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    不同生物狀態(tài)白色念珠菌對(duì)口腔上皮細(xì)胞的黏附能力及ALS mRNA表達(dá)

    2015-10-16 20:38張輝等
    中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào) 2015年26期
    關(guān)鍵詞:基因表達(dá)

    張輝等

    [摘要] 目的 觀察不同生物狀態(tài)白色念珠菌對(duì)口腔上皮細(xì)胞的黏附能力及ALS mRNA表達(dá),以期揭示口腔白色念球菌感染機(jī)制。 方法 將白色念珠菌3683、SC5314、3630與來源于50名健康志愿者的口腔上皮細(xì)胞混合培養(yǎng),采用革蘭陽性染色觀察白色念珠菌的黏附能力,采用熒光定量RT-PCR法檢測(cè)白色念珠菌3683、SC5314、3630中ALS2及ALS3 mRNA表達(dá)情況。采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。 結(jié)果 黏附實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,3株白色念珠菌均可黏附于口腔上皮細(xì)胞,且菌株3683黏附數(shù)量明顯多于菌株SC5314和菌株3630,統(tǒng)計(jì)學(xué)比較顯示,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.05),而菌株SC5314和菌株3630黏附數(shù)量比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P > 0.05)。熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示,白色念珠菌3683、SC5314、3630中均能檢測(cè)到ALS2及ALS3 mRNA表達(dá),其中,菌株3683 ALS2及ALS3 mRNA表達(dá)水平均高于菌株SC5314和菌株3630,統(tǒng)計(jì)學(xué)比較顯示,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.05);菌株3630 ALS2及ALS3 mRNA表達(dá)水平均高于菌株SC5314,但兩者比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P > 0.05)。 結(jié)論 不同生物狀態(tài)白色念珠菌的口腔上皮細(xì)胞黏附能力不同,菌株黏附能力的強(qiáng)弱可能與其ALS2及ALS3基因情況表達(dá)相關(guān)。

    [關(guān)鍵詞] 白色念珠菌;口腔上皮細(xì)胞;黏附能力;基因表達(dá)

    [中圖分類號(hào)] R781 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210(2015)09(b)-0016-04

    白色念珠菌為條件致病菌,長(zhǎng)居于人體口腔、皮膚、胃腸道等部位,在維持機(jī)體生態(tài)平衡方面發(fā)揮重要作用。近年來由于免疫抑制劑、抗生素等的廣泛使用,及糖尿病、艾滋病等發(fā)病率的逐年增加,導(dǎo)致患者機(jī)體免疫力低下,菌群失衡,使得白色念球菌大量繁殖,口腔白色念球菌感染率增加。白色念球菌的致病力與其黏附性有關(guān)[1-2]。研究顯示,在小鼠感染模型中,口腔感染念球菌分離株3683、皮膚感染念球菌分離株3630及系統(tǒng)感染血液念球菌分離株SC5314致病能力差異較大,各菌株的黏膜黏附力不同可能是影響其致病能力的原因之一[3]。ALS基因家族主要編碼白色念珠菌細(xì)胞壁表面的糖蛋白,與白色念珠菌和宿主間的黏附性密切相關(guān)。有研究證實(shí),白色念球菌ALS基因在生物膜中的表達(dá)升高[4-5]。本研究刮取人口腔上皮細(xì)胞,并與白色念珠菌3683、SC5314、3630混合培養(yǎng),檢測(cè)不同生物狀態(tài)白色念珠菌對(duì)口腔上皮細(xì)胞黏附能力及ALS mRNA表達(dá)情況,以期觀察不同白色念珠菌致病力的差異,探討其感染作用機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    白色念珠菌3683、SC5314、3630購自于ATCC;人口腔上皮細(xì)胞來源于50名健康志愿者。

    1.2 試劑與儀器

    沙堡液體培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基及胎牛血清均購自美國Gibco公司;青霉素、鏈霉素及胰蛋白酶均購自美國Sigma公司;EDTA及細(xì)胞計(jì)數(shù)板購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;Trizol購自美國Invitrogenin公司;熒光定量PCR試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司;引物購自上海生工;搖床購自德國UniEquip公司;ABI 3900臺(tái)式高通量DNA合成儀、ABI 9700 PCR儀及ABI 7500全自動(dòng)熒光定量均購自美國ABI公司。

    1.3 白色念珠菌培養(yǎng)

    將白色念珠菌3683、SC5314、3630接種于20 mL沙堡液體培養(yǎng)基中,于搖床培養(yǎng)18 h(37℃,200 r/min)。收集細(xì)菌,PBS洗2次,調(diào)整菌密度為1×107個(gè)/mL。

    1.4 人口腔上皮細(xì)胞獲取及培養(yǎng)

    以細(xì)胞刮棒刮取來自浙江省溫嶺市第一人民醫(yī)院的50名健康志愿者口腔上皮細(xì)胞,PBS洗兩次,置于含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中,調(diào)整細(xì)胞密度為1×107個(gè)/mL。

    1.5 黏附能力檢測(cè)

