVCL_3496)、MOLT-4(編號(hào)：CVCL_0013)、CCRF-CEM(編號(hào)：CVCL_0207)購(gòu)自ATCC；miR-NC、miR-144 mimics、inhibitor NC、miR-144 inhibitor、si-NC、si-Bcl-2、pcDNA 3.1質(zhì)粒均由自北京金唯智公司設(shè)計(jì)合成；Annexin V- /FITC凋亡檢測(cè)試劑盒(貨號(hào):SU3616)購(gòu)自上海蔚霆生物科技有限公司；RIPA蛋白裂解液(貨號(hào):116KDl27)、RPMI1640培養(yǎng)基(貨號(hào):C22400500BT)、胎牛血清(貨號(hào):F9423)均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；脂質(zhì)體LipofectamineTM2000(貨號(hào):11668-027)購(gòu)自Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào):K1622)購(gòu)于大連Takara公司；MTT檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)：M1020)購(gòu)自武漢艾美捷科技有限公司；Bcl-2蛋白Western blot檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)：SNM464)購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司。

1.2 組織、細(xì)胞分組與處理

1.2.1未轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)與分組：用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，于37 ℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)CEM/C1細(xì)胞(CEM/C1組)、MOLT-4細(xì)胞(MOLT-4組)、CCRF-CEM細(xì)胞(CCRF-CEM組)。每2-3天更換培養(yǎng)液或消化傳代一次。本院確診的20例ALL患兒骨髓組織為ALL組，10例非惡性血液病患兒骨髓組織為Normal組。

1.2.2CEM/C1細(xì)胞質(zhì)粒轉(zhuǎn)染與分組：將miR-NC、miR-144 mimics、inhibitor NC、miR-144 inhibitor、si-NC、si-Bcl-2、miR-144+pcDNA 3.1、miR-144+pcDNA 3.1-Bcl-2用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染CEM/C1細(xì)胞，分別標(biāo)記為miR-NC組、miR-144組、inhibitor NC組、miR-144 inhibitor組、si-NC組、si-Bcl-2組、miR-144+Vector組、miR-144+Bcl-2組。轉(zhuǎn)染成功后，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

1.3.1MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖率：取適量1.2.2各組細(xì)胞，分別培養(yǎng)0h、24h、48h、72h，加入20μl(5g/L)MTT溶液，常規(guī)培養(yǎng)4h，棄去上清，再加入150μl DMSO，震蕩使結(jié)晶溶解，在490nm波長(zhǎng)下測(cè)量細(xì)胞吸光度值(A)；每組設(shè)5個(gè)重復(fù)孔。細(xì)胞增殖率(%)=[A490樣品/A490對(duì)照-1] ×100 %。

1.3.2qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-144、Bcl-2 mRNA水平：取適量細(xì)胞，Trizol法裂解細(xì)胞，RNA抽提試劑盒提取RNA并定量。立即用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,采用qRT-PCR試劑盒進(jìn)行miR-144、Bcl-2 mRNA水平檢測(cè)，所有操作嚴(yán)格按試劑及儀器說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，以GAPDH、U6作為內(nèi)參，用2-△△Ct法計(jì)算定量結(jié)果。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.3Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Bcl-2蛋白：取適量細(xì)胞或骨髓液，用RIPA裂解后，提取總蛋白，BCA法蛋白定量后變性，然后進(jìn)行SDS蛋白電泳，之后進(jìn)行PVDF轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉2h后加入Ⅰ抗(1∶500)4℃孵育過(guò)夜。次日，洗膜后用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗(1∶1 000)37 ℃孵育2h。結(jié)束后加入顯影混合液，顯影曝光。β-actin為內(nèi)參，以Bcl-2與β-actin條帶灰度值的比值表示Bcl-2蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.3.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡：取適量1.2.2各組細(xì)胞，用預(yù)冷的 PBS 洗滌3 次，結(jié)合緩沖液(500μl)懸浮細(xì)胞，加5μl Annexin V-/FITC和5μl PI(20mg/ml)，混勻，室溫避光15min。每個(gè)樣品重復(fù)3次。第二象限PI染色的細(xì)胞為晚期凋亡細(xì)胞，第一象限Annexin V染色的細(xì)胞為早期凋亡細(xì)胞。細(xì)胞總凋亡率(%)=早期凋亡率(Annexin V+/PI-)+晚期凋亡率 (Annexin V+/PI+)。

