犬流感病毒的分離鑒定及部分基因序列分析

師麗敏　夏冬華　程臺格

摘要：使用Vero細(xì)胞接種臨床癥狀疑似感染犬流感病毒（CIV）的犬肺組織，盲傳3代，觀察其病變情況，收集72 h培養(yǎng)液進(jìn)行PCR鑒定、血凝特性及形態(tài)學(xué)觀察，同時(shí)進(jìn)行序列測定和分析，并制作系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果表明，從犬肺中成功分離出一株犬流感病毒，該病毒能夠凝聚豚鼠、豬、雞抗凝血，電鏡觀察病毒呈圓形、長絲狀等形態(tài)多樣、大小不等的顆粒狀;序列分析表明，與人源、犬源等10株有代表性的流感病毒基因同源性極高，只有少數(shù)地方發(fā)生了特異變異。這些數(shù)據(jù)的分析對于犬流感的防控有一定的參考價(jià)值。

關(guān)鍵詞：犬流感病毒;分離鑒定;基因序列

中圖分類號：S858.292 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A ? ? ? ?文章編號：1007-273X（2019）08-0009-02

犬流感是由犬流感病毒（CIV）引起的犬的一種接觸性傳染病，該病的主要臨床癥狀表現(xiàn)為發(fā)熱、流涕和咳嗽。CIV是犬傳染性呼吸系統(tǒng)疾病的主要病原之一，其容易引起犬的支氣管炎和支氣管肺炎，損害呼吸道上皮細(xì)胞，給其他病原體的感染創(chuàng)造了條件。該病對于世界各國養(yǎng)犬業(yè)的發(fā)展也產(chǎn)生了一定的影響。

CIV在分類上屬于副黏病毒科副黏病毒亞科如布拉病毒屬。其與同屬的猴病毒V型、人SV5分離株及人流感病毒等抗原性密切相關(guān)。當(dāng)前，市場上雖然有相關(guān)疫苗，但是該病的發(fā)生率依然很高，之所以出現(xiàn)這種現(xiàn)象可能與該病毒的不斷變異存在一定的關(guān)系?；谠撛?，分離當(dāng)前的流行變異株、了解序列變異情況對于該病的預(yù)防、診斷及治療意義重大。本試驗(yàn)對一例疑似犬流感病例的肺組織中分離出的病毒進(jìn)行了鑒定，并嘗試對該病毒中的部分基因序列進(jìn)行了分析，探討了其出現(xiàn)遺傳變異的情況?，F(xiàn)將其報(bào)道如下。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

本研究選取臨床診斷為犬流感的病死京巴犬1只，其年齡約1歲左右，臨床表現(xiàn)為患犬精神萎靡不振、不喜進(jìn)食、咳嗽、流涕、喘息等呼吸道癥狀，同時(shí)還伴有發(fā)熱等不良癥狀。最終該犬治療無效死亡，將病犬的肺臟取出進(jìn)行處理[1]。

細(xì)胞系：Vero細(xì)胞購于海南壹田生物科技有限公司，并用于后期的分離鑒定和部分基因序列分析。

1.2 ?病毒分離

參照已有的分離方法對病毒進(jìn)行分離，并將成功分離的病毒命名為QF20180726。

1.3 ?病毒鑒定

血凝試驗(yàn)：分別采集豚鼠、雞、豬抗凝血，使用PBS液洗滌紅細(xì)胞四次，1 500 r/min離心10 min，用PBS液配成1%紅細(xì)胞懸液進(jìn)行血凝試驗(yàn)。然后對細(xì)胞培養(yǎng)液負(fù)染色，進(jìn)行電鏡觀察[1]。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?病毒分離培養(yǎng)

病料接種到Vero細(xì)胞第五代24 h后出現(xiàn)典型細(xì)胞病變，截止到第5天收毒的時(shí)候，大部分細(xì)胞融合、裂解死亡，培養(yǎng)液中碎片增多，相同條件下的正常細(xì)胞沒有出現(xiàn)這種變化。

2.2 ?血凝試驗(yàn)

