不同促透劑運用于隔藥餅灸對高脂血癥合并動脈粥樣硬化兔主動脈形態(tài)及血清IL-6、IL-10的影響

廖宗力 孫璐 朱重政 黃文韜 譚靜 陽仁達

[摘要]目的探討氮酮和冰片作為促透劑運用于隔藥餅灸對高脂血癥合并動脈粥樣硬化兔主動脈病理形態(tài)及血清炎癥因子的影響。方法選取40只新西蘭純種兔隨機分成5組，每組8只，即正常組、模型組、無促透劑組、氮酮組和冰片組。高脂血癥合并動脈粥樣硬化兔模型造模成功后除正常組和模型組外，其余各組采用隔藥餅灸干預，每日1次，連續(xù)4周。采用ELISA檢測血清白細胞介素6（Interleukin 6.IL-6）、白細胞介素10（Interleukin 10.IL-10）含量;采用HE染色，光學顯微鏡下觀察主動脈組織形態(tài)。結果與正常組比，模型組IL-6水平顯著升高、IL-10水平顯著降低（P<0.01）;與模型組比，無促透劑組、氮酮組及冰片組IL-6水平顯著降低（P<0.01）、IL-10水平升高（p<0.05）;與無促透劑比，氮酮組和冰片組IL-6水平顯著降低（P<0.01）、IL-10差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;與氮酮組比，冰片組IL-6水平顯著降低（P<0.01）、IL-10差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。主動脈組織鏡檢結果示：正常組無異常;模型組可見組織整體凌亂，管腔壁可見明顯增厚，內皮壞死，有明顯的脂質斑塊及泡沫細胞;無促透劑組有內膜增厚，可見少量泡沫細胞，細胞排列較模型組稍好，脂質沉積明顯較模型組減少，斑塊不明顯;氮酮組和冰片組無顯著異常。結論隔藥餅灸對高脂血癥合并動脈粥樣硬化兔具有抑制炎癥反應和抗動脈粥樣硬化作用，在藥餅中加入促透劑后施灸療效更優(yōu)，可能與藥餅中藥物透皮吸收增強有關，值得進一步臨床應用和研究。

[關鍵詞]隔藥餅灸;促透劑;高脂血癥;動脈粥樣硬化;白細胞介素6;白細胞介素10

[中圖分類號]R245.8[文獻標志碼]A [文章編號]doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.11.017

高脂血癥（hyperlipidemia，HLP）是由于體內脂質轉運和（或）代謝異常，導致機體血液脂質水平異常的病癥。長期HLP導致脂質及泡沫細胞沉積在動脈內膜中，是誘發(fā)和促進動脈粥樣硬化（atheroscle-rosis，AS）的重要危險因素。有研究表明，炎癥反應貫穿AS病理變化全程，單純降低低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterin，LDL-C）對AS療效較差，同時進行炎癥控制才能取得良好療效。目前，HLP及AS病越來越高發(fā)，嚴重影響人們的健康與生活工作。臨床對HLP及AS治療方法較多且療效確切，但藥物內服所致毒副作用一直困擾HLP患者和醫(yī)務工作者，因此，積極探索安全有效、便捷價廉、依從性高的降脂外治方案對促進患者健康、延長患者壽命、提高其生活質量有著重要的意義。李娟等研究表明，傳統(tǒng)中醫(yī)藥療法在降脂中療效確切。隔藥餅灸是一種特色中醫(yī)外治療法，課題組前期大量研究表明隔藥餅灸降脂及治療AS療效肯定。因此，本研究探討了在藥餅中加入不同促透劑后施灸對HLP合并AS兔主動脈形態(tài)結構及血清炎癥因子IL-6、IL-10的影響是否優(yōu)于單純隔藥餅灸，以進一步探索增強隔藥餅灸療效的方案。

1材料與方法

1.1 實驗動物與分組

選用40只6-8月齡新西蘭純種兔（體質量2.0-2.5kg），由湖南中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供（清潔級，動物合格證號：SYXK<湘>2013-0005）。分籠飼養(yǎng)于動物實驗室。溫度保持20-25℃，濕度保持50%-70%。兔籠、籠架、食槽、水杯在使用前嚴格消毒處理并定時沖洗。按時按量喂養(yǎng)飼料，正式實驗前適應性普通飼料喂養(yǎng)7d。按隨機數(shù)字表法分成正常組、模型組、無促透劑組（高脂模型+使用水作溶劑做的藥餅施灸）、氮酮組（高脂模型+使用氮酮溶液做的藥餅施灸）、冰片組（高脂模型組+使用冰片溶液做的藥餅施灸），每組8只。

