基于聚類分析和主成分分析的壯瑤藥三妹木HPLC指紋圖譜研究

傅靜 張瑩 李宇輝 王孝勛

中圖分類號(hào) R284 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2019）17-2355-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.17.10

摘 要 目的：建立壯瑤藥三妹木的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，為不同產(chǎn)地三妹木的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供依據(jù)。方法：以廣西南寧、桂林、梧州等5不同產(chǎn)地的10批三妹木為樣品，采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”（2012版）軟件建立HPLC指紋圖譜并進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)[色譜柱為Inertsil ODS-3，流動(dòng)相為乙腈-0.2%磷酸溶液（梯度洗脫），流速為0.8 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為350 nm，柱溫為35 ℃，進(jìn)樣量為10 μL]，通過對(duì)照品比對(duì)對(duì)共有峰進(jìn)行指認(rèn)。采用IBM SPSS 21.0軟件對(duì)其進(jìn)行聚類分析和主成分分析。結(jié)果：建立了HPLC指紋圖譜，共確定了12個(gè)共有峰，并指認(rèn)了其中3個(gè)共有峰（8、10、11號(hào)共有峰分別為夏佛塔苷、牡荊素和異牡荊素）;10批樣品的相似度均大于0.9。經(jīng)聚類分析發(fā)現(xiàn)，10批藥材可聚為二大類;經(jīng)主成分分析發(fā)現(xiàn)，2個(gè)主成分因子的累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為86.108%（第一主成分、第二主成分的貢獻(xiàn)率分別為66.891%、19.217%）。結(jié)論：成功建立了三妹木藥材的HPLC指紋圖譜，該方法簡(jiǎn)單、易行，為三妹木的質(zhì)量控制提供了可靠的評(píng)價(jià)方法。

關(guān)鍵詞 壯瑤藥;三妹木;高效液相色譜法;化學(xué)計(jì)量學(xué);指紋圖譜

Study on HPLC Fingerprints of Zhuang and Yao Medicine Lespedeza formosa Based on Cluster Analysis and Principal Component Analysis

FU Jing，ZHANG Ying，LI Yuhui，WANG Xiaoxun（School of Pharmacy， Guangxi University of TCM， Nanning 530200， China）

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To establish HPLC fingerprint of Zhuang and Yao medicine Lespedeza formosa， and to provide reference for quality control of L. formosa from different producing areas. METHODS： Totally 10 batches of samples were collected from 5 producing areas as Guangxi Nanning， Guilin， Wuzhou and so on. HPLC fingerprints was established and similarity analysis was carried out by using “Similarity evaluation system of TCM chromatographic fingerprint” （2012 edition） software. The determination was performed on Inertsil ODS-3 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.2% phosphoric acid solution （gradient elution） at the flow rate of 0.8 mL/min. The detection wavelength was set at 350 nm， and the column temperature was 35 ℃. The sample size was 10 μL. Common peaks were identified by comparing substance control. Cluster analysis and principal compoent analysis were performed by using IBM SPSS 21.0 statistical software. RESULTS： HPLC fingerprint was established， and 12 common peaks were calibrated. 3 common peaks were identified （common peak 8， 10， 11 were chafotalin， vitexin and isovitexin）. The similarity of 10 batches of samples were all higher than 0.9. Through cluster analysis， 10 batches of medicinal materials could be clutered into 2 groups. According to the principal component analysis， the cumulative variance contribution rate of the two principal component factors was 86.108% （contribution rates of first principal components and second principal components were 66.891% and 19.217%）. CONCLUSIONS： HPLC fingerprint of L. formosa is established successfully. The method is simple and easy to use， provides a reliable evalution method for quality control of L. formosa.

