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    重樓莖葉總黃酮的提取純化工藝及抗氧化活性研究

    2019-09-04 03:49:58王飛飛
    安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) 2019年9期
    關(guān)鍵詞:抗氧化活性總黃酮提取工藝

    王飛飛

    摘要 [目的]優(yōu)選重樓莖葉總黃酮的提取工藝,并測(cè)定其體外抗氧化活性。[方法]通過正交試驗(yàn)確定最優(yōu)提取工藝并制備重樓莖葉總黃酮,對(duì)其DPPH清除率、羥基自由基清除率、超氧陰離子清除率進(jìn)行評(píng)價(jià)。[結(jié)果]最優(yōu)提取條件為60%乙醇提取,提取時(shí)間3.5 h,料液比為1∶20(g∶mL),制得粗提液中總黃酮含量為0.44%;按此方案進(jìn)行放大提取,然后對(duì)粗提液濃縮進(jìn)行D101大孔樹脂富集純化,富集得到的總黃酮含量提高到16.69%,總得率為5.28%;富集所得總黃酮DPPH清除率IC50為0.120 mg/mL,羥基自由基清除率IC50為0.190 mg/mL,超氧陰離子清除率IC50為0.120 mg/mL。[結(jié)論]正交試驗(yàn)優(yōu)選的提取方法穩(wěn)定可靠,通過大孔樹脂富集得到的總黃酮具有一定的抗氧化活性。

    關(guān)鍵詞 重樓莖葉;總黃酮;提取工藝;優(yōu)化;正交試驗(yàn);抗氧化活性

    中圖分類號(hào) R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

    文章編號(hào) 0517-6611(2019)09-0164-04

    doi:10.3969/j.issn.0517-6611.2019.09.047

    Abstract [Objective] The research aimed to optimize the extraction process of total flavonoids (TF) from stem and leaves of Paris polyphylla,and to study the antioxidant activities of the TF in vitro. [Method] The content of TF was chosen as the experimental index, orthogonal design was used to optimize the extraction condition of TF, and then 1,1diphenyl2picrylhydrazyl (DPPH) clearance rate, hydroxyl radical (·OH) scavenging rate and superoxide anion (O2·-) clearance rate were evaluated. [Result]The optimum extraction conditions: ethanol concentration was 60%, extraction time was 3.5 h and materialsolvent ratio 1∶20 (g∶mL). The content of TF was 0.44%, which increased to 16.69% and the yield was 5.28% after D101 resin purification. IC50 of DPPH, ·OH and O2·- scavenging rate were 0.120 mg/mL, 0.190 mg/mL and 0.120 mg/mL, respectively. [Conclusion] The optimum extraction process is stable, reliable and TF of aerial part of Paris polyphylla have antioxidant activities.

    Key words Stem and leaves of Paris polyphylla;Total flavonoids;Extraction process;Optimization;Orthogonal experiment;Antioxidant activities

    重樓(Paris polyphylla Smith var.yunnanensis(Franch.)Hand.-Mazz.)是百合科植物云南重樓的干燥根莖。重樓作為云南白藥、抗病毒顆粒等中成藥的主要原料來源,市場(chǎng)需求逐年增加,而其根的生長(zhǎng)一般需要5~15年,造成資源短缺,對(duì)地上部位的莖葉研究和利用都較少,通常莖葉都直接廢棄掉,造成了很大的浪費(fèi)[1-3]。重樓莖葉中富含甾體皂苷[4]、黃酮[5]、多糖[6]等化學(xué)成分,藥理研究證實(shí),重樓莖葉提取物具有一定的抗肝癌、抗白血病、殺菌、止血、抗氧化等生物活性[7]。黃酮類化合物具有廣泛的生物活性[8-10],最為主要的活性是抗氧化活性[11],主要表現(xiàn)在對(duì)自由基的清除和減少自由基的生成[12]。為了減少自由基的危害,尋找廉價(jià)、高效的自由基清除劑越來越受到關(guān)注[13]。筆者首先利用正交試驗(yàn)對(duì)重樓莖葉總黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)選,然后用大孔樹脂對(duì)重樓莖葉的總黃酮進(jìn)行富集,最后對(duì)其體外的抗氧化活性進(jìn)行測(cè)定,以期從廢棄的莖葉中獲得具有較好抗氧化活性的黃酮類物質(zhì),為其應(yīng)用提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 儀器

    旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士BUCHI,R-100);分析天平(上海海康電子儀器,EA-2004);磁力加熱攪拌器(上海司樂儀器,85-2型號(hào));紫外-可見分光光度儀(美國Agilent,Cary-60);布氏漏斗。

    1.2 試材

    重樓藥材莖葉,產(chǎn)地為云南昆明,經(jīng)昆明植物研究所劉海洋研究員鑒定為百合科植物滇重樓的地上部位;D101大孔樹脂(滄州寶恩吸附材料公司);蘆丁(純度98.7%,批號(hào)Q2700050,上海安譜科學(xué)儀器有限公司);DPPH、無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁及氫氧化鈉均購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司;羥基自由基清除率試劑盒、超氧陰離子清除率試劑盒采購于南京建成科技有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1

    總黃酮含量測(cè)定及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。參照文獻(xiàn)[14],用硝酸鋁比色法對(duì)蘆丁在500 nm下進(jìn)行測(cè)定,得蘆丁溶液在各濃度時(shí)的吸光度,以蘆丁溶液濃度(y)對(duì)吸光度(x)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    1.3.2 重樓莖葉總黃酮提取的單因素試驗(yàn)。

    1.3.2.1

    提取料液比對(duì)總黃酮提取量的影響。取重樓莖葉粗粉5 g,按料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶40(g∶mL)分別加入60%乙醇,加熱回流提取2次,每次2.5 h,靜置至室溫后用0.22 μm濾膜過濾,各取1 mL,用硝酸鋁比色法在500 nm下測(cè)定吸光度,代入回歸方程計(jì)算其總黃酮的含量,所得含量乘以提取液體積,即得總黃酮的提取量。

    1.3.2.2 乙醇濃度對(duì)總黃酮提取量的影響。取重樓莖葉粗粉5 g,加入濃度為40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液50 mL,加熱回流提取2次,每次2.5 h,靜置至室溫后用0.22 μm濾膜過濾,各取1 mL,按“1.3.2.1”方法計(jì)算總黃酮的提取量。

    1.3.2.3

    提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取量的影響。 取重樓莖葉粗粉5 g,加入60%的乙醇溶液50 mL,加熱回流提取2次,提取時(shí)間分別為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0 h,提取完畢靜置至室溫后用0.22 μm濾膜過濾,各取1 mL,按“1.3.2.1”方法計(jì)算總黃酮的提取量。

    1.3.3 重樓莖葉總黃酮提取的正交試驗(yàn)。

    1.3.3.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。影響重樓莖葉總黃酮提取效果的因素很多,根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,選取3因素3水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。各因素的水平設(shè)計(jì)如表1所示。

    取重樓莖葉粗粉,按照表1所述正交試驗(yàn)方案進(jìn)行試驗(yàn)。各提取液靜置后用0.22 μm濾膜過濾,分別取1 mL,按“1.3.2.1”方法計(jì)算總黃酮的提取量,將其作為評(píng)價(jià)指標(biāo)對(duì)各試驗(yàn)進(jìn)行對(duì)比。

    1.3.3.2 驗(yàn)證試驗(yàn)。 稱取3份重樓莖葉粗粉各5 g,用60%乙醇100 mL回流提取2次,每次3.5 h。將各提取液靜置至室溫后,用0.22 μm濾膜過濾,各取1 mL濾液,按“1.3.2.1”方法計(jì)算總黃酮的提取量。

    1.3.4

    重樓莖葉總黃酮對(duì)DPPH的清除作用。精密稱取1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)10.5 mg,用無水乙醇溶解后定容至100 mL備用;精密稱取重樓莖葉總黃酮28.1 mg,用40%乙醇溶液將其定容至50 mL,得0.56 mg/mL的總黃酮溶液,將其用40%乙醇稀釋成不同濃度(0~0.56 mg/mL)的溶液,分別取各濃度的重樓莖葉總黃酮溶液2 mL加入試管中,加入DPPH溶液2 mL,混勻后,室溫下反應(yīng)30 min,在517 nm下測(cè)定吸光度;空白組為4 mL的40%乙醇溶液,吸光度記為A0;樣品組吸光度記為A1,對(duì)照組吸光度記為A2,DPPH清除率=1-(A1-A0)/(A2-A0);用維生素C作為對(duì)照,同法進(jìn)行測(cè)定。

