E3泛素連接酶對卵巢癌細(xì)胞系SKOV3/DDP順鉑耐藥性的影響

王小特++曹怡

[摘要] 目的 探討E3泛素連接酶（EDD）基因在SKOV3/DDP細(xì)胞順鉑耐藥中的作用。 方法 采用RT-PCR和Western blot檢測人卵巢癌SKOV3細(xì)胞和SKOV3/DDP細(xì)胞內(nèi)EDD表達(dá)水平的差異。通過轉(zhuǎn)染EDD-siRNA沉默EDD的表達(dá)后，噻唑藍(lán)法檢測順鉑對SKOV3/DDP細(xì)胞增殖的影響，Annexin V-FITC/PI雙染法檢測順鉑對細(xì)胞凋亡的影響；Western blotting檢測髓樣細(xì)胞白血病-1（Mcl-1）和細(xì)胞周期檢測點激酶2（CHK2）蛋白表達(dá)水平。 結(jié)果 SKOV3細(xì)胞EDD的表達(dá)水平顯著低于卵巢癌耐藥細(xì)胞SKOV3/DDP（P < 0.05）。EDD-siRNA轉(zhuǎn)染24 h后，EDD mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著低于未轉(zhuǎn)染組（P < 0.05）；SKOV3/DDP細(xì)胞IC50值顯著降低（P < 0.05），Mcl-1蛋白的表達(dá)受到抑制（P < 0.05），而CHK2無明顯變化（P > 0.05）。 結(jié)論 EDD-siRNA能沉默EDD基因，降低Mcl-1蛋白的表達(dá)水平，增強順鉑對SKOV3/DDP細(xì)胞的促凋亡作用，降低SKOV3/DDP細(xì)胞對順鉑的耐藥性，有效恢復(fù)SKOV3/DDP細(xì)胞順鉑敏感性。

[關(guān)鍵詞] EDD；卵巢癌；順鉑耐藥；細(xì)胞凋亡

[中圖分類號] R737.31 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2015）09（b）-0020-05

卵巢癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一，其最主要的治療策略是腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)聯(lián)合鉑類藥物為基礎(chǔ)的化療法，然而鉑類耐藥的形成是目前腫瘤治療過程中的主要障礙之一，因此，研究卵巢癌細(xì)胞的耐藥機制對卵巢癌提供新的治療方法具有十分重要的作用。E3泛素連接酶（E3 isolated by differential display，EDD）包括一個羥基末端的連接酶（HECT）泛素連接酶域，是果蠅腫瘤抑制因子hyd的人同源因子[1]，位于染色體8q22.3上，這個染色體區(qū)域通常與順鉑耐藥具有一定的聯(lián)系[2]。EDD在卵巢癌、乳腺癌和胃癌中均存在過表達(dá)的現(xiàn)象[3-6]，高表達(dá)的EDD蛋白可作用于鈣整合素結(jié)合蛋白1和細(xì)胞周期檢測點激酶2（checkpoint kinase 2，CHK2），上調(diào)DNA損傷通路相關(guān)基因的表達(dá)，增強DNA損傷修復(fù)能力，增加順鉑等化療藥物的耐藥性[7-9]，DNA損傷通路的大部分基因與鉑類等化療藥物敏感性降低之間有一定的聯(lián)系[10]。本研究旨在通過轉(zhuǎn)染EDD-siRNA沉默EDD在耐藥細(xì)胞SKOV3/DDP的表達(dá)，探討EDD的表達(dá)在卵巢癌順鉑耐藥形成過程中的作用，并初步探索其相關(guān)機制，以期為恢復(fù)卵巢癌的順鉑敏感性提供理論基礎(chǔ)，為卵巢癌的治療提供有力的線索。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及主要試劑

