柞樹葉總黃酮乙醇提取工藝及抑菌活性研究

王林美 岳冬梅 孫永欣 張波 李樹英

摘要 [目的]對柞樹葉中總黃酮的乙醇提取工藝進(jìn)行了研究，同時考察柞樹葉總黃酮提取物對幾種常見食源性細(xì)菌的抑菌作用。[方法]以單因素試驗為基礎(chǔ)，通過正交試驗來探討料液比、提取溫度、浸提時間和乙醇濃度對柞樹葉中總黃酮提取效果的影響，確定最佳提取工藝條件，并采用抑菌圈法對痢疾志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、腸道沙門氏菌4種常見食源性細(xì)菌進(jìn)行體外抑菌活性測定。[結(jié)果]柞樹葉中總黃酮乙醇提取工藝為料液比1∶20（g∶mL），提取時間90 min，提取溫度60? ℃，提取劑為50%的乙醇溶液，在該條件下，提取液中的總黃酮含量達(dá)5.06%。提取物在體外對4種食源性細(xì)菌的生長均有抑制作用，抑菌活性隨著樣品濃度的增大而增加。對4 種供試菌的體外抑制作用由強(qiáng)到弱依次為痢疾志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、腸道沙門氏菌。[結(jié)論]柞樹葉總黃酮乙醇提取工藝簡單、可行，其提取物可用于天然食品防腐劑的開發(fā)。

關(guān)鍵詞 柞樹葉;總黃酮;提取工藝;正交試驗;抑菌活性

中圖分類號 R284.2文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）14-0171-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.14.051

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Abstract [Objective]The extraction process of total flavonoids from oak （Querus mongolica） leaves by the ethanol was studied.Moreover， the bacteriostatic effect of total flavonoids extract on several common foodborne bacteria was studied.[Method]Based on singlefactor method， the optimum extraction conditions of the solidliquid ratio， extraction temperature， extraction time and ethanol concentration on the extraction effect of total flavonoids were investigated by orthogonal experiment.The antibacterial activity of the four target bacteria Shigella dysenteriae， Staphylococcus aureus， Escherichia coli and Salmonella enterica was determined by inhibition zone method in vitro.[ Result]The results indicated that the optimal extraction conditions of total flavonoids with ethanol included solidliquid ratio of 1∶20 （g∶mL）， extraction duration of 90 min， extraction temperature of 60 ℃，and ethanol concentration of 50%.Under this optimized conditions，the extraction rate of total flavonoids from oak leaf reaches 5.06%.The total flavonoids extracts inhibited the growth of the four foodborne bacteria， and the antibacterial activity increased with the increase of extract concentration.The inhibitory effects of the four tested bacteria were as follows：S.dysenteriae，S.aureus，E.coli，S.enterica.[Conclusion]The method is simple and feasible in operation， and the extract can be used for the development of natural food preservative.

Key words Querus mongolica leaf;Total flavonoids;Extraction process;Orthogonal experiment;Antibacterial activity

作者簡介 王林美（1966—） ，女，遼寧大連人，副研究員，從事柞樹資源開發(fā)利用研究 通信作者，研究員。

收稿日期 2019-03-04;修回日期 2019-03-22

柞樹為殼斗科櫟屬植物的總稱，是多年生闊葉植物，主要分布在我國東北和華北地區(qū)，其中遼寧省柞樹林有182萬hm2，占林地面積的14.7%。柞樹資源廣泛，是一種野外自然生長的植物，其生長環(huán)境天然無污染，柞樹葉無毒無害，目前主要作為柞蠶食用飼料而被利用[1]。柞樹葉除了含有粗蛋白、粗脂肪、粗灰分、粗纖維、礦物質(zhì)元素、維生素等營養(yǎng)成分外，還富含黃酮類生物活性成分[2]?，F(xiàn)代藥理試驗已證實，柞樹葉具有清熱利濕、抗炎解毒[3]、保肝、降血糖[4]的作用，黃酮類化合物在發(fā)揮這些功效方面起到至關(guān)重要的作用。柞樹葉中黃酮類主要有山奈酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷、山奈酚-3-O-（6′-O-沒食子酰基）-β-D-吡喃葡萄糖苷、芹菜素-4′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、木犀草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、黑麥草素、β-谷甾醇葡萄糖苷等[5]。黃酮類的化合物具有廣泛的生理活性及較高的藥用價值，例如：抗氧化、抗抑郁、抗衰老、保護(hù)神經(jīng)、提高免疫力、抗腫瘤等功效[6-8]。因而如果能夠從柞樹葉中提取黃酮類化合物并將其應(yīng)用于藥品或者保健食品生產(chǎn)中，就可以大大提高柞樹副產(chǎn)品的經(jīng)濟(jì)價值。