    1.3.5

    重樓莖葉總黃酮對(duì)羥基自由基的清除作用。精密稱取重樓莖葉總黃酮100.5 mg,用40%乙醇溶液定容至25 mL,得4.02 mg/mL的溶液,然后將其用40%乙醇溶液稀釋成不同濃度(0~4.02 mg/mL)的溶液;精密稱取維生素C 20.6 mg,用雙蒸水定容至20 mL,得1.03 mg/mL的維生素C溶液,將其用雙蒸水稀釋成不同濃度(0~1.03 mg/mL)的溶液作為對(duì)照。將所配制的各樣品和對(duì)照品嚴(yán)格按照試劑盒操作說明,對(duì)它們的羥基自由基清除作用進(jìn)行測(cè)定,羥基自由基清除率=(1-A1/A0)×100%,其中,A1為加入樣品后的反應(yīng)液吸光度,A0為未加樣品的反應(yīng)液吸光度。

    1.3.6

    重樓莖葉總黃酮對(duì)超氧陰離子的清除作用。精密稱取重樓莖葉總黃酮107.5 mg,用40%乙醇溶液定容至25 mL,得4.3 mg/mL的溶液,然后將其用40%乙醇溶液稀釋成不同濃度(0~4.3 mg/mL)的溶液;精密稱取維生素C 10.2 mg,用雙蒸水定容至20 mL,得0.51 mg/mL的維生素C溶液,將其用雙蒸水稀釋成不同濃度(0~0.51 mg/mL)的溶液作為對(duì)照。將所配制的各樣品和對(duì)照品嚴(yán)格按照試劑盒操作說明,對(duì)它們的超氧陰離子清除作用進(jìn)行測(cè)定,超氧陰離子清除率=(1-A1/A0)×100%,其中,A1為加入樣品后的反應(yīng)液吸光度,A0為未加樣品的反應(yīng)液吸光度。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 總黃酮含量測(cè)定及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

    以蘆丁溶液濃度(y)對(duì)吸光度(x)做標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到線性回歸方程y=0.321 1x-0.001 4(R2=0.999 4)。

    2.2 重樓莖葉總黃酮提取的單因素試驗(yàn)

    2.2.1

    提取料液比對(duì)總黃酮提取量的影響。由圖1可知,隨著提取溶劑的增加,總黃酮提取量逐漸增長(zhǎng),當(dāng)提取料液比為1∶20時(shí),總黃酮提取量最大,再增加提取溶劑時(shí),總黃酮提取量趨于平穩(wěn),不再增加。

    2.2.2

    乙醇濃度對(duì)總黃酮提取量的影響。由圖2可知,用60%~70%乙醇進(jìn)行提取時(shí),總黃酮提取量較大,過高濃度或過低濃度的乙醇提取時(shí),提取量均會(huì)降低,這與黃酮類化合物在不同濃度乙醇中的溶解度有關(guān),60%~70%的乙醇更利于黃酮類化合物的溶解。

    2.2.3 提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取量的影響。由圖3可知,在1.0~2.5 h隨著時(shí)間的增加,總黃酮提取量也逐漸增加,時(shí)間再延長(zhǎng)時(shí)總黃酮提取量反而有下降的趨勢(shì),推測(cè)可能是長(zhǎng)時(shí)間的加熱會(huì)導(dǎo)致部分總黃酮降解所致。

    2.3 重樓莖葉總黃酮提取的正交試驗(yàn)

    2.3.1 正交試驗(yàn)結(jié)果分析。由表2可知,各因素對(duì)總黃酮提取量的影響從大到小依次為B、C、A,即乙醇濃度對(duì)總黃酮提取量影響最大,提取料液比和提取時(shí)間的影響較小,其中乙醇濃度對(duì)總黃酮提取量有顯著的影響;根據(jù)各試驗(yàn)的結(jié)果,確定最佳工藝為A2B2C3,即在提取料液比為1∶20時(shí),用60%乙醇提取3.5 h可以得到最大的總黃酮提取量,此時(shí)5 g重樓莖葉粗粉中可以得到含有22.05 mg總黃酮的提取物。

    2.3.2 正交試驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證。經(jīng)過驗(yàn)證,3組試驗(yàn)提取的總黃酮含量分別為22.50、23.10、22.71 mg,RSD為1.34%,結(jié)果表明該提取條件穩(wěn)定可靠。

