加味大柴胡湯對阻塞性黃疸老年大鼠TRPC1表達(dá)的影響

李雪 張瑋琛

[摘要]目的探討加味大柴胡湯在臨床上輔助治療老年阻塞性黃疸的理論機(jī)制。方法通過結(jié)扎膽總管的外科手術(shù)方法建立阻塞性黃疸老年大鼠模型，實驗分為假手術(shù)組、模型組、加味大柴胡湯組，予以相應(yīng)干預(yù)，分3、7、10d共3個時間段，每組10只SPF級老年SD大鼠，在各時間段取老年大鼠肝組織及心臟血，檢測AST、ALT及TBA;采用鈣離子試劑盒檢測老年鼠肝組織勻漿鈣離子濃度;采用Westem Blot法檢測老年鼠肝組織TRPC1蛋白的表達(dá)，采用Tunel法觀察肝細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果造模成功后各時間點(diǎn)模型組、加味大柴胡湯組與假手術(shù)組比較，ALT、AST、TBA和Ca²⁺濃度均升高，且模型組上升更明顯（P<0.01），模型組、加味大柴胡湯組的TRPC1的蛋白含量也均高于假手術(shù)組（P<0.01），且加味大柴胡湯組肝細(xì)胞的凋亡率低于模型組（P<0.01）。結(jié)論梗阻性黃疸老年大鼠TRPC1表達(dá)明顯升高，加味大柴胡湯下調(diào)TRPC1的表達(dá)，可能是其降低鈣超載，減少肝細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一。

[關(guān)鍵詞]阻塞性黃疸;老年大鼠;加味大柴胡湯;細(xì)胞凋亡;TRPC1

[中圖分類號]R285.5;R256.41[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A [文章編號]doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.11.008

阻塞性黃疸（obstructive jaundice）是由于肝外或肝內(nèi)膽管部分性或完全性阻塞，使膽汁不能排人十二指腸而返流人血，致皮膚、鞏膜和黏膜等機(jī)體組織黃染。阻塞性黃疸首先對肝臟本身造成損傷，若未得到及時治療，全身各個器官都會發(fā)生不同程度的損害。隨著我國老年人口的增加，老年人患阻塞性黃疸的比例也增加。老年患者因機(jī)體功能的退化，阻塞性黃疸發(fā)生時其臨床癥狀并不典型，故而易延誤診斷及治療，可一旦癥狀加重，又因合并多種并發(fā)癥，手術(shù)的風(fēng)險和術(shù)后的死亡率均增高?，F(xiàn)有研究已證實阻塞性黃疸時膽汁排出受阻以及繼發(fā)的內(nèi)毒素血癥是造成其各種病理生理改變的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。若不及時解決相關(guān)梗阻問題，肝臟最終會隨著梗阻時間的延長而萎縮，肝細(xì)胞最終甚至?xí)?。故對阻塞性黃疸的老年患者如何進(jìn)行術(shù)前減黃，從而減輕代表性的肝損害成為臨床的棘手問題，但國內(nèi)尚未對此開展深入研究。

傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)對黃疸的最早認(rèn)識來自《黃帝內(nèi)經(jīng)》，“濕熱相交，民病癉也……溺黃，赤安臥者，黃疸……目黃者，曰黃疸”。后《金匱要略》又指出：“黃家所得，從濕得之。”故中醫(yī)學(xué)對黃疸病因病機(jī)的認(rèn)識強(qiáng)調(diào)濕邪為患，阻塞性黃疸由于肝郁氣滯，肝膽濕熱，氣血瘀滯，膽汁瘀積，結(jié)聚而成石，致使“中清之腑”成為不清之腑，氣機(jī)運(yùn)行不暢而郁積肝膽。大柴胡湯出自《傷寒雜病論》，有和解少陽、攻下熱結(jié)之功。加味大柴胡湯是根據(jù)《金匱要略》在大柴胡湯中加入茵陳、金錢草，諸藥配伍，既可疏利肝膽之氣滯，又可蕩滌腸胃之實熱。謝毅通過實驗發(fā)現(xiàn)加味大柴胡湯可減輕阻塞性黃疸大鼠因內(nèi)毒素造成的肝損傷：余水平也通過實驗證實加味大柴胡湯可影響參與梗阻性黃疸大鼠膽汁酸代謝相關(guān)基因的表達(dá)而緩解肝臟能量代謝障礙。除此之外，加味大柴胡湯是否可通過其他途徑減少肝損害肝細(xì)胞凋亡與鈣超載密切相關(guān)，鈣內(nèi)流又與鈣庫操縱性鈣通道（store-oper-ated Ca²⁺entry，SOCE）的介導(dǎo)有關(guān)，TRPC1是肝細(xì)胞上SOCE的主要成分，TRPC1在此過程中是否起作用？本文采用阻塞性黃疸老年大鼠模型觀察加味大柴胡湯對肝臟TRPC1表達(dá)及肝損傷的影響，為臨床上加味大柴胡湯治療老年人阻塞性黃疸提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1實驗材料