病毒在25 ℃的環(huán)境下能夠凝集豚鼠、豬、雞紅細(xì)胞。

2.3 ?RT-PCR鑒定結(jié)果

對Vero細(xì)胞培養(yǎng)病毒進(jìn)行犬流感病毒的RT-PCR檢測，最終結(jié)果顯示，Vero細(xì)胞培養(yǎng)的病毒為CIV陽性。

2.4 ?電鏡觀察

電鏡片顯示，CIV為圓形，有囊膜，其直徑為80 mm左右，囊膜上有直徑8～10 nm的纖突。病毒因囊膜破損而呈現(xiàn)出不規(guī)則的形態(tài)，成多形性、長絲狀等。

2.5 ?N基因序列同源性分析

與人源、犬源等10株有代表性的流感病毒N基因相比較，核苷酸同源性為95.7%～99.8%，氨基酸同源性為97.4%～99.6%。有兩處氨基酸發(fā)生了新的變異，分別是第257位由V變成了A，第301位由A變成了T。其中與人源流感病毒分離株LN同源性最低，為97.4%，與犬源流感病毒分離株08-1990和D277同源性最高，均為99.6%。

2.6 ?F基因序列同源性分析

與人源、犬源等10株有代表性的流感病毒F基因相比較。核苷酸同源性為94.7%～99.6%，氨基酸同源性為95.6%～99.3%。有兩處發(fā)生特異變異，其分別是第56位由T轉(zhuǎn)變?yōu)镾，第89位由T轉(zhuǎn)變?yōu)镸。其中與人源流感病毒分離株LN同源性最低，為95.6%，與犬源流感病毒分離株08-1990同源性最高，為99.3%。

2.7 ?HN基因序列同源性分析

與人源、犬源等10株具有代表性的流感病毒HN基因相比較，核苷酸同源性為95.5%～99.8%，氨基酸同源性為96.3%～99.6%，其中與人流感病毒分離株LN同源性最低，為96.3%，與犬源流感病毒分離株D277同源性最高，為99.6%。

2.8 ?N、HN和F基因克隆、測序

使用設(shè)計(jì)的N、F和HN基因引物擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，分別可以見到約1 680、1 970和1 830 bp左右的3個(gè)基因片段，其大小與N、F和HN蛋白基因類似，預(yù)測結(jié)果證實(shí)本試驗(yàn)所克隆的基因是正確的，這也從側(cè)面說明本次研究是有效的。

3 ?小結(jié)與討論

本研究在對該病進(jìn)行分析時(shí)，已經(jīng)建立起了病毒分離、血凝、血凝抑制監(jiān)測方法以及RT-PCR方法，但是這些方法對實(shí)驗(yàn)條件的要求相對比較高，而且所需要的時(shí)間也比較長，其推廣難度相對來說比較大。而分離鑒定及部分基因序列分析則是一種簡單、快速、準(zhǔn)確的基因測試法。本研究對CIV檢測的反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，提高了犬流感病毒分離鑒定及部分基因序列分析的特異性和靈敏度，該技術(shù)基本上克服了當(dāng)前臨床和實(shí)驗(yàn)室診斷CIV方面存在的不足，其操作條件簡單方便，在對病毒進(jìn)行分析和測試時(shí)，不需要太過復(fù)雜的儀器設(shè)備、分離成本比較低，為相關(guān)疾病的診斷和治療提供了較大的便利。

犬流感是一種可以在成年犬間快速傳播、引起犬呼吸系統(tǒng)不暢的疾病，該病在比較嚴(yán)重的情況下會(huì)造成犬只死亡。據(jù)相關(guān)研究表明之所以會(huì)出現(xiàn)犬流感病毒，是因?yàn)檫@些流感病毒來源于異種動(dòng)物。流感病毒與其他病毒不同，其可以突破種間屏障，感染異種動(dòng)物，犬作為寵物與人接觸密切，因此對該病必須要引起足夠的重視。本試驗(yàn)之所以開展分離鑒定及部分基因序列分析，就是為了建立一種行之有效的CIV檢測方法，其對于開展CIV的綜合防治與疾病診斷有著極為重要的意義。