KEYWORDS ? Zhuang and Yao medicine; Lespedeza formosa; HPLC; Chemometrics; Fingerprint

三妹木來(lái)源于豆科植物美麗胡枝子[Lespedeza formosa （Vog.） Koehne.]的干燥莖葉，亦稱謀見亮、把天門、夜關(guān)門，為廣西壯族和瑤族地區(qū)民間常用中草藥[1-2]。其味苦，性平，具有清熱、利尿通淋之功，主治熱淋、小便不利[3]。壯醫(yī)認(rèn)為三妹木具有調(diào)氣道、利水道、清熱毒、除濕毒、消腫痛的功效，主治肺癰、風(fēng)濕骨痛、跌打損傷[4]。目前，關(guān)于三妹木的研究主要是在總黃酮的含量測(cè)定、體細(xì)胞染色體核型分析、種子萌發(fā)、幼苗生長(zhǎng)規(guī)律等[5-8]方面，對(duì)其質(zhì)量評(píng)價(jià)方面研究甚少。中藥指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)的研究和建立是中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)的重要發(fā)展趨勢(shì)之一，已成為中藥鑒定的一個(gè)重要平臺(tái)。且中藥指紋圖譜的構(gòu)建方法及解析方法多種多樣，能全面反映中藥的整體化學(xué)特征，體現(xiàn)其內(nèi)在的整體質(zhì)量，是一種較為合理的中藥質(zhì)量控制模式[9]。為促進(jìn)廣西本土藥材資源的合理開發(fā)利用，本研究采用高效液相色譜（HPLC）法結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)對(duì)廣西5個(gè)不同產(chǎn)地10批三妹木進(jìn)行指紋圖譜研究，旨在為其質(zhì)量評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

e2695型HPLC儀（包括四元泵洗脫系統(tǒng)、在線真空脫氣機(jī)、標(biāo)準(zhǔn)自動(dòng)進(jìn)樣器、智能化柱溫箱和光電二極管陣列檢測(cè)器）購(gòu)自美國(guó)Waters公司;TGL-16B型高速臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）;BP211D型電子分析天平（德國(guó)賽多利斯公司）;HWS-28型電熱恒溫水浴鍋（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）;DHG-9240A型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）;As7240BT型超聲波清洗器（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）;DP5系列超純水儀（法國(guó)密里博公司）。

1.2 藥品與試劑

共采集三妹木藥材10批，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)韋松基教授鑒定均為豆科胡枝子屬植物美麗胡枝子L. formosa（Vog.）Koehne.的莖葉;夏佛塔苷對(duì)照品（上海詩(shī)丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司，批號(hào)：5861，純度：99.4%）;牡荊素對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111687- 201704，純度：94.9%）;異牡荊素對(duì)照品（云南西力生物技術(shù)股份有限公司，批號(hào)：BBP00949，純度：97%）;甲醇、乙腈為色譜純（美國(guó)Fisher公司）;其他試劑均為分析純，水為超純水。三妹木藥材基源信息見表1。

表1 三妹木藥材基源信息

Tab 1 Material source information of L. formosa

[藥材批次＼&采收時(shí)間＼&藥材產(chǎn)地＼& ? ? ?經(jīng)緯度＼&S1＼&2018-04-10＼&廣西南寧市邕寧區(qū)＼&N22.0° E108.0°＼&S2＼&2018-06-05＼&廣西來(lái)賓市金秀縣＼&N23.0° E110.0°＼&S3＼&2018-07-07＼&廣西梧州市藤縣＼&N24.0° E110.6°＼&S4＼&;2018-07-08＼&廣西來(lái)賓市象州縣＼&N23.6° E110.1°＼&S5＼&2018-07-11＼&廣西桂林市臨桂縣＼&N24.0° E110.2°＼&S6＼&2018-09-03＼&廣西柳州市三江縣＼&N25.0° E109.0°＼&S7＼&2018-09-15＼&廣西來(lái)賓市金秀縣＼&N23.9° E110.2°＼&S8＼&2018-10-20＼&廣西南寧市邕寧區(qū)＼&N22.0° E108.0°＼&S9＼&2018-11-03＼&廣西柳州市三江縣＼&N25.0° E109.0°＼&S10＼&2018-12-05＼&廣西來(lái)賓市金秀縣＼&N24.0° E110.2°＼&]

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 混合對(duì)照品溶液的制備 分別稱取夏佛塔苷對(duì)照品1.82 mg、牡荊素對(duì)照品1.34 mg、異牡荊素對(duì)照品1.54 mg，用75%乙醇溶解并定容至同一10 mL量瓶中，搖勻，制成含0.182 mg/mL夏佛塔苷、0.134 mg/mL牡荊素和0.154 mg/mL異牡荊素的混合對(duì)照品溶液，備用。