方藥的制備：柴胡10g，黃芩10g，大黃6g，枳實10g，白芍12g，半夏10g，生姜10g，大棗10g，茵陳30g，金錢草20g（以上飲片均購于武漢市第五醫(yī)院中藥房）。稱取4倍加味大柴胡湯處方量，用水浸泡后加熱煮沸，文火煎煮1h后過濾：按上述方法再煎煮2次，將3次濾液合并后，文火濃縮至含生藥量1g/mL，-20℃冷藏備用（一次性準(zhǔn)備所有加味大柴胡湯用量）。人每日劑量為140g/60kg，大鼠每日劑量為9.3g/kg，分2次灌胃。

1.2實驗動物及分組

SPF級健康SD老年大鼠雌雄共90只，鼠齡為12個月，由三峽大學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（鄂）2017-0012.體質(zhì)量450-550g，隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組、模型組、加味大柴胡湯組：后再根據(jù)隨機(jī)原則將每組細(xì)分為3、7、10d 3個不同時間段，每個時間段10只SD老年大鼠。

1.3主要試劑

丙谷轉(zhuǎn)氨酶（ALT）試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）試劑盒（長春匯力），總膽汁酸（TBA）試劑盒、鈣離子測定試劑盒（南京建成生物工程研究所），磷酸酶抑制劑、PMSF、RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天），TEMED、30%丙烯酰胺（Amresco），SDS上樣緩沖液、TG（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），蛋白marker（14-120kD）（北京全式金生物技術(shù)有限公司），PVDF膜（0.45txm）（Millipore），兔多抗GAPDH（杭州賢至生物有限公司），兔多抗TRCP1（55kD，Bioss），HRP標(biāo)記羊抗兔二抗（武漢博士德生物工程有限公司），ECL底物液（Thermo），包埋石蠟（國藥集團(tuán)），細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（上海翊圣生物科技有限公司），抗熒光淬滅封片劑（Southernbiotech）。

1.4主要儀器

Chemray型全自動生化分析儀（美國Ravto公司），Multiskan MK3型全自動酶標(biāo)儀（美國Thermoscientific公司），DYY-7C型電泳儀電源、DYCZ-24DN型垂直電泳槽、DYCZ-40型電轉(zhuǎn)儀（北京六一儀器廠），TS-1型水平搖床（江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司），T8-1型磁力攪拌器（江蘇省金壇市中大儀器廠），Mulitskan MK3型酶標(biāo)儀（美國Ther-no公司），顯微鏡（奧林巴斯BX53生物顯微鏡）。

1.5模型制備與干預(yù)

造模組術(shù)前24h禁食禁水，腹內(nèi)注射10%水合氯醛溶液麻醉后消毒，上腹正中切口人腹，開腹后膽總管中上1/3行膽總管雙重結(jié)扎，關(guān)腹。假手術(shù)組僅單純游離膽總管后關(guān)腹。術(shù)后6h模型組和假手術(shù)組給予生理鹽水灌胃（2mL/次，2次/d）;加味大柴胡湯組給予加味大柴胡湯灌胃（2mL/次，2次/d）。分籠飼養(yǎng)，自然光照，溫度20-25℃，濕度20%-30%，自由進(jìn)食水。

1.6標(biāo)本處理

各組大鼠分別于術(shù)后3、7、10d，用10%水合氯醛麻醉后消毒，開胸、開腹，按下列順序取材備檢：（1）從心臟穿刺抽血，放人采血管，離心制備血清后，置于4℃冰箱保存，待測ALT、AST、TBA、Ca²⁺濃度：（2）游離肝臟，取一塊右肝下葉組織放人EP管中，先置于干冰上，待所有組織取完，移入-80°冰箱保存，用Western-Blot法測TRPC1蛋白表達(dá)情況：（3）取一塊右肝下葉組織放人裝有多聚甲醛的EP管中，待所有組織取完，常溫保存，用Tunel法檢測凋亡。