1.3.5雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)細(xì)胞熒光素酶活性：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期1.2.2各組細(xì)胞，用Trizol裂解液裂解，再加入5μl細(xì)胞裂解液、螢火蟲(chóng)緩沖液及5μl底物，混勻檢測(cè)熒光強(qiáng)度。之后加入海腎熒光素酶緩沖液和5μl腔腸素底物，混勻檢測(cè)海腎熒光素酶活性。psiCHECK2載體以螢火蟲(chóng)熒光素酶活性為內(nèi)參，psiCHECK2-Bcl-2-3’UTR WT和psiCHECK2-Bcl-2-3’UTR MUT表達(dá)為對(duì)照，觀察miR-144對(duì)Bcl-2表達(dá)的影響。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組miR-144、Bcl-2mRNA和蛋白表達(dá)水平比較

與Normal組相比，ALL組Bcl-2蛋白和Bcl-2 mRNA顯著升高，miR-144水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)圖1、表1。其它各組癌細(xì)胞珠miR-144、Bcl-2蛋白和Bcl-2 mRNA表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與CEM/C1組相比，MOLT-4組、CCRF-CEM組細(xì)胞中Bcl-2蛋白和Bcl-2 mRNA均顯著降低，miR-144水平均顯著升高(P<0.01)；與MOLT-4組相比，CCRF-CEM組細(xì)胞中Bcl-2蛋白和Bcl-2 mRNA顯著升高，miR-144水平顯著降低(P<0.01)，見(jiàn)圖1、表2。故選miR-144表達(dá)最少、Bcl-2蛋白和Bcl-2 mRNA最高的CEM/C1細(xì)胞做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 癌組織和細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)(Western blot)

表1 Normal 組和ALL 組骨髓組織miR-144、Bcl-2 mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)水平

注：與Normal 組比較，1)P<0.01

表2 各組癌細(xì)胞miR-144和Bcl-2相對(duì)表達(dá)水平

注：與CEM/C1組比較，1)P<0.01；與MOLT-4組比較，2)P<0.01

2.2 過(guò)表達(dá)miR-144對(duì)癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響

與miR-NC組相比，miR-144組miR-144水平顯著升高，在24h、48h、72h細(xì)胞增殖均顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖2、表3。

2.3 miR-144靶向Bcl-2

通過(guò)miR-code預(yù)測(cè)到miR-144與Bcl-2存在結(jié)合位點(diǎn)，互補(bǔ)序列見(jiàn)圖3。miR-NC組、miR-144組、inhibitor NC組、miR-144 inhibitor組Bcl-2蛋白表達(dá)水平以及細(xì)胞熒光素酶活性差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與miR-NC組相比，miR-144組Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01)；與inhibitor NC組相比，miR-144 inhibitor組Bcl-2蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01)，見(jiàn)圖4、表4。與miR-NC組相比，miR-144組細(xì)胞Bcl-2(WT)熒光素酶活性顯著降低(P<0.01)，與inhibitor NC組相比，miR-144 inhibitor組細(xì)胞Bcl-2(WT)熒光素酶活性顯著升高(P<0.01)，見(jiàn)表4。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CEM/C1細(xì)胞凋亡率

表3 miR-144過(guò)表達(dá)對(duì)CEM/C1細(xì)胞增殖和凋亡影響

注：與miR-NC組比較，1)P<0.01

圖3 miR-144靶向Bcl-2(互補(bǔ)序列)

圖4 不同處理組CEM/C1細(xì)胞中Bcl-2的蛋白表達(dá)

表4 miR-144靶向Bcl-2對(duì)CEM/C1癌細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)及熒光活性的影響

注：與miR-NC組比較，1)P<0.01；與inhibitor NC組比較，2)P<0.01

2.4 沉默Bcl-2對(duì)CEM/C1癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響

與si-NC組相比，si-Bcl-2組細(xì)胞Bcl-2 mRNA和蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.01)，見(jiàn)圖5、表5。與si-NC組相比，si-Bcl-2組細(xì)胞24h、48h、72h時(shí)細(xì)胞增殖率顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.01)，見(jiàn)圖6、表5。

圖5 敲除Bcl-2后CEM/C1細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)(Western blot)

表5 敲除Bcl-2后CEM/C1細(xì)胞Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)及增殖和凋亡水平

注：與si-NC組比較，1)P<0.05

圖6 敲除Bcl-2后CEM/C1細(xì)胞凋亡率(流式細(xì)胞術(shù))

2.5 過(guò)表達(dá)Bcl-2逆轉(zhuǎn)miR-144對(duì)CEM/C1的增殖和凋亡

miR-NC組、miR-144組、miR-144+Vector組、miR-144+Bcl-2組細(xì)胞增殖率和細(xì)胞凋亡率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與miR-NC組相比，miR-144組在24h、48h、72h時(shí)細(xì)胞增殖率顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.01)；與miR-144+Vector組相比，miR-144+Bcl-2組在24h、48h、72h時(shí)細(xì)胞增殖率顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.01)。見(jiàn)圖7、表6。

圖7 不同處理組CEM/C1細(xì)胞凋亡率(流式細(xì)胞術(shù))

