荷花MADS—box基因的克隆及表達(dá)分析

王婧

摘要：采用RT-PCR方法從微山紅蓮花苞中克隆獲得1個(gè)與花發(fā)育相關(guān)的MADS-box基因，命名為NeMADS1。該基因全長(zhǎng)729 bp，包含1個(gè)720 bp的開放閱讀框，編碼239個(gè)氨基酸，具有典型的MADS結(jié)構(gòu)域和K結(jié)構(gòu)域。序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明，NeMADS1與E類家族AGL9/SEP-like3基因親緣關(guān)系較近。RT-PCR分析結(jié)果表明，NeMADS1基因在花瓣、雄蕊和心皮中表達(dá)。

關(guān)鍵詞：荷花；花發(fā)育；MADS-box；基因表達(dá)；RT-PCR

中圖分類號(hào)： S682.320.1；Q785 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2017）01-0039-04

花發(fā)育的分子機(jī)理一直是植物分子生物學(xué)研究的熱點(diǎn)，MADS-box基因家族作為轉(zhuǎn)錄因子，在花發(fā)育過程中起重要作用。MADS-box基因不僅參與花發(fā)育的調(diào)控，還在開花時(shí)間的控制、決定分生組織的分化[1]、促進(jìn)根的形成[2]，以及種子和果實(shí)發(fā)育[3-4]等方面都起著重要的作用。

前人在對(duì)雙子葉模式植物遺傳突變體的研究中，提出了花器官發(fā)育ABCDE模型[5-10]。典型雙子葉植物的花大多具有由外到內(nèi)4輪結(jié)構(gòu)：萼片、花瓣、雄蕊和心皮。模型認(rèn)為控制花器官發(fā)育的基因按功能可以分成5類（A～E類功能基因），這些基因單獨(dú)或共同作用控制各輪花器官的發(fā)育[9]。隨著對(duì)擬南芥、矮牽牛、金魚草等模式植物的研究，已經(jīng)克隆到很多MADS-box基因，僅擬南芥中就有100多種MADS-box基因[11]。

SEP（SEPALLATA）基因?qū)儆贛ADS-box E類基因[9]，是花器官發(fā)育所必需的。擬南芥中有4個(gè)SEP基因：SEP1、SEP2、SEP3、SEP4（又稱AGL2、AGL4、AGL9、AGL3）[12-15]，SEP1、SEP2、SEP4基因在擬南芥花發(fā)育的早期花分生組織中起始表達(dá)；而SEP3主要在內(nèi)3輪花器官原基中表達(dá)。隨著花原基的進(jìn)一步發(fā)育，SEP1和SEP2在4輪花器官中均有表達(dá)[14]，而SEP3僅在花瓣、雄蕊和雌蕊中表達(dá)[8]，SEP4主要在萼片中表達(dá)[16]。目前為止，研究人員已從桃[17]、蘋果[18]、草莓[19]、春蘭[20]、文心蘭[21]等多種植物中分離克隆了SEP-like同源基因，并且對(duì)其表達(dá)模型及功能開展了相關(guān)研究。

荷花（Nelumbo nucifera Gaertn.），別稱蓮花，是中國(guó)十大傳統(tǒng)名花之一，具有很高的觀賞價(jià)值。目前，有關(guān)荷花花器官發(fā)育MADS-box基因的研究報(bào)道較少，更未見AGL9/SEP-like基因的研究報(bào)道。本研究以微山紅蓮的花苞為試驗(yàn)材料，采用RT-PCR技術(shù)克隆獲得1個(gè)荷花花器官發(fā)育 MADS-box家族E類相關(guān)基因NeMADS1的全長(zhǎng)序列，并分析其表達(dá)模式，為蓮科植物進(jìn)化研究提供依據(jù)，同時(shí)為研究植物花發(fā)育模式以及荷花花器官發(fā)育的分子機(jī)理奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 植物材料

以吉林省經(jīng)濟(jì)管理干部學(xué)院基地的微山紅蓮為試驗(yàn)材料，于2015年8月取雌蕊分化后期花苞進(jìn)行基因克隆。取盛花期花朵的萼片、花瓣、雄蕊、心皮進(jìn)行RT-PCR表達(dá)分析。所有材料采集后均立即用液氮處理，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 總RNA提取及cDNA合成

以雌蕊分化后期花苞為材料，采用十六烷基三甲基溴化銨法（CTAB法）提取其總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（SuperScriptTM Ⅲ Reverse Transcriptase， Invitrogen）合成cDNA，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3 基因克隆與序列分析