1.2 主要試劑及儀器

氮酮（新鄉(xiāng)高金藥業(yè)有限公司，59227-89-3），精密量取脂溶性氮酮溶液5mL溶于100mL無水乙醇溶液中，混勻備用：冰片（山東百味堂飲片有限公司，207-352-6），精密稱取冰片2g溶于50mL無水乙醇溶液中，再加入蒸餾水35mL稀釋備用：10%烏拉坦（山東省齊魯興華制藥有限公司，51-79-6）無水乙醇（SIGMA公司，E7023）;4%多聚甲醛（So-larbio）;神灸300灸艾炷（蘇州東方艾絨廠，東方一型）;丙硫氧嘧啶（國藥集團藥業(yè)股份有限公司，XW00515251）;膽固醇（國藥集團藥業(yè)股份有限公司，69008214）;蛋黃粉（亳州海川蛋制品有限公司，57583-35-8）;豬油（市售）。藥餅中藥物組成：丹參、大黃、山楂、郁金、澤瀉（購于湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院中藥房），將所有飲片打粉過200目篩等比例混合。藥餅制作：將藥粉按分組不同分別加入蒸餾水、氮酮溶液、冰片溶液調成糊狀，比例為每100g藥粉加入80mL溶液，用統(tǒng)一規(guī)格模具制作直徑為1cm，高3mm的藥餅。

酶標板（40孔或96孔）;臺式冷凍離心機（北京時代北利離心機有限公司，GTRl6-2）：全自動酶標洗板機（濟南來寶醫(yī)療器械有限公司，ST-36W）;酶標儀（南京德鐵實驗設備有限公司，HBS-1096A）;恒溫振蕩器（天津歐諾儀器股份有限公司，HNY-200B）;奧林巴斯顯微鏡（南京伊若達儀器設備有限公司，BX43）。兔IL-6ELISA試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，E-EL-RB0014c）：兔IL-10ELISA試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，E-EL-RB0487c）。

1.3模型制備

正常組采用普通飼料喂養(yǎng)，其余動物參考方法改良造模：每天于上午8：00喂養(yǎng)高脂飼料，每只兔約吃高脂飼料100g，其中蛋黃粉為15g、膽固醇為0.5g、豬油為5g、丙硫氧嘧啶為10mg/kg，其余為基礎飼料。將以上成分按照比例混合（豬油加熱溶解）拌勻，然后加工成顆粒狀高脂飼料。喂養(yǎng)時，先喂完高脂飼料后再添加普通飼料，每只兔每天進食總量約為100-130g。飲水不限制，連續(xù)喂養(yǎng)12周后，隨機抽樣解剖見兔主動脈內壁有脂質斑塊出現(xiàn)，參考戴氏標準檢測動物血清TC、TG升高，與正常組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），表明造模成功。

1.4分組干預

正常組普通飼料常規(guī)喂養(yǎng)，模型組不予施灸，無促透劑組采用蒸餾水藥餅、氮酮組采用氮酮溶液藥餅、冰片組采用冰片溶液藥餅行隔藥餅灸，每日1次，連續(xù)4周。

1.5 穴位選擇

參照李忠仁主編《實驗針灸學》及擬人比照法制定取穴方法，采用如下兩組穴位，每天施灸一組穴位，兩組穴位交替施灸。A組取穴：雙天樞、巨闕、雙豐?。築組取穴：雙心俞、雙脾俞、雙肝俞。

1.6 隔藥餅灸方法

將兔固定在兔臺上，定位取穴后將穴位周圍2cm兔毛剪除。用8%硫化鈉溶液脫毛至兔皮裸露，用生理鹽水沖洗干凈，確保皮膚無破損。將艾炷放在藥餅上，一起放于穴位上方皮膚處，點燃艾炷施灸。每組穴位隔天灸1次，兩組穴位交替施灸，每穴4炷（約30min），連續(xù)4周。

1.7 檢測指標及方法

1.7.1 血清指標檢測 將兔固定、麻醉，剪去左側胸部皮毛，絡合碘消毒。從左前腋水平向上2-2.5cm（3-4肋間），可以觸摸到心臟的跳動，此處為進針點?？焖龠M針后針頭向內胸骨方向與水平面呈45°角刺人，當針頭深約3.5cm（9號針頭）時抽血。抽取血液3mL注入到10%EDTA-Na 230uL及4x10⁵U/mL抑肽酶40uL試管中，手動搖勻，放人3000r/min、4℃恒溫離心機離心10min。分離血清，ELISA檢測IL-6、IL-10水平。

1.7.2 組織標本檢測 將兔麻醉、固定，心臟采血后，空氣栓塞處死。剖開胸腔，剪取從心臟發(fā)出段的主動脈弓3cm置于4%多聚甲醛固定液固定，以各級乙醇將標本脫水后用二甲苯透明處理，經(jīng)石蠟包埋、切片后進行蘇木精-伊紅染色，光鏡下（x200倍）觀察主動脈病理形態(tài)變化。

1.8統(tǒng)計學處理

將實驗結果所得所有數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計，用SPSS18.0windows軟件操作處理。各檢測指標都用“x±s”來表示，各組之間進行兩兩對比，如果方差齊時用LSD法，方差不齊時則用Dunnet′s T3法分析。不滿足正態(tài)分布時則用秩和檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1 各組兔主動脈形態(tài)學比較