2.1.2 供試品溶液的制備 稱取批次為S2的藥材粉末2 g，精密稱定，置于50 mL量瓶中，加入75%乙醇20 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率：500 W，頻率：35 kHz）提取30 min，冷卻至室溫，再次稱定質(zhì)量，然后用75%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過，續(xù)濾液以13 000 r/min離心10 min，備用。

2.2 色譜條件

色譜柱：Inertsil ODS-3（250 mm×4.6 mm，5 μm）;檢測(cè)器：光電二極管陣列檢測(cè)器;流動(dòng)相：乙腈（A）-0.2%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～20 min，10%→17%A;20～30 min，17%A;30～45 min，17%→21%A;45～55 min，21%→23%A;55～70 min，23%→50%A）;流速：0.8 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)：350 nm;柱溫：35 ℃;進(jìn)樣量：10 μL。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 稱取三妹木藥材粉末（批次為S2）2 g，精密稱定，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜。以夏佛塔苷峰（8號(hào)峰）為參照峰，考察各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果表明，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD在0.03%～0.19%之間（n=6），相對(duì)峰面積的RSD在0.03%～0.30%之間（n=6），表明檢測(cè)儀器精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn) 分別稱取同一批三妹木藥材粉末（批次為S2）2 g，精密稱定，按“2.1.2”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6份，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，記錄色譜。以夏佛塔苷峰（8號(hào)峰）為參照峰，分別考察各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果表明，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD在0.12%～1.18%之間（n=6），相對(duì)峰面積的RSD在0.10%～1.27%之間（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 稱取三妹木藥材粉末（批號(hào)為S2）2 g，精密稱定，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于制備0、4、8、10、12、24 h后按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，記錄色譜。以夏佛塔苷峰（8號(hào)峰）為參照峰，分別考察各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果表明，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD在0.07%～2.13%之間（n=6），相對(duì)峰面積的RSD在0.11%～2.44%之間（n=6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4 HPLC指紋圖譜的生成與相似度評(píng)價(jià)、共有峰的相關(guān)分析

2.4.1 HPLC指紋圖譜的生成 稱取10批三妹木藥材粉末，分別按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，以“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，記錄色譜。將色譜圖導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”（2012版）軟件中，以S9號(hào)色譜圖為參照?qǐng)D譜，將時(shí)間窗寬度設(shè)為0.2，采用多點(diǎn)校正法進(jìn)行色譜峰匹配，選擇中位數(shù)法生成對(duì)照?qǐng)D譜R[10-12]。對(duì)照指紋圖譜R見圖1，10批藥材樣品HPLC疊加指紋圖譜見圖2。

2.4.2 相似度分析 采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）”軟件，以藥材樣品HPLC對(duì)照?qǐng)D譜R為參照，進(jìn)行整體相似度評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，10批藥材樣品相似度在0.901～0.995之間，表明不同批次藥材樣品間差異較小。相似度評(píng)價(jià)結(jié)果見表2。

2.4.3 共有峰的指認(rèn)及相關(guān)分析 確定共有峰12個(gè)，通過與對(duì)照品溶液色譜峰比對(duì)（取“2.1.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖），確認(rèn)8、10、11號(hào)共有峰分別為夏佛塔苷、牡荊素和異牡荊素。其中8號(hào)峰峰面積較大，分離度及對(duì)稱因子均符合要求，且為所有藥材樣品共有，故設(shè)定其為參照峰（S），計(jì)算其他共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積?；旌蠈?duì)照品溶液的色譜圖見圖3，10批藥材樣品相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積的測(cè)定結(jié)果分別見表3、表4。

2.5 化學(xué)計(jì)量學(xué)分析

2.5.1 聚類分析 以12個(gè)共有峰的峰面積為原始數(shù)據(jù)，運(yùn)用IBM SPSS 21.0 軟件對(duì)10批三妹木藥材進(jìn)行聚類分析，采用組間平均數(shù)聯(lián)結(jié)法，以Euclidean平方距離為度量標(biāo)準(zhǔn)[12-14] 。結(jié)果顯示，10批三妹木藥材樣品可聚為二大類：批次為S2、S3、S4、S5、S7、S10的聚為一類，批次為S1、S6、S8、S9的聚為另一類。三妹木樣品聚類分析樹狀圖見圖4。