    將口腔上皮細(xì)胞與白色念珠菌3683、SC5314、3630以1∶100比例混合置于6孔板內(nèi),在搖床中孵育1 h(37℃,100 r/min)。行革蘭陽性染色,顯微鏡下隨機(jī)選擇50個(gè)口腔上皮細(xì)胞,計(jì)數(shù)每個(gè)口腔上皮細(xì)胞上黏附的白色念珠菌數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。黏附能力計(jì)算為念球菌數(shù)/口腔上皮細(xì)胞數(shù)。

    1.6 熒光定量RT-PCR

    1.6.1 白色念珠菌

    白色念珠菌培養(yǎng)同“1.3”項(xiàng)下,PBS洗3次,調(diào)整菌密度為2×106個(gè)/mL。

    1.6.2 口腔上皮細(xì)胞

    細(xì)胞獲取同“1.4”項(xiàng)下,調(diào)整細(xì)胞密度為2×105個(gè)/孔接種于6孔板。

    1.6.3 共培養(yǎng)及觀察

    將口腔上皮細(xì)胞與白色念珠菌3683、SC5314、3630分別以1∶10比例混合,RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng),接種于6孔板,每孔1.5 mL,培養(yǎng)6 h,光學(xué)顯微鏡觀察后,收集細(xì)胞,離心,置于-80℃冰箱保存。

    1.6.4. 引物設(shè)計(jì)

    ALS2:上游引物:5'-CCA AGT ATT AAC AAA GTT TCA ATC ACT TAT-3',下游引物:3'-TCT CAA TCT TAA ATT GAA CGG CTT-5',引物長(zhǎng)度為366 bp。

    ALS3:上游引物:5'-CCA CTT CAC AAT CCC CAT C-3',下游引物:3'-CAG CAG TAG TAG TAA CAG TAG TAG TTT CAT C-5',引物長(zhǎng)度為342 bp。

    GAPDH:上游引物:5'-TTG ACG GTC CAT CCC ACA A-3',下游引物:3'-GGA ATA ACC TTA CCA ACG GCT TT-5',引物長(zhǎng)度為103 bp。

    1.6.5 總RNA提取

    用預(yù)冷的DEPC水1 mL清洗白色念珠菌,置于1.5 mL EP管中,加入1 mL Trizol,靜置5 min;加入0.2 mL氯仿,蓋緊EP管,上下傾倒15 s,室溫靜置2~3 min,4℃ 12 000 r/min離心15 min,取上清;加入0.5 mL異丙醇,-20℃放置1 h,4℃ 12 000 r/min離心10 min,棄上清;75%乙醇洗2次,4℃ 12000 r/min離心5 min,棄上清,吸取殘存乙醇;無菌臺(tái)干燥5~10 min,加DEPC水溶解,-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.6.6 RNA純度檢測(cè)

    應(yīng)用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA純度,分別測(cè)定260 nm和280 nm波長(zhǎng)下RNA的吸光度,計(jì)算A260/A280,若比值在1.8~2.0之間則提示RNA質(zhì)量較好。

    1.6.7 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

    反應(yīng)體系為5×逆轉(zhuǎn)錄buffer 2 μL、RNA酶抑制劑0.5 μL、dNTP 2 μL、RNase free dH2O 7.5 μL、OligodT 1 μL、Mgcl2 4 μL、AMV反轉(zhuǎn)錄酶 1 μL、RNA模板2 μL,反轉(zhuǎn)錄體系共計(jì)20 μL;混勻后置于PCR儀中,反應(yīng)條件為:42℃ 1 h,99℃ 5 min;得到cDNA模板,置于-20℃保存。

    1.6.8 熒光定量PCR

    1.6.8.1 標(biāo)準(zhǔn)品制備 陽性標(biāo)準(zhǔn)品:預(yù)實(shí)驗(yàn)PCR擴(kuò)增陽性產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳,紫外光下切割目的條帶。采用回收試劑盒回收純化。利用A260測(cè)得值和片段長(zhǎng)度計(jì)算其濃度,作為陽性標(biāo)準(zhǔn)品。陰性標(biāo)準(zhǔn)品:采用滅菌雙蒸水。

    1.6.8.2 反應(yīng)體系 5×SYBR Green Ⅰ PCR buffer 10 μL,上游引物1 μL,下游引物1 μL,dNTPs 1 μL,Taq酶1 μL,cDNA或陽性標(biāo)準(zhǔn)品1 μL,ddH2O 35 μL,反應(yīng)體系共計(jì)50 μL。

    1.6.8.3 反應(yīng)條件 95℃ 3 min,95℃ 30 s,50℃ 45 s,共行42個(gè)循環(huán)。

    1.6.8.4 數(shù)據(jù)測(cè)定 反應(yīng)結(jié)束后,電腦分析結(jié)果,RNA表達(dá)=目的基因拷貝數(shù)/GAPDH基因拷貝數(shù)。

    1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn),以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 白色念珠菌對(duì)口腔上皮細(xì)胞的黏附能力