查找NCBI中EST序列信息及相關(guān)資料設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增基因全長(zhǎng)，引物序列NeS1-F：5′-CTGAAATGGGGAGAGGTAGGGT-3′、NeS1-R：5′-CTGATCATGCCAGCCACCCAGGC-3′，以荷花花苞的cDNA為模板進(jìn)行基因全長(zhǎng)PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為25 μL，反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并回收目的片段，連接到pMD-19T（TAKARA）載體上，轉(zhuǎn)化DH5α菌株，進(jìn)行克隆、測(cè)序。引物合成和測(cè)序均由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行。

采用DNAMAN軟件進(jìn)行序列拼接和分析，獲得的序列在NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）網(wǎng)站上進(jìn)行Blast比對(duì)，用MEGA 5.0和ClustalX軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.4 RT-PCR表達(dá)分析

提取盛花期花萼、花瓣、雄蕊和心皮的總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行RT-PCR表達(dá)分析。設(shè)計(jì)引物NeS1-F2：5′-AACAGGGCATTGAAACGG-3′，NeS1-R2：5′-AGCCACCCAGGCATATAAC-3′，定量PCR采用SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ kit（TAKARA）。反應(yīng)體系為：10 μL SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ（2×）mix，0.8 μL forward primer，0.8 μL reverse primer，2 μL cDNA，0.4 μL Rox Reference Dye or Dye（50×），6.0 μL H2O。反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。以Actin為內(nèi)參（Actin-F：5′-TGCCTATGTGGCTCTTGACTAT-3′，Actin-R：5′-GATGGCTGGAATAGAACCTCA-3′）在Roche Lignt Cycler 2.0熒光定量PCR儀上反應(yīng)，3次重復(fù)，采用2-ΔΔCT法進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因克隆與序列分析

以雌蕊分化后期的花苞總RNA反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分離出長(zhǎng)度為729 bp的片段，NCBI上進(jìn)行Blast比對(duì)分析，結(jié)果表明該片段與多種植物的MADS-box基因有較高同源性，證明該片段為所需目的片段。通過DNAMAN軟件的序列拼接和分析，獲得基因全長(zhǎng)為720 bp，編碼239個(gè)氨基酸（圖1），命名為NeMADS1。

蛋白結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果表明，該蛋白是植物特有的MIKC型MADS-box基因，包含典型的MADS盒（實(shí)線部分）和K盒（雙線部分）。Blast同源序列分析該基因與其他植物AGL9/SEP-like3基因具有較高的同源性。

2.2 NeMADS1氨基酸同源性比較

利用NCBI的BlastX工具將NeMADS1基因核酸序列翻譯成氨基酸序列并進(jìn)行同源性比對(duì)，結(jié)果表明：NeMADS1與ABCDE模型中的E類蛋白有較高的同源性，其中與EpSEP3、PaAGL9、EcAGL9和PtSEP3的同源性分別是87%、84%、84%、83%。對(duì)NeMADS1基因氨基酸序列的多序列比對(duì)結(jié)果表明：SEP-like基因編碼氨基酸序列含有高度保守的5′端MADS結(jié)構(gòu)域和半保守的K結(jié)構(gòu)域，在差別較大3′端C-末端中發(fā)現(xiàn)了SEP-like蛋白特有的SEPⅠ和SEPⅡ基序結(jié)構(gòu)域（圖2）。

2.3 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析結(jié)果表明，NeMADS1編碼蛋白與 ABCDE 模型中的AGL9/SEP-like3（E類）基因編碼蛋白同源性較高，與領(lǐng)春木（Euptelea pleiosperma）的EpSEP3關(guān)系最近，說明NeMADS1應(yīng)屬于E類MADS-box基因（圖3）。

A類和E類基因在進(jìn)化上屬于AP1/AGL9組，該組有3個(gè)進(jìn)化系：AGL9（SEP）、AP1和介于二者之間的AGL6進(jìn)化系[21-22]。為了確定NeMADS1的歸類及進(jìn)化關(guān)系，選取 AP1/AGL9 組MADS-box基因的氨基酸序列進(jìn)行聚類分析。結(jié)果顯示，AP1/AGL9組氨基酸序列明顯分為3類：SEP、AP1和AGL6，其中AGL6與SEP分枝為姊妹關(guān)系，所有AGL9、SEP3聚在一起，然后又與SEP1/2/4聚在了一個(gè)大枝上（圖3）。