2.5.2 主成分分析 用IBM SPSS 21.0 軟件對(duì)10批次廣西不同產(chǎn)地三妹木藥材的12個(gè)變量（共有峰峰面積）進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，以主成分的方差貢獻(xiàn)率及特征值為依據(jù)，進(jìn)行主成分分析，計(jì)算相關(guān)系數(shù)矩陣、主成分特征值、方差貢獻(xiàn)率以及主成分綜合得分，對(duì)各產(chǎn)地的三妹木藥材進(jìn)行評(píng)價(jià)[15]。

根據(jù)各因子特征值大于1及因子的方差累計(jì)貢獻(xiàn)率大于85%的原則作為主成分提取的標(biāo)準(zhǔn)，本研究需提取的主成分主要有2個(gè)：第一主成分的特征值為8.198，其貢獻(xiàn)率為66.891%;第二主成分的特征值為2.135，其貢獻(xiàn)率為19.217%。這2個(gè)主成分的累計(jì)方差總貢獻(xiàn)率為86.108%。以主成分因子為變量繪制公因子碎石圖，可以看出特征值較高的2個(gè)主成分的斜率更大，說(shuō)明前2個(gè)主成分可以最大程度地反映三妹木藥材的品質(zhì)關(guān)系，可見提取前2個(gè)主成分進(jìn)行分析較為適宜。公因子碎石圖見圖5。

為了使提取的主成分更加全面、清晰地反映原始數(shù)據(jù)包含的信息，將因子分析得到的成分矩陣進(jìn)行正交旋轉(zhuǎn)，得到12個(gè)指標(biāo)在2個(gè)主成分中的旋轉(zhuǎn)矩陣。結(jié)果顯示，第一主成分的信息主要來(lái)自于色譜峰2、3、4、6、8（夏佛塔苷），此類峰的峰面積較大，表示成分含量較高，對(duì)三妹木品質(zhì)有明顯的影響;第二主成分的信息主要來(lái)自于色譜峰10（牡荊素）、11（異牡荊素）。初始因子荷載矩陣見表5。

10批次三妹木樣品有規(guī)律地分布為二大類，即批次為S2、S3、S4、S5、S7、S10的聚為一類，批次為S1、S6、S8、S9的聚為另一類，該結(jié)果與聚類分析結(jié)果一致。 主成分得分圖見圖6。

2.5.3 基于主成分分析建立廣西產(chǎn)三妹木質(zhì)量評(píng)價(jià)綜合模型 根據(jù)表5結(jié)果，以X1、X2代表2個(gè)主成分來(lái)作為10批三妹木樣品成分所表達(dá)的信息，以其共有峰峰面積為變量，建立其品質(zhì)評(píng)價(jià)模型。得到第一主成分的線性關(guān)系表達(dá)式為：X1=0.834共有峰1+0.925共有峰2+ 0.917共有峰3+0.911共有峰4+0.887共有峰5+0.942共有峰6+0.888共有峰7+0.961共有峰8+0.881共有峰9 ?-0.018共有峰10-0.109共有峰11+0.795共有峰12;第二主成分的線性關(guān)系表達(dá)式為：X2=-0.38共有峰1-0.28共有峰2+0.186共有峰3+0.07共有峰4-0.318共有峰5-0.222共有峰6+0.072共有峰7-0.27共有峰8-0.145共有峰9+0.957共有峰10+0.868共有峰11+0.344共有峰12（注：表達(dá)式中各變量非原始峰面積，而是標(biāo)準(zhǔn)化處理后峰面積）。將上述表達(dá)式與所對(duì)應(yīng)的的2個(gè)主成分的方差貢獻(xiàn)率作內(nèi)積后，得到三妹木質(zhì)量綜合評(píng)價(jià)函數(shù)X（綜合得分）的表達(dá)式為：X（綜合得分）=（68.313X1+19.217X2）/86.108，綜合得分越高表示藥材樣品的整體質(zhì)量越好[16]。結(jié)果顯示，批次為S2、S3、S4、 S5、S7的樣品的綜合得分均>0，且以S2樣品綜合得分最高。不同產(chǎn)地三妹木藥材的主成分得分、綜合得分及排名情況見表6。