    2.3.3 重樓莖葉總黃酮的富集。取重樓莖葉總黃酮100 g,按“2.3.1”優(yōu)選的提取方案進(jìn)行提取,提取液減壓除去乙醇后,用D101大孔樹脂進(jìn)行總黃酮富集,得到總黃酮5.28 g,得率為5.28%;對(duì)其總黃酮含量按照“1.3.2.1”方法進(jìn)行計(jì)算,其總黃酮含量為16.69%。

    2.4 重樓莖葉總黃酮對(duì)DPPH的清除作用

    從圖4可以看出,重樓莖葉總黃酮與維生素C一樣,對(duì)DPPH自由基的清除作用呈現(xiàn)出較好的量效關(guān)系,隨著濃度的增加,清除作用逐漸增強(qiáng)。維生素C對(duì)DPPH自由基清除的IC50為0.009 mg/mL,最大清除率為96.94%;重樓莖葉總黃酮對(duì)DPPH自由基清除的IC50為0.120 mg/mL,最大清除率為86.84%。

    2.5 重樓莖葉總黃酮對(duì)羥基自由基的清除作用

    羥基自由基是活性氧自由基(ROS)中的一類,能夠誘導(dǎo)DNA的損傷,對(duì)其研究越來越廣泛[15]。從圖5可以看出,重樓莖葉總黃酮與維生素C一樣,對(duì)DPPH自由基的清除作用呈現(xiàn)出較好的量效關(guān)系,隨著濃度的增加,清除作用逐漸增強(qiáng)。維生素C對(duì)羥基自由基清除的IC50為0.062 mg/mL,最大清除率為99.60%;重樓莖葉總黃酮對(duì)羥基自由基清除的IC50為0.190 mg/mL,最大清除率為98.90%。

    2.6 重樓莖葉總黃酮對(duì)超氧陰離子的清除作用

    在生物體新陳代謝過程中會(huì)產(chǎn)生各種活性氧,產(chǎn)生最早的就是超氧陰離子,它是導(dǎo)致自由基連鎖反應(yīng)的初始物質(zhì),是體內(nèi)其他活性氧的主要來源[16]。從圖6可以看出,維生素C對(duì)超氧陰離子的清除作用呈良好的線性關(guān)系,隨著濃度的增加,其清除作用很快增大,在0.063 mg/mL時(shí),清除作用即達(dá)到最大;與維生素C相比,重樓莖葉總黃酮對(duì)超氧陰離子的清除作用較弱,然而其清除作用也隨著濃度的增加而增大,并且在4.300 mg/mL時(shí)能達(dá)到88.20%的清除作用,經(jīng)過計(jì)算,重樓莖葉總黃酮在0.120 mg/mL時(shí)就能清除50%的超氧陰離子。

    3 結(jié)論與討論

    該研究通過對(duì)單因素試驗(yàn)進(jìn)行考察,研究不同提取時(shí)間、提取料液比、乙醇濃度對(duì)總黃酮提取量的影響,為正交試驗(yàn)各因素水平的選擇提供參考,保證正交試驗(yàn)的科學(xué)性。通過正交試驗(yàn)得到最優(yōu)提取工藝,即在提取料液比為1∶20時(shí),用60%乙醇提取3.5 h,可制得粗提液中總黃酮含量為0.44%。D101大孔樹脂被廣泛用來富集黃酮類化合物,該研究通過D101大孔樹脂對(duì)優(yōu)選提取工藝所得到的提取物進(jìn)一步富集,得到含量為16.69%、得率為5.28%的重樓莖葉總黃酮提取物,該提取物中包含的單體黃酮類型有待進(jìn)一步的研究。

    重樓的藥用部位為其干燥根莖,地上部位的莖葉通常被廢棄掉,該研究通過對(duì)重樓莖葉的回收利用,并挖掘其藥理活性,增大該植物的藥用范圍,用DPPH自由基清除率、羥基自由基清除率和超氧陰離子清除率對(duì)該部位的體外抗氧化活性進(jìn)行評(píng)價(jià),結(jié)果顯示重樓莖葉總黃酮具有一定的抗氧化活性,這為重樓莖葉的應(yīng)用開發(fā)提供了理論依據(jù)。

    參考文獻(xiàn)

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