lysC定點突變及l(fā)ysC、asdA串聯(lián)表達對谷氨酸棒桿菌L-蘇氨酸積累的影響

黃勤勤 王慧梅 梁玲 黃欽耿 吳松剛 黃建忠

（福建師范大學生命科學學院 福建師范大學工業(yè)微生物教育部工程研究中心，福州 350117）

L-蘇氨酸（L-Threonine）被認為是動物體內第二或第三限制性氨基酸，是人體和動物的必需氨基酸。已被廣泛應用于食品、飼料及醫(yī)藥行業(yè)［1-2］。目前，國內外生產(chǎn)L-蘇氨酸的主流方法是微生物直接發(fā)酵法［3-4］。其中，大腸桿菌（Escherichia coli）工程菌是目前生產(chǎn)中最為常用的宿主菌株［5］。但是由于其安全性不高，并且隨著代謝的進行，生產(chǎn)過程中會逐漸積累一些毒素，故在醫(yī)藥行業(yè)中不能使用大腸桿菌生產(chǎn)蘇氨酸。相對來說，無致病性的安全菌株谷氨酸棒狀桿菌同樣作為氨基酸的傳統(tǒng)生產(chǎn)菌株，其優(yōu)勢就展現(xiàn)出來了。隨著谷氨酸棒桿菌模式菌株ATCC 13032測序的完成，氨基酸合成途徑及代謝調控機理逐漸清晰，以及谷氨酸棒桿菌遺傳操作體系的建立和完善，谷氨酸棒桿菌正成為氨基酸代謝工程改造的基盤菌株［6］。

L-蘇氨酸的生物合成是以TCA循環(huán)中間代謝物草酰乙酸為前體。底物葡萄糖代謝經(jīng)過糖酵解途徑、磷酸戊糖途徑、TCA循環(huán)及C3-C4回補途徑等中心代謝途徑，由草酰乙酸經(jīng)天冬氨酸轉氨酶催化生成L-天冬氨酸，即進入L-蘇氨酸合成途徑。L-天冬氨酸經(jīng)天冬氨酸激酶（AK，編碼基因lysC）和天冬氨酸半醛脫氫酶（ASD，編碼基因asdA）兩步酶催化反應后，再經(jīng)過高絲氨酸脫氫酶生成L-高絲氨酸，經(jīng)高絲氨酸激酶生成L-磷酰-高絲氨酸，最后經(jīng)蘇氨酸合酶形成L-蘇氨酸［7］。AK由LysC基因編碼，同時受L-蘇氨酸、L-賴氨酸、L-甲硫氨酸的協(xié)同反饋抑制。天冬氨酸激酶（AK，編碼基因lysC）是合成L-蘇氨酸中的關鍵酶之一，控制天冬氨酸族合成途徑總碳流量。因此，通過對一些經(jīng)傳統(tǒng)育種方法選育得到的L-蘇氨酸生產(chǎn)菌進行組學研究分析，發(fā)現(xiàn)AK和ASD是該合成途徑上影響L-蘇氨酸產(chǎn)量的關鍵酶之一［8］。

圖1 L-蘇氨酸的生物合成途徑

Dong等［9］將谷棒桿菌的lysC基因第279位突變點A突變?yōu)門解除了L-賴氨酸和L-蘇氨酸反饋抑制的能力。其表達lysC基因并且串聯(lián)表達hom基因和thrB基因使部分碳流量從L-賴氨酸（50%）轉移至L-蘇氨酸，使谷氨酸棒桿菌L-蘇氨酸產(chǎn)量達到4.85 g/L。徐德雨等［10］發(fā)現(xiàn)在高產(chǎn)菌的天冬氨酸激酶AK中存在 G359D 突變，驗證突變后可阻斷賴氨酸引起的別構效應，從而有效解除賴氨酸與蘇氨酸的協(xié)同抑制。通過體外天冬氨酸激酶野生型和G359D 突變體酶活檢測，其突變體在10 mmol/L賴氨酸和蘇氨酸同時存在時酶活達到76.94%±1.61%，而野生型酶活僅4.38%±1.28%。由此可見，AK酶定點突變可解除L-蘇氨酸、L-賴氨酸的協(xié)同抑制，提高酶活，從而使碳流量更多的流向產(chǎn)L-蘇氨酸方向，達到提高L-蘇氨酸產(chǎn)量目的。