3 討論

在前期研究中，筆者對(duì)樣品的提取方法（超聲、加熱回流和冷浸法）、提取溶劑（不同體積分?jǐn)?shù)的甲醇、乙醇和水）等進(jìn)行了考察，最終采用75%乙醇超聲提取作為樣品前處理方法。另外，筆者還對(duì)不同流動(dòng)相體系（甲醇-水、甲醇-0.2%磷酸、乙腈-水、乙腈-0.2%磷酸）以及不同檢驗(yàn)波長(zhǎng)（260、300、350、380 nm）等HPLC色譜條件進(jìn)行了優(yōu)選。最終確定采用Inertsil ODS-3（250 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱，以乙腈-0.2%磷酸溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為350 nm。在該色譜條件下，HPLC特征指紋圖譜基線平穩(wěn)，色譜峰較多且分離度較好。

通過“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”（2012版）軟件進(jìn)行相似度分析，發(fā)現(xiàn)10批三妹木藥材樣品相似度均>0.9，表明藥材樣品質(zhì)量穩(wěn)定，差異較小。在12個(gè)共有峰中，通過與混合對(duì)照品溶液HPLC色譜圖比對(duì)，指認(rèn)出了夏佛塔苷、牡荊素和異牡荊素峰。各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD差異較小，但相對(duì)峰面積的RSD差異較大，說(shuō)明不同產(chǎn)地三妹木藥材中的成分類型一致，但含量有較大差異。這可能與三妹木藥材的生長(zhǎng)環(huán)境、采收季節(jié)等因素有關(guān)。

利用化學(xué)模式識(shí)別法中的聚類分析與主成分分析相結(jié)合，對(duì)不同產(chǎn)地的三妹木樣品進(jìn)行聚類鑒別和判別分析。聚類分析是在“相似度”的基礎(chǔ)上對(duì)樣品進(jìn)行歸類，反映樣品之間的穩(wěn)定性。主成分分析則是對(duì)樣品信息的濃縮，利用方差最大原則，對(duì)降維后的多變量重新組合成幾個(gè)新的主分量，并盡可能多地保留原始變量的信息，通過得分圖對(duì)樣品進(jìn)行分類。在聚類分析中，將10批三妹木藥材樣品聚為二大類，其中批次為S2、S3、S4、S5、S7、S10的聚為一類，編號(hào)為S1、S6、S8、S9的聚為另一類，與主成分得分結(jié)果一致。第一主成分的信息主要來(lái)自于色譜峰2、3、4、6、8（夏佛塔苷）;第二主成分的信息主要來(lái)自于色譜峰9（牡荊素）、10（異牡荊素）。綜合得分大于0的藥材的產(chǎn)地有來(lái)賓市金秀瑤族自治縣、梧州市藤縣、來(lái)賓市象州縣和桂林市臨桂縣，批次為S2、S4、S7、S10的樣品均采自來(lái)賓市金秀瑤族自治縣，但批次為S2的樣品綜合得分最高（得分越高質(zhì)量越好），這說(shuō)明藥材質(zhì)量不僅與產(chǎn)地有關(guān)，還受采收時(shí)間、溫度、土壤、降雨量及不同植株年份累積的影響。

在本研究中，建立的方法可對(duì)三妹木藥材進(jìn)行整體性的評(píng)價(jià)，可為其質(zhì)量控制提供一定的理論依據(jù)。由于中藥材質(zhì)量受多方面因素的影響，不同產(chǎn)地間的質(zhì)量存在較大差異，利用主成分分析能篩選出共有的特征成分，并指導(dǎo)發(fā)現(xiàn)主要成分，但中藥化學(xué)成分復(fù)雜，其他可作為質(zhì)量評(píng)價(jià)的成分還未知，故下一步筆者將通過液質(zhì)聯(lián)用等分析技術(shù)，確定其他未知共有峰所代表的化合物，對(duì)三妹木藥材進(jìn)行進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2019-04-04 修回日期：2019-07-01）

（編輯：林 靜）