2.4 RT-PCR表達(dá)分析

RT-PCR分析結(jié)果表明，NeMADS1基因在花瓣、雄蕊和心皮中表達(dá)量較高，尤其在花瓣中表達(dá)量最高，在花萼中表達(dá)量最低。NeMADS1基因的表達(dá)模式與擬南芥SEP3基因在各組織的表達(dá)模式一致，進(jìn)一步說明NeMADS1屬于E類基因（圖4）。

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)采用RT-PCR技術(shù)克隆了與花發(fā)育相關(guān)的NeMADS1基因。同源性分析結(jié)果表明，NeMADS1基因與其他植物的AGL9/SEP-like3基因具有較高的同源性，其蛋白質(zhì)包含MADS區(qū)、K區(qū)、I區(qū)和C-末端等4個(gè)區(qū)域，屬于植物典型的MIKC類MADS-box基因。MADS-box蛋白的C-末端被認(rèn)為與轉(zhuǎn)錄激活、高階蛋白質(zhì)復(fù)合體的形成、DNA特異性識(shí)別、亞細(xì)胞定位等有關(guān)[23]。SEP亞家族大部分成員的C端具有2個(gè)短的、相對(duì)保守的基序（SEPⅠ和SEPⅡ基序）[15]。NeMADS1基因具有保守的SEPⅠ和SEPⅡ基序，是典型的SEP-like基因。

通過對(duì)SEP-like基因的系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)SEP亞家族發(fā)生過多次基因重復(fù)事件，其中在被子植物起源之前發(fā)生了1次基因重復(fù)事件，產(chǎn)生了SEP3進(jìn)化系和SEP1/2/4進(jìn)化系[15]。本研究對(duì)NeMADS1基因系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，所有的AGL9/SEP-like3聚在了一起，其中與領(lǐng)春木、昆欄樹（Trochodendron aralioides）的關(guān)系較近， 而三者均屬于基部雙子葉植物，這個(gè)結(jié)果與APGⅢ分類系統(tǒng)一致，說明AGL9/SEP-like3基因在進(jìn)化上相對(duì)保守，同時(shí)也為蓮科在系統(tǒng)進(jìn)化中所屬的位置提供了證據(jù)。

荷花SEP-like基因NeMADS1在花瓣、雄蕊和心皮中表達(dá)，這與擬南芥SEP3基因、加州罌粟（Eschscholzia californica）EScaAGL9基因在表達(dá)模式上一致[15]，而與草原龍膽（Eustoma grandiflorum）EgSEP3-1基因的表達(dá)模式有所差異[24]。SEP作為花器官同源異型基因ABCD的共因子（co-factor）在各輪花器官?zèng)Q定中發(fā)揮作用[8]。事實(shí)上，各進(jìn)化系的表達(dá)模式是存在差異的[25]，雖然E類基因的表達(dá)模式在被子植物不同的物種中有差異，但該基因?qū)λ谢ㄆ鞴俚陌l(fā)育都是必需的，其功能是保守的。

本試驗(yàn)中分離出1個(gè)MADS-box基因家族E類基因，并對(duì)其功能進(jìn)行了初步分析，有關(guān)其時(shí)空表達(dá)模式和深入功能分析工作也正在進(jìn)行中，以期為闡明荷花花器官發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]Weigel D，Nilsson O.A developmental switch sufficient for flower initiation in diverse plants[J]. Nature，1995，377（6549）：495-500.

[2]Alvarezbuylla E R，Liljegren S J，Pelaz S，et al. MADS-box gene evolution beyond flowers： expression in pollen，endosperm，guard cells，roots and trichomes.[J]. Plant Journal for Cell & Molecular Biology，2000，24（4）：457-66.

[3]Buchner P，Boutin J-P.A MADS box transcription factor of the AP1/AGL9 subfamily is also expressed in the seed coat of pea （Pisum sativum） during development[J]. Plant Molecular Biology，1998，38（6）：1253-1255.

[4]Gu Q，F(xiàn)errándiz C，Yanofsky M F，et al.The FRUITFULL MADS-box gene mediates cell differentiation during Arabidopsis fruit development[J]. Development，1998，125（8）：1509-1517.

[5]Coen E S，Meyerowitz E M.The war of the whorls： genetic interactions controlling flower development[J]. Nature，1991，353（6339）：31-37.