1.7ALT、AST、TBA檢測

參照試劑盒說明書，采用生化分析法檢測各組大鼠血清中ALT、AST、TBA含量。

1.8Ca²⁺濃度檢測

參照試劑盒說明書，采用全自動酶標(biāo)儀檢測各組老年大鼠肝組織中鈣離子含量。

1.9TRPC1的檢測

采用免疫蛋白印跡（Western Blot）方法測定TR-PCI蛋白含量。提取蛋白后將蛋白樣本適當(dāng)稀釋后測定蛋白濃度，用沸水浴的方法使蛋白變性，然后保存?zhèn)溆?。制備SDS-PAGE電泳膠后，將制備好的蛋白樣品和MAKER加入上樣孔，先恒壓80V電泳至溴酚藍(lán)指示劑在濃縮膠與分離膠交界處成線狀，改為恒壓120V至溴酚藍(lán)到凝膠底部。電轉(zhuǎn)膜后脫脂奶粉室溫封閉2h，用封閉液稀釋GAPDH和TR-PCI，4℃孵育過夜。用TBST洗去GAPDH和TR-PCI，加稀釋后兔多抗GAPDH和TRPC1.37℃搖床孵育2h，洗去多余GAPDH和TRPC1。顯色曝光后晾干膠片，用Band Scan分析膠片灰度值。樣本蛋白含量以目的條帶和內(nèi)參條帶的積分吸光度比值表示。

1.10肝細(xì)胞凋亡的檢測

采用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的脫氧尿苷三磷酸缺口末端標(biāo)記（Tunel）法測肝細(xì)胞凋亡。將老鼠肝組織脫水后，用無水乙醇和二甲苯（1：1比例）進(jìn)行透明，透明后的組織在脫水機(jī)中依次經(jīng)3缸石蠟（60℃）進(jìn)行浸蠟。將浸透蠟的組織包埋人石蠟中，組織塊與包埋石蠟融為一體后進(jìn)行切片和烤片。切片脫蠟后用PBS輕輕潤洗切片，每個樣本上滴加100uL濃度為20ug/mL的Proteinase K溶液，室溫孵育20min。用PBS溶液潤洗樣本后，每個樣本滴加100uL1xEquilibration Buffer，室溫孵育10-30min。洗掉大部分Buffer后加入TdT孵育緩沖液，將載玻片置于濕盒內(nèi)，在37℃孵育60min，避光。然后用PBS洗滌3次，每次5min。滴加DAPI避光孵育5min，對標(biāo)本進(jìn)行染核，PBST 5minx4次洗去多余的DAPI。用吸水紙擦干切片上的液體，封片，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。熒光顯微鏡下組織切片上調(diào)亡的細(xì)胞呈綠色熒光，細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光。

2統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料用“x±s”表示，多組均數(shù)用方差檢驗，方差齊后用單因素方差分析，方差不齊用非參多重比較法，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3結(jié)果

3.1動物模型情況

假手術(shù)組老年大鼠精神、飲食等一般情況良好。模型組在術(shù)后眼睛、耳朵及尾部均出現(xiàn)黃染，尿色變黃，精神萎靡，進(jìn)食量下降。加味大柴胡湯組術(shù)后眼睛、耳朵、尾部及尿液均出現(xiàn)變黃的現(xiàn)象，其黃染程度比模型組稍輕，也伴有活動減少，飲食量下降的情況。

3.2不同時間點(diǎn)各組大鼠血清ALT、AST及TBA含量變化

隨著梗阻時間的延長，模型組和加味大柴胡湯組的肝損傷指標(biāo)ALT，AST含量也隨之升高（P<0.01），模型組比大柴胡湯組升高更明顯（P<0.01），且與假手術(shù)組相比，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。在各個時間段，模型組和大柴胡湯組的TBA水平明顯高于假手術(shù)組（P<0.01），且模型組TBA升高程度比大柴胡湯組更明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），見表1。

3.3不同時間點(diǎn)各組大鼠肝組織中Ca²⁺含量變化

模型組中Ca²⁺含量隨著梗阻時間的延長而升高，與假手術(shù)組和和加味大柴胡湯組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），見表2。

3.4Western檢測大鼠肝組織中丁RPC1蛋白含量

與假手術(shù)組比較，模型組TRPC1的含量各時相點(diǎn)出現(xiàn)均高于假手術(shù)組（P<0.01）。與模型組比較，加味大柴胡湯組TRPC1的含量各時相點(diǎn)出現(xiàn)均低于模型組（P<0.01），見表3、圖1。

3.5TUNEL法檢測各組大鼠肝細(xì)胞凋亡

與假手術(shù)組比較，模型組細(xì)胞凋亡率各時相點(diǎn)均高于假手術(shù)組（P<0.01）。與模型組比較，大柴胡湯組細(xì)胞凋亡率各時相點(diǎn)均低于模型組（P<0.01），見表4.圖2。