SKOV3、SKOV3/DDP（北京腫瘤醫(yī)院藥物研究所）；胎牛血清（FBS）、RPMI 1640（美國Gibco）；四甲基偶氮唑鹽（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）和胰蛋白酶（美國Sigma）；順鉑（齊魯制藥有限公司）；RNA提取試劑盒（美國Invitrogen）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒[寶生物工程（大連）有限公司]；SsoFastTM EvaGreen Supermix （BIO-RAD）；RIPA細(xì)胞裂解液及BCA蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；EDD抗體、2CHK2抗體、髓樣細(xì)胞白血病-1（Mcl-1）抗體和兔抗β-actin抗體（上海艾碧康生物制品有限公司）；Lipofectamine RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑（美國Invitrogen）；EDD-siRNA（5'-CCAUUUACCCUGGCUAGUA-3'，美國Sigma-Aldrich）；非特異性siRNA序列（5'-CUGGAGUUGUCCCAAUUCU-3'，Ambion）；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將SKOV3和SKOV3/DDP細(xì)胞各5×104個培養(yǎng)在含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基中，在37℃ 5%CO2的飽和濕度條件下培養(yǎng)。每3天傳代1次，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)實驗。

1.3 RNA干擾

siRNA轉(zhuǎn)染SKOV3/DDP細(xì)胞步驟按照Lipofectamine RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24 h，實驗分為4組細(xì)胞：SKOV3細(xì)胞，SKOV3/DDP細(xì)胞，SKOV3/DDP細(xì)胞+非特異性siRNA（NC siRNA）和SKOV3/DDP細(xì)胞+EDD-siRNA。

1.4 RT-PCR檢測EDD mRNA的表達(dá)

按試劑盒說明提取細(xì)胞中RNA并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴增。EDD mRNA上游引物：5'-TTAGGCTTTTGGTAAATGGCTGCG-3'，下游引物：5'-TGAGGGCATAGGCTGGAATCCTTC-3'。內(nèi)參GAPDH上游引物：5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'，下游引物：5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'。PCR擴增反應(yīng)體系（10 μL）為：上下游引物各2 μL，5 μL SsoFastTM EvaGreen Supermix，1 μL cDNA；反應(yīng)條件：94℃ 4 min，94℃ 20 s，55℃ 30 s，72℃ 20 s，共35個循環(huán)，72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖電泳鑒定。試驗重復(fù)3次，每次5個復(fù)孔。

1.5 Western blotting檢測蛋白表達(dá)

提取細(xì)胞蛋白并測量蛋白濃度，Western blot檢測EDD、CHK2以及Mcl-1蛋白表達(dá)。以β-actin為內(nèi)參，每組上樣量50 μg，一抗（1∶400稀釋）溫室孵育2 h，二抗（1∶2000稀釋）孵育1.5 h，DAB顯色，暗室曝光。試驗重復(fù)3次，每次5個復(fù)孔。

1.6 MTT檢測SKOV3/DDP細(xì)胞順鉑半數(shù)抑制濃度（IC50）的變化

取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，分別加入終濃度為0（對照組）、4、8、12、16、20、24、28、32、36、40 μg/mL的順鉑培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，每孔加入20 μL 5 mg/mL MTT后培養(yǎng)4 h，棄上清液并在每孔加入200 μL DMSO，振蕩10 min使其充分溶解后，酶標(biāo)儀上測定OD490值。抑制率=（對照組OD值-用藥組OD值）/對照組OD值×100%，Logistic回歸法計算IC50。相對逆轉(zhuǎn)效率=[IC50（SKOV3/DDP）-IC50（SKOV3+EDD-siRNA）]/[IC50（SKOV3/DDP）-IC50（SKOV3）]×100%。試驗重復(fù)3次，每次5個復(fù)孔。

1.7細(xì)胞凋亡檢測

20 μg/mL的順鉑處理各組細(xì)胞24 h，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡的檢測參照細(xì)胞凋亡試劑盒說明書進(jìn)行。收集5×105個細(xì)胞，加入500 μL結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞，分別加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，混勻后室溫避光反應(yīng)15 min，上機進(jìn)行檢測。試驗重復(fù)3次，每次5個復(fù)孔。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用LSD-t檢驗；計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EDD在SKOV3和SKOV3/DDP細(xì)胞中的表達(dá)