目前已有很多從天然植物中提取黃酮類化合物的報道[9-11]，其中最常見的提取方法有水浸提、有機(jī)溶劑提取、超聲波和微波輔助提取以及酶解法提取等。然而，尚未有研究發(fā)現(xiàn)如何從柞樹葉中提取黃酮類化合物。因此，筆者利用乙醇作為提取劑提取柞樹葉中的黃酮類化合物，并在單因素試驗的基礎(chǔ)上，應(yīng)用正交試驗的方法確定總黃酮提取的最佳工藝條件，同時考察柞樹葉黃酮提取物對常見食源性細(xì)菌的抑制作用，旨在為開發(fā)柞樹葉天然食品保鮮劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 柞樹葉來自蒙古櫟（Quercus mongolica），于夏季采自遼寧省鳳城市，用清水清洗后25 ℃陰干，粉碎過60目篩，得柞樹葉粉，于-20? ℃冰箱中保存。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)樣品購自廣州市齊云生物技術(shù)有限公司，亞硝酸鈉、硝酸鋁、無水乙醇、氫氧化鈉等均為國產(chǎn)分析純。

供試菌株痢疾志賀氏菌（Shigella dysenteriae， CMCC51105）、大腸桿菌（Escherichia coli， ATCC25922）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus， ATCC25923）、腸道沙門氏菌（Salmonella enteric， ATCC14028），均購自中國普通微生物菌種保藏管理中心。

1.2 儀器 U3010紫外/可見分光光度計（Hitachi， Japan）;SENCO 5 L旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申生科技有限公司）;DZF-6021 真空干燥箱;AL104電子天平（METTLER TOLEDO，上海）;DHG-9070A 電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科技有限公司）;98-1-B電熱套（上海申生科技有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作[12]。精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，溶解于25 mL的甲醇溶液中，制成終濃度為0.2? mg/mL 的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。分別使用精密容器量取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于25 mL的容量瓶內(nèi)，分別加水至6 mL，混勻，隨后加入5% NaNO2溶液1.0 mL，充分混勻，靜置6 min 后，加入10% Al（NO3）3 溶液1.0 mL，混勻，靜置6 min，隨后加入4% NaOH 溶液10 mL，加水定容后充分搖勻，靜置15 min后，以空白試劑作參比，用紫外分光光度計在波長510 nm下測定吸光度，得蘆丁濃度（ρ，mg/mL）與吸光度（A）的回歸方程，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 柞樹葉總黃酮含量的測定[13]。

分別稱取柞樹葉粉1.0 g，置于50 mL 錐形瓶中，加20 mL 50%乙醇于60 ℃水浴中浸提90 min，提取物4層紗布過濾，5 000 r/min的條件下離心20 min，收集上清液，得柞樹葉總黃酮樣品待測。取1 mL待測液至50 mL容量瓶中，按照測定蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液吸光度的步驟測定吸光度（A）， 重復(fù)3次，取平均值，計算供試品中總黃酮的含量（以蘆丁計，mg/g），再計算平均值。計算公式為：

供試樣品中總黃酮含量（mg/g）=C·V·nW

式中，C 為供試品溶液的總黃酮濃度（mg/mL），V 為供試品溶液定容的體積（mL），n 為稀釋倍數(shù)，W為稱樣量（g）。

1.3.3 提取單因素試驗。以料液比、提取時間、提取溫度和乙醇的體積分?jǐn)?shù)為參考指標(biāo)確定其提取的最適范圍，試驗重復(fù)3次，計算樣品中黃酮含量。

1.3.3.1 不同料液比對柞樹葉總黃酮含量的影響。分別準(zhǔn)確稱取1.00 g 柞樹葉粉于250 mL容量瓶中，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%、溫度為60? ℃、提取時間為90 min的條件下，控制料液比分別為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g∶mL），按“1.3.2”方法分別提取柞樹葉中總黃酮化合物并測定其含量，選擇提取適合的料液比范圍。

1.3.3.2 不同提取時間對柞樹葉總黃酮含量的影響 。 分別準(zhǔn)確稱取1.00 g 柞樹葉粉于250 mL容量瓶中，在固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%、溫度60? ℃、料液比1∶20（g∶mL）的條件下，將提取時間分別控制在30、60、90、120和150 min，按照“1.3.2”方法從柞樹葉中提取總黃酮化合物并測定其含量，篩查確定較佳的提取時間范圍。

1.3.3.3 不同提取溫度對柞樹葉總黃酮含量的影響。? 分別準(zhǔn)確稱取1.00 g柞樹葉粉于250 mL容量瓶中，在固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%、提取時間90 min、料液比1∶20（g∶mL）的條件下，將提取溫度依次控制在40、50、60、70和80? ℃，依舊“1.3.2”方法從柞樹葉中提取總黃酮化合物并測定其含量，以便明確較佳的提取溫度范圍。