[6]Honma T，Goto K.Complexes of MADS-box proteins are sufficient to convert leaves into floral organs[J]. Nature，2001，409（6819）：525-529.

[7]Jack T.Molecular and genetic mechanisms of floral control[J]. The Plant Cell Online，2004，16（S1）：S1-S17.

[8]Pelaz S，Ditta G S，Baumann E，et al.B and C floral organ identity functions require SEPALLATA MADS-box genes[J]. Nature，2000，405（6783）：200-203.

[9]Theissen G，Saedler H.Plant biology： floral quartets[J]. Nature，2001，409（6819）：469-471.

[10]Colombo L，F(xiàn)ranken J，Koetje E，et al. The petunia MADS box gene FBP11 determines ovule identity[J]. The Plant Cell，1995，7（11）：1859-1868.

[11]郭 爽，馬 寧，楊文才，等. 辣椒花器官發(fā)育MADS-box基因的克隆與表達(dá)分析[J]. 園藝學(xué)報(bào)，2010，37（10）：1591-1597.

[12]Huang H，Tudor M，Weiss C A，et al.The Arabidopsis MADS-box gene AGL3 is widely expressed and encodes a sequence-specific DNA-binding protein[J]. Plant Molecular Biology，1995，28（3）：549-567.

[13]Ma H，Yanofsky M F，Meyerowitz E M.AGL1-AGL6，an Arabidopsis gene family with similarity to floral homeotic and transcription factor genes[J]. Genes & Development，1991，5（3）：484-495.

[14]Mandel M，Yanofsky M F.The Arabidopsis AGL9 MADS box gene is expressed in young flower primordia[J]. Sexual Plant Reproduction，1998，11（1）：22-28.

[15]Zahn L M，Kong H，Leebens-Mack J H，et al. The evolution of the SEPALLATA subfamily of MADS-Box genes：a preangiosperm origin with multiple duplications throughout angiosperm history[J]. Genetics，2005，169（4）：2209-2223.

[16]Ditta G，Pinyopich A，Robles P，et al. The SEP4 gene of Arabidopsis thaliana functions in floral organ and meristem identity[J]. Current Biology，2004，14（21）：1935-1940.

[17]Tani E，Polidoros A N，F(xiàn)lemetakis E，et al. Characterization and expression analysis of AGAMOUS-like，SEEDSTICK-like，and SEPALLATA-like MADS-box genes in peach （Prunus persica） fruit[J]. Plant Physiology and Biochemistry，2009，47（8）：690-700.

[18]Ireland H S，Yao J L，Tomes S，et al.Apple SEPALLATA1/2-like genes control fruit flesh development and ripening[J]. The Plant Journal，2013，73（6）：1044-1056.

[19]Seymour G B，Ryder C D，Cevik V，et al.A SEPALLATA gene is involved in the development and ripening of strawberry （Fragaria×ananassa Duch.） fruit，a non-climacteric tissue [J]. Journal of Experimental Botany，2011，62（3）：1179-1188.

[20]Chunlei J，Lin X，Dehui Q，et al.Cloning and expression analysis of CgSEP3 gene from Cymbidium goeringii[J]. Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica，2014.

[21]Chang Y，Chiu Y，Wu J，et al.Four orchid （Oncidium Gower Ramsey）AP1/AGL9-like MADS box genes show novel expression patterns and cause different effects on floral transition and formation in Arabidopsis thaliana[J]. Plant and Cell Physiology，2009，50（8）：1425-1438.

[22]Purugganan M D，Rounsley S D，Schmidt R J，et al.Molecular evolution of flower development： diversification of the plant MADS-box regulatory gene family[J]. Genetics，1995，140（1）：345-356.

[23]Vandenbussche M，Theissen G，Van de Peer Y，et al.Structural diversification and neo-functionalization during floral MADS-box gene evolution by C-terminal frameshift mutations[J]. Nucleic Acids Research，2003，31（15）：4401-4409.

[24]徐啟江，關(guān)錄飛，吳笑女，等. 草原龍膽MADS-box基因的克隆及表達(dá)分析[J]. 植物學(xué)報(bào)，2008，25（4）：415-429.

[25]Malcomber S T，Kellogg E A.SEPALLATA gene diversification： brave new whorls[J]. Trends in Plant Science，2005，10（9）：427-435.余磊磊，周京龍，高中南，等. 野生白芨再生體系的建立及抗性篩選[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45（1）：43-46.