EDD基因和蛋白表達(dá)水平如圖1所示，SKOV3細(xì)胞中EDD基因與蛋白表達(dá)水平均顯著低于耐藥細(xì)胞SKOV3/DDP（P < 0.05）；EDD-siRNA處理24 h后，EDD mRNA表達(dá)水平顯著降低（P < 0.05）。Western blot結(jié)果顯示EDD-siRNA顯著抑制了SKOV3/DDP細(xì)胞中EDD蛋白的表達(dá)（P < 0.05），而NC siRNA對EDD mRNA和蛋白表達(dá)水平均無影響（P > 0.05）。見表1。

A：EDD mRNA表達(dá)；B：EDD表達(dá)電泳圖；C：EDD蛋白表達(dá)；1：SKOV3細(xì)胞；2：SKOV3/DDP細(xì)胞；3：SKOV3/DDP細(xì)胞+NC siRNA；4：SKOV3/DDP細(xì)胞+EDD-siRNA；與SKOV3細(xì)胞比較，*P < 0.05；與SKOV3/DDP細(xì)胞+EDD-siRNA比較，#P < 0.05

2.2 EDD-siRNA對SKOV3/DDP細(xì)胞順鉑耐藥指數(shù)的影響

MTT檢測細(xì)胞順鉑耐藥結(jié)果顯示，EDD-siRNA顯著降低了SKOV3/DDP細(xì)胞的IC50值[（4.93±0.75）比（13.18±1.46），P < 0.05]，對順鉑耐藥的逆轉(zhuǎn)效率高達(dá)77.03%，表明EDD-siRNA降低了SKOV3/DDP細(xì)胞對順鉑的耐藥性（P < 0.05）。見表2。

2.3 EDD-siRNA對順鉑誘導(dǎo)SKOV3/DDP細(xì)胞凋亡的影響

為了研究順鉑對細(xì)胞凋亡的影響，本試驗用20 μg/mL的順鉑作用細(xì)胞后，采用Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染法檢測了細(xì)胞的凋亡率。結(jié)果顯示（圖2），轉(zhuǎn)染EDD-siRNA使細(xì)胞凋亡率從（5.00±1.10）%上升到（40.12±3.78）%，顯著增強了順鉑對SKOV3/DDP細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用（P < 0.05）。

2.4 沉默EDD對SKOV3/DDP細(xì)胞CHK2和Mcl-1蛋白表達(dá)的影響

為檢測沉默SKOV3/DDP細(xì)胞中EDD的表達(dá)對CHK2和Mcl-1蛋白的影響，在成功轉(zhuǎn)染EDD-siRNA后，用Western blotting檢測了各組細(xì)胞中CHK2和Mcl-1蛋白表達(dá)水平（圖3）。結(jié)果顯示，EDD-siRNA使EDD沉默后，Mcl-1蛋白的表達(dá)被顯著抑制（P < 0.05），而CHK2蛋白未檢測到明顯差異（P > 0.05）。見表3。

3 討論

隨著對腫瘤研究的深入，腫瘤治療過程中細(xì)胞的化療耐藥越來越被重視。研究表明，EDD mRNA在化療后卡鉑耐藥性卵巢癌細(xì)胞[11-12]和順鉑耐藥黑素瘤細(xì)胞中[13]表達(dá)水平均升高，提示EDD在腫瘤細(xì)胞順鉑耐藥性中具有一定的作用。本試驗檢測了順鉑耐藥細(xì)胞SKOV3/DPP和非耐藥細(xì)胞SKOV3細(xì)胞中EDD的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無論是在mRNA水平還是蛋白水平，SKOV3/DDP細(xì)胞中EDD表達(dá)水平均顯著高于SKOV3細(xì)胞，表明EDD可能是卵巢癌細(xì)胞順鉑耐藥形成的相關(guān)因子。