據(jù)血清學(xué)調(diào)查表明，CIV在世界各地普遍存在，是危害犬業(yè)發(fā)展的主要傳染病之一，該病毒在所有的犬類中都有流行，對于已經(jīng)患病的犬來說，還可能會(huì)引發(fā)其他的并發(fā)癥，如急性腦脊髓炎、腦內(nèi)積水等，該病的出現(xiàn)嚴(yán)重危害了犬類的健康生長。近些年來，隨著我國養(yǎng)犬業(yè)的不斷擴(kuò)大，CIV也受到了越來越多人的重視[2]。

本試驗(yàn)以海口某動(dòng)物醫(yī)院診治的1例臨床診斷疑似CIV感染京巴犬作為對象，發(fā)現(xiàn)其在患病之后的主要臨床癥狀表現(xiàn)為精神萎靡不振、不喜進(jìn)食、咳嗽、流鼻涕、喘息聲粗重等呼吸道癥狀，同時(shí)還伴有發(fā)熱等不良癥狀，因治療無效而死亡。一般情況下，犬單獨(dú)感染CIV的情況并不多見，在對死亡病犬解剖檢查時(shí)，發(fā)現(xiàn)病犬的死亡可能與細(xì)菌、支原體和病毒等混合感染有一定的關(guān)系。為了更加深入分析CIV變異情況，本試驗(yàn)從患犬肺組織中分離得到了一株CIV，并結(jié)合實(shí)驗(yàn)室檢測手段對其中的部分基因序列進(jìn)行了分析，詳細(xì)研究了基因變異情況。結(jié)果表明該病毒能夠在4 ℃條件下將豚鼠、豬、雞等凝聚到一起，這一特性與CIV的血凝特性基本上是一致的。在電鏡下觀察病毒株結(jié)構(gòu)時(shí)，發(fā)現(xiàn)其超微結(jié)構(gòu)呈圓形、長絲狀等不規(guī)則形態(tài)。

通過對N、HN和F基因進(jìn)行擴(kuò)增和測序，其核苷酸和氨基酸同源性分析和系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系顯示，與10株有代表性的犬流感病毒N基因核苷酸的同源性為95.7%～99.8%，氨基酸同源性為97.4%～99.6%，其中有兩處氨基酸發(fā)生了全新的變異：第257位由V變成了A，第301位由A變成了T;其中與人源流感病毒分離株LN同源性最低，為97.4%，與犬源流感病毒分離株08-1990和D277同源性最高，均為99.6%。HN基因分析顯示，與10株有代表性的流感病毒HN基因核苷酸同源性為95.5%～99.8%，氨基酸同源性為96.3%～99.6%;其中與人源流感病毒分離株LN同源性最低，為96.3%，與犬源流感病毒分離株D277同源性最高，為99.6%。與10株有代表性的流感病毒F基因核苷酸同源性為94.7%～99.6%，氨基酸同源性為95.6%～99.3%[3]。有兩處發(fā)生特異變異，分別是56位由T變成S，89位由T變成了M。其中與人源流感病毒分離株LN同源性最低，為95.6%，與犬源流感病毒分離株08-1990同源性最高，為99.3%。F基因的遺傳變異對于CIV的預(yù)防有著極為重要的影響，特別是重要抗原位點(diǎn)的變化，其可能會(huì)導(dǎo)致疫苗的免疫保護(hù)不夠全面，本次分離株F基因的變異是否能導(dǎo)致疫苗的免疫保護(hù)不全或者是增加CIV的毒力變化值則還需要進(jìn)一步深入研究和分析。N、HN和F基因序列分析還表明，犬流感病毒流行毒株之間氨基酸序列變化并不是很大，但與其他毒株之間的差異相對來說是比較大的。

4 ?結(jié)論

本試驗(yàn)成功分離出一株犬流感病毒，該病毒在25 ℃條件下可以成功吸附豚鼠、雞、豬血紅細(xì)胞。電鏡觀察顯示病毒為圓形、長絲狀等形態(tài)多樣、大小不等的病毒粒子。結(jié)合N、HN和F基因序列分析顯示，成功分離的犬流感病毒株與犬流感病毒分離株08-1990的親緣關(guān)系是最近的，同時(shí)由于病毒感染，其基因序列發(fā)生了特異性變異。

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