1.3.3.4 不同的乙醇體積分?jǐn)?shù)對柞樹葉總黃酮含量的影響。準(zhǔn)確稱取1.00 g柞樹葉粉末若干份于250 mL容量瓶中，在固定溫度60 ℃、提取時間90 min、料液比1∶ 30（g∶mL）的條件下，在乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%和80%的條件下，按“1.3.2”方法從柞樹葉中提取總黃酮化合物并測定其含量，從而獲得較佳的提取乙醇體積分?jǐn)?shù)范圍。

1.3.4 正交試驗設(shè)計。以控制單一變量為基礎(chǔ)，以乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、料液比（B）、提取溫度（C）、提取時間（D）4個因素為變量，分別各設(shè)定3個水平，按照L9（34）正交表（表1）進(jìn)行正交試驗，確定從柞樹葉中提取總黃酮化合物的最佳條件。

1.3.5 抑菌試驗及抑菌活性測定。

1.3.5.1 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的配制。將牛肉膏3 g、蛋白胨10 g及氯化鈉5 g溶解于1 000 mL蒸餾水中，用150 g/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH至7.2～7.4，加入20 g瓊脂，加熱煮沸使瓊脂融化，分裝于燒瓶內(nèi)，并于121 ℃下高壓滅菌15 min[14]。

1.3.5.2 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的配制。將牛肉膏3 g、蛋白胨10 g及氯化鈉5 g溶解于1 000 mL蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH 7.4，分裝于各試管、燒瓶內(nèi)，121 ℃下高壓滅菌15 min。

1.3.5.3 菌懸液及不同濃度柞樹葉總黃酮提取液的制備。將供試菌株用相應(yīng)斜面培養(yǎng)基活化培養(yǎng)24 h，用接種環(huán)挑取一環(huán)菌體放入裝有9 g/L無菌氯化鈉的錐形瓶中，充分搖勻，用血球計數(shù)板計數(shù)，配制成濃度為5×106cfu/mL的菌懸液，備用。取0.5 g/mL柞樹葉總黃酮提取液，采用二倍稀釋法[15]稀釋為濃度500、250、125、62.5、31.25、15.625 mg/mL，備用。

1.3.5.4 抑菌試驗及抑菌活性測定。在直徑為9 cm的培養(yǎng)皿中加入15 mL營養(yǎng)肉汁瓊脂培養(yǎng)基，分別吸取上述各種菌懸液0.5 mL加入培養(yǎng)基中，混勻，凝固后每個培養(yǎng)皿等距離放置5個滅菌牛津杯，于其中分別滴加0.2 mL的不同濃度柞樹葉總黃酮提取液，對照滴加9? g/L無菌氯化鈉溶液，每種供試菌設(shè)置5個平行試驗，在37? ℃條件下培養(yǎng)24 h，移去牛津杯，測量各組試驗的抑菌圈直徑。試驗重復(fù)3次，取平均值。

1.4 數(shù)據(jù)處理及分析 利用SPSS 19.0軟件及Excel 2010對所得試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行整理、分析和制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線 根據(jù)試驗方法中“1.3.1”，用紫外分光光度計測定510 nm 處不同濃度梯度的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光值，以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的濃度（x）作為橫坐標(biāo)，吸光度（y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖1所示。用最小二乘法經(jīng)線性回歸，得回歸方程：y=13.779x-0.000 5（R2=0.999 5）。結(jié)果表明，溶液濃度控制在8～48 μg/mL范圍內(nèi)，蘆丁對照品溶液濃度與吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.2 不同因素對總黃酮提取量的影響

2.2.1 料液比。該試驗中，在提取時間90? min、提取溫度60 ℃、乙醇濃度50%恒定不變的條件下，料液比對柞樹葉總黃酮化合物提取量的影響結(jié)果見圖2。由圖2可見，在一定范圍內(nèi)，從柞樹葉中提取出的總黃酮化合物的含量隨著試驗中料液比的增加而增多，這可能是由于料液比對溶劑傳質(zhì)過程速度的影響，料液比越大，溶劑的傳質(zhì)速度越快，越有利于黃酮類化合物的浸出[16];當(dāng)料液比為1∶20（g∶mL） 時，柞樹葉的總黃酮提取量最高，為（4.97±0.06） mg/g;而當(dāng)料液比繼續(xù)增大時，總黃酮化合物的提取量反而開始下降?？梢姡S著料液比的濃度增加到一定程度時，黃酮類化合物在溶劑中的浸出會達(dá)到一種飽和的狀態(tài)，致使其浸出受阻[10]，故料液比控制在1∶20時為最佳提取條件。