4討論

阻塞性黃疸時膽汁酸排出受阻形成的淤積會對肝及其他器官造成一系列損傷，在本次實驗中，對老年大鼠進(jìn)行膽總管結(jié)扎后，血清中TBA隨著梗阻時間的延長而升高，血清ALT、AST的含量也相應(yīng)升高，而假手術(shù)組沒有發(fā)生明顯的改變。除此之外，光鏡下阻塞性黃疸老年大鼠肝細(xì)胞的凋亡也明顯高于假手術(shù)組，說明隨著膽汁淤積程度的加重，肝組織的損傷也進(jìn)行性加重。與此同時，肝組織中鈣離子濃度也隨著梗阻時間的延長而升高，而假手術(shù)組則無明顯改變，此結(jié)果進(jìn)一步說明，肝組織中鈣濃度的變化與阻塞性黃疸的肝損傷密切相關(guān)。

鈣超載在梗阻性黃疸的肝損傷中起著重要的作用，現(xiàn)大量實驗結(jié)果已證明肝細(xì)胞及其胞內(nèi)細(xì)胞器Ca²⁺濃度及分布是肝細(xì)胞發(fā)揮正常生理功能的必要前提，劉慧敏通過實驗研究已證實持續(xù)的鈣內(nèi)流與SOCE有關(guān)。瞬時受體電位（transient receptor pot-entieal，TRP）基因編碼了一個非選擇性陽離子通道的大家族，主要有TRPA，TRPC、TRPV，TRPM、TRPP、TRPN、TRPML7個亞族。TRPCI是TRPC亞族的一種，位于人染色體3q11.TRPCI基因編碼的TRPCI蛋白主要表達(dá)在胎兒的大腦、肝臟和腎臟，成人的心臟、肌肉、大腦睪丸及卵巢，TRPC1介導(dǎo)SOCE的鈣內(nèi)流。

SOCE通道是Ca²⁺進(jìn)入胞內(nèi)的一種重要途徑，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoDlasmic reticulum，ER）鈣庫耗竭時被激活。目前研究結(jié)果已表明，部分TRPC通道參與了SOCE通道的組成，另外一部分則由非鈣池依賴的機(jī)制調(diào)控。根據(jù)本次實驗中老年大鼠肝組織中Ca²⁺含量、TRPC1蛋白表達(dá)與假手術(shù)組比有明顯的升高現(xiàn)象，可以推測，TRPC1參與了梗阻性黃疸時SOCE介導(dǎo)的鈣內(nèi)流。

本次實驗結(jié)果還可以看出，造模3d后，TRPC1蛋白、Ca²⁺含量與肝細(xì)胞凋亡率均升高，而假手術(shù)組則無顯著變化。以上實驗結(jié)果充分說明了TRPC1與阻塞性黃疸時鈣超載引起的肝損傷密切相關(guān)。

加味大柴胡湯歷來被運(yùn)用于阻塞性黃疸的治療，本次實驗結(jié)果顯示：加味大柴胡湯的治療確實能降低阻塞性黃疸老年大鼠的肝損傷血清指標(biāo)ALT、AST的濃度，還能降低肝細(xì)胞的凋亡，且在各阻塞時間段其損傷指標(biāo)與肝細(xì)胞凋亡率均低于用生理鹽水灌胃的模型組：另加味大柴胡湯也能降低引起肝損傷的TBA水平，降低大鼠肝臟中TRPC1蛋白含量的表達(dá)。可見加味大柴胡湯能下調(diào)TRPC1在肝組織中的表達(dá)，減輕肝組織中鈣離子濃度水平，減輕肝細(xì)胞凋亡，從而減輕肝損傷。

基于我國人口結(jié)構(gòu)改變的現(xiàn)狀，老年人的健康問題越來越受到關(guān)注，阻塞性黃疸的老年患者的主要病因為消化道腫瘤，目前首選治療方案仍為手術(shù)解除梗阻。但老年人由于機(jī)體的儲備及代償能力明顯降低，患阻塞性黃疸時，肝臟及其他臟器的損傷更為嚴(yán)重，故術(shù)前減輕及防治肝臟的損害顯得尤其重要。本實驗已證明加味大柴胡湯通過下調(diào)TRPC1的表達(dá)減輕鈣超載引起的肝細(xì)胞凋亡而減少肝損傷，對肝功能的恢復(fù)有一定幫助。但科研工作者還應(yīng)根據(jù)阻塞性黃疸時線粒體功能障礙，氧自由基生成過多等機(jī)制共同參與了肝損傷的實際情況，研究加味大柴胡湯是否也可通過上述途徑起作用，或各途徑間是否相互影響，其具體的分子機(jī)制尚須進(jìn)一步探討。本次實驗結(jié)果僅可證明對阻塞性黃疸的老年患者，在術(shù)前用加味大柴胡湯進(jìn)行治療可減少肝損傷，降低手術(shù)風(fēng)險。