表6 miR-144靶向Bcl-2調(diào)控CEM/C1的增殖和凋亡

注：與miR-NC組比較，1)P<0.05；與miR-144+Vector組比較，2)P<0.05

3 討 論

miRNA為可調(diào)控參與藥物轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝及靶向[11]的基因，并影響疾病的治療效果[12]。例如，miR-125b、miR-99a和miR-100上調(diào)與抗腫瘤藥物長(zhǎng)春堿、柔毛霉素的耐藥性有關(guān)，miR-708下調(diào)與兒童B-ALL中對(duì)糖皮質(zhì)激素的耐藥性有關(guān)[13,14]。miR-144在多種癌癥中均可作為抑癌基因發(fā)揮作用，如其可通過(guò)靶向SMAD4抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[15]，通過(guò)靶向IRS1抑制喉部鱗狀細(xì)胞癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[16]。Ding等[7]研究發(fā)現(xiàn)，老年B淋巴瘤小鼠miR-144/451表達(dá)下調(diào)，且此變化可激活原癌基因c-Myc，c-Myc又可結(jié)合miR-144/451啟動(dòng)子區(qū)域反向調(diào)節(jié)miR-144/451表達(dá)，形成miRNA-Myc陽(yáng)性反饋環(huán)以形成B淋巴細(xì)胞中高水平的c-Myc，揭示下調(diào)miR-144/451可能通過(guò)激活沉默的c-Myc而利于B淋巴瘤的發(fā)生發(fā)展。Jin等[17]在兒童ALL的研究中，運(yùn)用qRT-PCR檢測(cè)ALL細(xì)胞Molt-3、Molt-4、Tall-104、Jurkat、CCRF-CEM、CEM/C1、CEM/C2中miR-144 mRNA表達(dá)并通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)上調(diào)或下調(diào)miR-144，運(yùn)用MTT法、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)干預(yù)miR-144的Molt-3、Jurkat細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn)，白血病組織及細(xì)胞中miR-144表達(dá)水平下降，且上調(diào)miR-144可抑制ALL增殖和細(xì)胞周期轉(zhuǎn)變，上調(diào)miR-144對(duì)ALL無(wú)影響，運(yùn)用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了FMN2基因是miR-144的靶標(biāo)。

本研究檢測(cè)了Normal組、ALL組、CEM/C1組、MOLT-4組、CCRF-CEM組中miR-144的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，ALL組及癌細(xì)胞組miR-144表達(dá)下調(diào)；運(yùn)用MTT法、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)miR-144組、si-Bcl-2組、miR-144+Bcl-2組CEM/C1細(xì)胞的增殖、凋亡發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)miR-144、沉默Bcl-2均可抑制CEM/C1細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡，且過(guò)表達(dá)Bcl-2可逆轉(zhuǎn)miR-144對(duì)CEM/C1細(xì)胞的抑制增殖、促進(jìn)凋亡作用；進(jìn)一步用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了Bcl-2為miR-144的靶標(biāo)。Bcl-2為凋亡抑制因子，其主要功能為調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡進(jìn)程，特別是癌癥細(xì)胞[18,19]。據(jù)報(bào)道，Bcl-2在人類的很多腫瘤中均具有重要的調(diào)控作用，包括兒童ALL[20]。李焱等[21]在兒童ALL的調(diào)查中運(yùn)用RT-PCR檢測(cè)了急性白血病患兒和對(duì)照患兒WT1表達(dá)，免疫熒光流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)急性淋巴細(xì)胞白血病患兒Bcl-2的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，WT1、Bcl-2表達(dá)均上調(diào)。本研究檢測(cè)了Normal組、ALL組、CEM/C1組、MOLT-4組、CCRF-CEM組中Bcl-2的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，Bcl-2在ALL脊髓中表達(dá)上調(diào)；運(yùn)用MTT法、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)si-Bcl-2組、miR-144+Bcl-2組CEM/CI細(xì)胞增殖、凋亡發(fā)現(xiàn)，Bcl-2可抑制CEM/CI細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡，且過(guò)表達(dá)Bcl-2可逆轉(zhuǎn)miR-144對(duì)CEM/CI細(xì)胞的增殖抑制，凋亡促進(jìn)作用，這說(shuō)明不僅miR-144可靶向Bcl-2調(diào)控細(xì)胞增殖凋亡，相反，Bcl-2也可逆向調(diào)控miR-144的表達(dá)及功能。這些結(jié)果為兒童ALL的靶向治療提供更充分的理論依據(jù)，更為miR-144在ALL病中的治療奠定理論基礎(chǔ)。

綜上所述，miR-144可抑制兒童ALL細(xì)胞增殖，并促進(jìn)凋亡，其機(jī)制可能與靶向Bcl-2有關(guān)，該結(jié)果為兒童ALL的靶向治療提供了新靶點(diǎn)。

?