正常組顯示無顯著異常：模型組中整體模糊凌亂，各層分布不均，管腔壁內膜可見明顯增厚，內膜不光滑不完整，內皮壞死，有明顯的泡沫細胞浸潤及脂質斑塊沉積，表明造模成功：無促透劑組示內膜仍有增厚，平滑肌細胞排列無序但較模型組稍好，可見少量泡沫細胞，脂質沉積較模型組明顯減少，斑塊不明顯：氮酮組中整體結構較整齊，內膜無明顯增厚，平滑肌細胞排列較無促透劑組整齊，可見極少量的泡沫細胞：冰片組整體較無促透劑組、氮酮組更加清晰整齊，無顯著異常。見圖1。

2.2 各組兔血清IL-6、IL-10含量比較

與正常組比，模型組IL-6水平顯著升高（P<0.01）、IL-10水平顯著降低（P<0.01）;與模型組比，無促透劑組、氮酮組及冰片組IL-6水平顯著降低（P<0.01）、IL-10水平升高（P<0.05）;與無促透劑組比，氮酮組和冰片組IL-6水平顯著降低（P<0.01）、IL-10差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;與氮酮組比，冰片組IL-6水平顯著降低（P<0.01）、IL-10差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），如表1所示。

3討論

HLP是西醫(yī)學病名，傳統(tǒng)中醫(yī)無對應病名，但中醫(yī)學中有“膏”“脂”的論述。《靈樞》曰：“五谷之津液合而為膏者……。”張景岳《類經(jīng)》有云：“膏，脂膏也?！蔽麽t(yī)認為，血脂升高，會導致血液粘稠度升高、血液流速減慢，長期高血脂可引起血管內皮損傷，從而導致脂質、血小板等沉積在血管損傷局部，發(fā)生慢性炎癥改變，形成粥樣硬化斑塊。早期癥狀與中醫(yī)痰濁極為相似，后期血管損傷、粥樣斑塊形成與中醫(yī)的“瘀血”相近，因此，中醫(yī)認為本病病機主要為痰濁瘀血阻滯。有研究指出：灸法“以溫促通”，能疏通經(jīng)絡，促進氣血運行，治療HLP療效較佳。

隔藥餅灸是一種特色灸法，結合艾燃燒的溫熱刺激、藥餅中藥物的作用及經(jīng)絡穴位三位一體共同發(fā)揮效用，是針灸療法的重要組成。有研究指出，隔藥餅灸具有明確抗炎作用。IL-6由多種細胞（如單核/巨噬細胞等）分泌，研究表明IL_6是促進AS形成的一種多功能細胞因子，且它在AS病理演變過程中大量存在，其導致AS炎癥機制可能與激活巨噬細胞，加強巨噬細胞對低密度脂蛋白的攝人，刺激基質降解酶的合成，上調黏附分子的表達有關。本研究結果表明，HLP合并AS模型兔血清IL-6顯著高于正常組，采用隔藥餅灸治療后各組血清IL-6水平均顯著低于模型組，提示隔藥餅灸可抑制IL-6表達，這可能是隔藥餅灸抗炎抗AS的機制之一。且氮酮組和冰片組IL-6水平下降幅度最大，說明采用兩種促透劑分別運用于藥餅后施灸對抑制IL-6表達具有增效作用。IL-10主要由CD4+淋巴細胞和巨細胞產(chǎn)生，具有強大抗炎作用。Potteaux等研究表明，AS小鼠IL-10升高能顯著減少AS損傷區(qū)域面積。Galigiuri等發(fā)現(xiàn)敲除大鼠apoE基因，IL-10減少，AS斑塊面積顯著增加，表明升高IL-10具有抗AS作用。本研究結果顯示，無促透劑組、氮酮組、冰片組IL-IO水平明顯高于模型組，這說明隔藥餅灸通過升高IL-10水平抗炎的作用極其優(yōu)越。但本次實驗發(fā)現(xiàn)，與無促透劑相比，氮酮組和冰片組IL-10水平雖然有升高趨勢，但是差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），表明本次實驗中，在藥餅中加入促透劑氮酮或冰片后施灸，對HLP合并AS兔血清IL-IO的上調表達無顯著增效作用，也可能存在影響IL-10表達的其他因素，有待進一步研究探索。

隔藥餅灸作用的發(fā)揮離不開藥餅中的中藥作用。本次實驗藥餅中大黃、山楂、澤瀉、郁金、丹參五味中藥在實驗及臨床研究中多次證實其有效成分具有明確的降脂作用。有研究表明氮酮和冰片對多種親水或親脂性藥物成分具有促進其透皮吸收的效果。本研究結果顯示，在藥餅中加入促透劑氮酮或冰片對血清IL-6水平及主動脈組織病理形態(tài)的調節(jié)作用更顯著，表明隔藥餅灸作用的發(fā)揮可能與藥餅中有效成分的透皮吸收相關，且冰片組IL-6水平顯著低于氮酮組，說明冰片略優(yōu)于氮酮。

綜上，隔藥餅灸可抑制HLP合并AS兔炎癥反應，這可能是隔藥餅灸抗AS的作用機制之一。同時，隔藥餅灸能促進AS兔主動脈組織損傷修復，在藥餅中加入促透劑后施灸療效更佳，可能與藥餅中藥物透皮吸收增強有關，值得進一步臨床應用和研究。