    白色念珠菌3683、SC5314、3630與口腔上皮細(xì)胞共培養(yǎng)1 h后,革蘭染色結(jié)果顯示,3株白色念珠菌均可黏附于口腔上皮細(xì)胞,且菌株3683黏附數(shù)量(15.74±0.83)明顯多于菌株SC5314(13.04±0.62)和菌株3630(13.11±0.57),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.05),而菌株SC5314和菌株3630黏附數(shù)量比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P > 0.05)。

    2.2 ALS2及ALS3 mRNA表達(dá)情況

    念珠菌口腔與上皮細(xì)胞混合培養(yǎng)6 h,顯微鏡下觀察顯示口腔上皮細(xì)胞形態(tài)完整,周圍黏附有白色念球菌,部分細(xì)胞已破裂為細(xì)胞碎片?;驒z測(cè)結(jié)果顯示,混合培養(yǎng)6 h后,白色念珠菌3683、SC5314、3630中均能檢測(cè)到ALS2及ALS3 mRNA表達(dá),其中,菌株3683 ALS2及ALS3 mRNA表達(dá)率均高于菌株SC5314和菌株3630,統(tǒng)計(jì)學(xué)比較顯示,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.05);菌株3630 ALS2及ALS3 mRNA表達(dá)水平均高于菌株SC5314,但兩者比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P > 0.05)。見表1。

    3 討論

    白色念球菌是人體重要的機(jī)會(huì)致病菌,調(diào)查表明,近年白色念球菌的檢出率逐年升高,其導(dǎo)致的醫(yī)院感染排在第4位,且死亡率高達(dá)50%左右[6-7]。研究已經(jīng)證實(shí),黏附性為白色念球菌的致病機(jī)制之一[8]。過往白色念球菌對(duì)口腔上皮細(xì)胞的黏附性研究較多,但不同生物狀態(tài)白色念珠菌黏附性的差異鮮有報(bào)道。本研究觀察白色念珠菌3683、SC5314、3630對(duì)口腔上皮細(xì)胞的黏附能力,對(duì)治療選擇的臨床指導(dǎo)意義重大。

    本研究黏附實(shí)驗(yàn)是將白色念珠菌與口腔上皮細(xì)胞混合培養(yǎng),觀察一定時(shí)間后每個(gè)口腔上皮細(xì)胞黏附白色念珠菌數(shù),該方法可直觀證明菌株的黏附力,且操作簡(jiǎn)單[9]。本研究黏附實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,3株白色念珠菌均可黏附于口腔上皮細(xì)胞,且菌株3683黏附數(shù)量明顯多于菌株SC5314和菌株3630,統(tǒng)計(jì)學(xué)比較顯示,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.05),而菌株SC5314和菌株3630黏附數(shù)量比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P > 0.05)。提示白色念珠菌株3683的黏附力最強(qiáng),其對(duì)口腔的致病力最強(qiáng)。導(dǎo)致不同生物狀態(tài)白色念珠菌對(duì)口腔上皮細(xì)胞黏附能力差異的原因有待進(jìn)一步分析。Zhao等[10]研究證實(shí),野生型白色念球菌株(CA112)、剔除ALS3基因的白色念球菌株(als3/als31843)及剔除了ALS1基因的白色念球菌株(als1/als11467)對(duì)頰上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮包被的細(xì)胞培養(yǎng)板的黏附作用不同,其中,菌株als3/als31843對(duì)頰上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附數(shù)明顯較低,而菌株als1/als11467僅對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附能力較低。該結(jié)果提示了ALS家族基因功能的差異性及ALS3基因可能參與了白色念珠菌的黏附作用機(jī)制。

    研究發(fā)現(xiàn),ALS家族各基因的功能不同[11-12]。一項(xiàng)對(duì)陰道念球菌感染的研究發(fā)現(xiàn),雖然在感染過程中ALS家族各基因均檢出,但ALS3基因的檢出率最高[13]。小鼠口腔念球菌感染模型初期檢測(cè)顯示,ALS1~4均可檢出,提示其在念球菌感染初期已表達(dá)[14-15]。本研究結(jié)果顯示,念珠菌口腔與上皮細(xì)胞混合培養(yǎng)6 h,白色念珠菌3683、SC5314、3630中均能檢測(cè)到ALS2及ALS3 mRNA表達(dá),其中,菌株3683 ALS2及ALS3 mRNA表達(dá)率均高于菌株SC5314和菌株3630,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.05);菌株3630 ALS2及ALS3 mRNA表達(dá)率均高于菌株SC5314,但兩者比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P > 0.05)。結(jié)合本研究黏附實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見,白色念珠菌對(duì)口腔上皮細(xì)胞的黏附能力與菌株中ALS2及ALS3基因的表達(dá)強(qiáng)弱有關(guān),其中黏附能力強(qiáng)的菌株3683其ALS2及ALS3基因表達(dá)水平高。提示ALS2及ALS3基因高表達(dá)可能為口腔白色念球菌感染致病機(jī)制之一。

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