本文以選育獲得的一株甲硫氨酸和異亮氨酸缺陷（Met-/Ile-）及 α-氨基 -β-羥基戊酸抗性（AHVr）的谷氨酸棒狀桿菌T11（Corynebacterium glutamicumT11）為出發(fā)菌株，通過基因克隆和序列分析，在已有突變的基礎上，采用PCR介導的方式對lysC基因進行定點突變，構建L-蘇氨酸高效抗反饋抑制的關鍵酶基因lysCr-asdA串聯(lián)表達組件轉化出發(fā)菌株T11，篩選獲得過量積累L-蘇氨酸工程菌株，進行搖瓶和30 L全自動發(fā)酵罐分析工程菌的產(chǎn)酸能力、細胞生長及雜酸的積累情況，為進一步的L-蘇氨酸的代謝工程改造奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒 谷氨酸棒狀桿菌T11（C.glutamicumT11）本實驗室選育并保藏；大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞，購自于全式金；穿梭表達載體pZ8-1由中國科學院微生物所李寅研究員贈送。

1.1.2 試劑和儀器 限制性內切酶、T4 DNA連接酶、DNA Marker、PrimeStar DNA聚合酶和PCR試劑：TaKaRa寶生物公司產(chǎn)品；引物合成、sanPreP 柱式膠回收DNA試劑盒、質粒小量提取試劑盒：生工生物工程（上海）股份有限公司產(chǎn)品；點突變試劑盒Fast Mutagenesis System：北京全式金生物技術有限公司；酵母粉和胰蛋白胨：Bio Basic Inc公司產(chǎn)品；其余試劑均為國產(chǎn)或進口分析純。

PCR儀：ABI產(chǎn)品；電泳儀：DYY-6C北京六一儀器廠；紫外分光光度計：UV-282PCS，尤尼柯（上海）儀器有限公司；電轉儀：Eppendorf 2510，艾本德中國有限公司；高效液相色譜：島津公司；30L發(fā)酵罐：鎮(zhèn)江東方生物工程設備有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基 LB 培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，若為固體培養(yǎng)基，則額外添加2.0%（w/v）的瓊脂粉。

LBG 培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基添加0.5%（w/v）的葡萄糖，若為固體培養(yǎng)基，則額外添加2.0%（w/v）的瓊脂粉。

上述培養(yǎng)基的pH均調至7.0±0.1大腸桿菌用LB培養(yǎng)基；C. glutamicum用LBG培養(yǎng)基，其中用于C.glutamicum和E. coli的篩選標記卡那霉素使用的終濃度分別為 25 μg/mL 和 50 μg/mL。

種子培養(yǎng)基各組成質量分數(shù)分別為：葡萄糖2.5%，豆粕提取粉2.0%，尿素0.125%，玉米漿2.0%，KH2PO40.1%，MgSO40.05%，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.05%，VB1100 μg/L，VH150 μg/L，20% 的氨水調pH 6.9±0.1。

發(fā)酵培養(yǎng)基組成質量分數(shù)分別為：葡萄糖8%，豆粕提取粉2.0%，（NH4）2SO43.5%，玉米漿2.0%，KH2PO40.1%，MgSO40.1%，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.05%，CaCO33.0%，VB1100 mg/L，VH150 mg/L，20%的氨水調pH 6.9±0.1。

1.2 方法

1.2.1lysC-asdA串聯(lián)基因簇的克隆 根據(jù)C. glutamicumT11菌株的16S rDNA的序列比對結果，以谷氨酸棒狀桿菌ATCC13869基因組序列為模板，設計lysC-asdA串聯(lián)基因簇的上下游引物CA-F、CA-R。

CA-F：5'-CGGAATTCCG GTGGCCCTGGTCGTACAGAAATATGGC-3'；CA-R ：5'-CGGGATCCCG TTACTTAACCAGCAGCTCAGCG-3'。其中引物CA-F帶有EcoRⅠ酶切位點和保護堿基，CA-R帶有BamHⅠ酶切位點和保護堿基（下劃線序列）。

以C. glutamicumT11菌株基因組為模板進行PCR擴增。反應體系為50 μL：10×Ex buffer 5 μL，引物CA-F、CA-R各2 μL，基因組DNA模板0.5 μL，dNTP 2.5 μL，Ex Taq 酶 1 μL，ddH2O 補 足 至50 μL。反應條件為：95℃預變性 5 min；95℃ 40 s，57℃ 40 s，72℃ 2.5 min，35個循環(huán)；72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物1%的瓊脂糖凝膠檢測，膠回收試劑盒純化回收，備用。

1.2.2 pZ8-1-lysC-asdA重組載體的構建 采用限制性內切酶EcoRⅠ和BamHⅠ分別對串聯(lián)基因片段lysC-asdA和穿梭表達質粒pZ8-1進行雙酶切處理，分別回收目的片段，然后用 T4 DNA ligase進行連接，連接體系參考TaKaRa ligase kit 說明書。連接反應結束后，轉化E. coliJM109感受態(tài)細胞，轉化液涂布含50 μg/mL卡那霉素的LB平板，37℃ 倒置培養(yǎng)過夜。從平板上挑選單克隆，采用驗證引物（F：5'-TTCTGGCAAATATTCTGAAATGAGC-3'和R：5'-TTCGCAACGTTCAAATCCGC-3'）進行菌落PCR驗證，并挑取陽性克隆進行37℃過夜培養(yǎng)，提取質粒，并對質粒進行酶切和測序驗證。