2.2.2 提取時間。在料液比1∶20、提取溫度60 ℃、乙醇濃度50%的條件下，提取時間對柞樹葉總黃酮提取量的影響見圖3。由圖3可見，柞樹葉總黃酮提取量隨著提取時間的增加而提高，當(dāng)提取時間控制在90? min時，黃酮提取量最高，為（4.98 ± 0.06） mg/g;當(dāng)時間超過120? min后，總黃酮的提取量開始略有下降，隨著提取時間的繼續(xù)延長，其提取量維持在一個相對穩(wěn)定的狀態(tài)，增加的幅度基本不明顯（P>0.05），但提取時間過長并不利于工業(yè)化生產(chǎn)。因此，在控制其他因素不變的情況下，最佳提取時間應(yīng)為90? min。

2.2.3 提取溫度。在料液比1∶20、提取時間90? min、乙醇濃度50%的條件下，提取溫度對柞樹葉總黃酮提取量的影響結(jié)果見圖4。由圖4可見，當(dāng)溫度控制在一定范圍內(nèi)時，隨著溫度的升高，由于溶劑效應(yīng)和熱效應(yīng)的影響，使得分子運(yùn)動速率加快，有利于黃酮類化合物向細(xì)胞外的溶出[17]，總黃酮提取物的含量也隨之增加。當(dāng)溫度超過乙醇的沸點(diǎn)時，乙醇會產(chǎn)生揮發(fā)，溫度過高可能引起柞樹葉黃酮類化合物提取量的降低，這可能是由于高溫使其結(jié)構(gòu)被氧化破壞。當(dāng)溫度超過60 ℃時，總黃酮的提取量開始下降;當(dāng)溫度達(dá)到60 ℃時，柞樹葉總黃酮提取量最高，為（5.00 ±0.07） mg/g。故柞樹葉中黃酮化合物提取的最佳溫度是60 ℃。

2.2.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)。在料液比1∶20、提取時間90? min、提取溫度60 ℃的條件下，乙醇體積分?jǐn)?shù)對柞樹葉總黃酮提取量的影響結(jié)果見圖5。由圖5可見，控制其他因素不變的情況下，乙醇體積分?jǐn)?shù)在10%～50%范圍內(nèi)時，總黃酮類化合物的提取量與之呈正相關(guān);當(dāng)體積分?jǐn)?shù)達(dá)到50%時，提取量達(dá)到最高，為（4.98±0.07） mg/g;隨后總黃酮的提取量與乙醇體積分?jǐn)?shù)呈負(fù)相關(guān)。當(dāng)乙醇體積過小時，該濃度不能夠?qū)ⅫS酮類化合物溶出細(xì)胞外，導(dǎo)致提取液中總黃酮量較低;當(dāng)乙醇體積過大時，該濃度使得細(xì)胞外滲透壓加大，黃酮類化合物的提取量受到影響。因此乙醇體積分?jǐn)?shù)控制在50%時，柞樹葉總黃酮的提取量最大。

2.3 柞樹葉總黃酮提取正交試驗結(jié)果及分析 在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，將乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取溫度和提取時間4個因素按照表1設(shè)計L9（34）正交試驗，從而確定9組不同的試驗組合，研究各因素對柞樹葉總黃酮提取量的影響，結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。由表2可見，RA>RD>RB>RC，即柞樹葉總黃酮提取量對各因素的敏感度排序為乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）>提取時間（D）>料液比（B）>提取溫度（C）。方差分析進(jìn)一步驗證，各個影響因素對提取率影響達(dá)到極顯著水平（P<0.01）。Duncans多重比較結(jié)果表明，從柞樹葉中提取總黃酮的最佳工藝為A3B2C3D2，即提取乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%，料液比為1∶20，提取溫度為60 ℃，提取時間為60 min，在該條件下總黃酮提取含量為5.06%（相對于被提取的柞樹葉質(zhì)量）。

2.4 抑菌活性 由表4可見，柞樹葉總黃酮提取物溶液對4 種供試菌均有一定的抑制作用，對痢疾志賀氏菌的抑制效果最好，其次為金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和腸道沙門氏菌。在柞樹葉總黃酮提取物溶液濃度低于62.5 mg/mL 時，對4種供試菌抑制作用不明顯;提取物溶液濃度低于125 mg/mL 時，對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和腸道沙門氏菌抑制作用不明顯;提取物溶液濃度低于250 mg/mL 時，對腸道沙門氏菌抑制作用不明顯。由抑菌圈直徑大小可見，柞樹葉總黃酮提取物溶液對各供試菌的抑制作用隨著濃度的增大而增加。