為進(jìn)一步明確EDD與卵巢癌細(xì)胞順鉑耐藥性的相關(guān)性，本研究用EDD-siRNA轉(zhuǎn)染SKOV3/DDP細(xì)胞沉默EDD表達(dá)后，對細(xì)胞的順鉑耐藥指數(shù)進(jìn)行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)使EDD基因表達(dá)沉默后，SKOV3/DDP細(xì)胞對順鉑的耐藥性性顯著降低，對順鉑耐藥的逆轉(zhuǎn)效率高達(dá)77%。O'Brien等[7]研究發(fā)現(xiàn)，沉默對順鉑高度耐藥的卵巢癌細(xì)胞A2780-CP70中EDD的表達(dá)后，其對順鉑的敏感性增加。Bradley等[14]的研究也發(fā)現(xiàn)A2780ip2和OVCAR5 EDD shRNA細(xì)胞的順鉑敏感性顯著高于對照組。以上結(jié)果表明EDD在卵巢癌細(xì)胞順鉑耐藥的形成過程中擔(dān)任著重要的角色，進(jìn)一步了解EDD影響卵巢癌細(xì)胞的順鉑耐藥機制，對于卵巢癌的臨床治療將具有十分重要的意義。

順鉑作為抗腫瘤藥物的主要原因之一是其具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的效力，用合適的手段刺激耐藥細(xì)胞凋亡，或調(diào)控促凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，是恢復(fù)腫瘤細(xì)胞敏感性的一個重要方法。本試驗中，流式細(xì)胞儀的檢測結(jié)果顯示，通過轉(zhuǎn)染EDD-siRNA沉默EDD表達(dá)后，其細(xì)胞凋亡率顯著升高，表明轉(zhuǎn)染EDD-siRNA恢復(fù)了順鉑對SKOV3/DDP細(xì)胞的抗腫瘤作用。抗凋亡因子Mcl-1是順鉑作用的重要靶基因[15]，其過高表達(dá)會使癌細(xì)胞對化療產(chǎn)生抗性，甚至可能促進(jìn)癌癥的復(fù)發(fā)[16]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，沉默EDD導(dǎo)致Mcl-1蛋白表達(dá)也同步下調(diào)，表明抗凋亡因子Mcl-1與EDD對于調(diào)節(jié)SKOV3/DDP細(xì)胞順鉑耐藥可能具有一定的協(xié)同作用。

腫瘤化療過程中產(chǎn)生順鉑耐藥的機制之一就是DNA損傷細(xì)胞周期檢查點通路的激活[17]。CHK2在DNA復(fù)制-監(jiān)測S/G2檢查點系統(tǒng)中具有十分重要的作用[18]，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)CHK2與腫瘤細(xì)胞的順鉑耐藥具有一定的相關(guān)性[19-20]。EDD與細(xì)胞檢查點激酶CHK2之間可相互影響[8]。為找出通過沉默EDD基因表達(dá)提高腫瘤細(xì)胞順鉑敏感性，是否對EDD和CHK2的結(jié)合有直接的影響，本試驗通過Western blotting檢測了EDD-siRNA處理后的卵巢癌耐藥細(xì)胞中CHK2蛋白水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，siRNA使EDD沉默后，CHK2蛋白的表達(dá)并無明顯差異，其相關(guān)機制有待進(jìn)一步的研究。

綜上所述，EDD-siRNA轉(zhuǎn)染可成功地抑制SKOV3/DDP耐藥細(xì)胞EDD和Mcl-1蛋白的表達(dá)，增加順鉑對SKOV3/DDP細(xì)胞的凋亡刺激作用，恢復(fù)卵巢癌耐藥細(xì)胞的順鉑敏感性。因此，本試驗結(jié)果為EDD作為卵巢癌增敏治療的靶基因提供了理論證據(jù)。

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（收稿日期：2015-05-14 本文編輯：任 念）