1.2.3 PCR介導的lysC基因的定點突變 為了將lysC基因的第279位密碼子定點突變，以陽性克隆質粒pZ8-1-lysC-asdA為模板，使用攜帶突變位點的引物Cr-A-F和Cr-A-R，參考Fast Mutagenesis System說明書，進行PCR介導的定點突變，擴增，挑取抗性平板克隆進行酶切驗證，并將陽性克隆送交上海生工進行測序驗證。

lysC基因PCR介導的定點突變引物設計如下：Cr-A-F：5'-CCGATAAGCCAGGCGAGACTGCGAAGG TTTTCCG-3'；Cr-A-R：5'-CAGCCTCGCCTGGCTTATC GGAAATACCCAGAACGG-3'

其中加粗的堿基為引入的突變堿基。提取質粒并進行測序驗證，構建的表達載體命名為pZ8-1-lysCr-asdA，具體的構建原理如圖2所示。

1.2.4 產(chǎn)L-蘇氨酸工程菌的構建和篩選

1.2.4.1 構建 將獲得的陽性pZ8-1-lysCr-asdA重組質粒電轉導入谷氨酸棒狀桿菌T11感受態(tài)細胞中［11］。谷氨酸棒狀桿菌T11感受態(tài)細胞按文獻制備［12］，抗性平板篩選及菌落PCR驗證，構建含有表達質粒pZ8-1-lysCr-asdA的工程菌株。

1.2.4.2 篩選 從抗性平板中挑取菌落大的陽性克隆，直接接種至每孔含有1 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的96微孔板初篩，30℃，220 r/min培養(yǎng)48 h，檢測發(fā)酵液中L-蘇氨酸含量，并對初篩L-蘇氨酸積累較多的菌株進行搖瓶發(fā)酵復篩和遺傳穩(wěn)定性驗證。遺傳穩(wěn)定性分析為每24 h斜面?zhèn)鞔淮?，傳?代，每隔一代進行搖瓶發(fā)酵，檢測工程菌株的L-蘇氨酸產(chǎn)量。最后選取L-蘇氨酸產(chǎn)量較高且遺傳穩(wěn)定的工程菌株進行進一步的發(fā)酵分析。

1.2.5 L-蘇氨酸工程菌株的搖瓶發(fā)酵分析 所獲得的工程菌T11/pZ8-1-lysCr-asdA經(jīng)搖瓶發(fā)酵后分析其L-蘇氨酸含量、菌體生物量以及其他氨基酸的生成情況。搖瓶發(fā)酵采用一級發(fā)酵，培養(yǎng)條件為：30℃，220 r/min發(fā)酵60 h，同時以出發(fā)菌株T11為對照菌株。氨基酸的含量采用高效液相色譜系統(tǒng)（HPLC）自動柱前衍生化法測定。色譜柱為Venusil-AA柱。采用流動相組成為水相（1 L）：7.6 g無水乙酸鈉，925 mL 高純水，冰醋酸調pH至6.5；有機相（1 L）：80% 乙腈。色譜條件：柱溫40℃，流量1.0 mL/min，SPD-M20A檢測器。

1.2.6 L-蘇氨酸工程菌株的30 L罐補料分批發(fā)酵 根據(jù)搖瓶發(fā)酵特性，結合已有的發(fā)酵工藝，采用二級發(fā)酵的方式對L-蘇氨酸工程菌株T11/pZ8-1-lysCr-asdA進行補料分批發(fā)酵，考察高密度發(fā)酵情形下的L-蘇氨酸產(chǎn)率、葡萄糖的利用率及細胞生長情況，綜合評價菌株的發(fā)酵潛力。

搖瓶種子培養(yǎng)：挑一環(huán)新鮮斜面上的菌體接種至裝有 30 mL LBG培養(yǎng)基的250 mL 三角瓶中，30℃，220 r/min 振蕩培養(yǎng)12 h至對數(shù)生長中后期，?OD562nm約為 0.2×100。

種子罐培養(yǎng)：按0.33%的接種量，將搖瓶種子液轉接至含有3 L種子培養(yǎng)基的5 L種子罐中，初始攪拌300 r/min，培養(yǎng)溫度30℃，種子罐周期8 h，移種?OD562nm約為0.30×100。

補料發(fā)酵培養(yǎng)：30 L發(fā)酵罐初始裝液量為15 L，移種量 20%，初始葡萄糖濃度約125 g/L，發(fā)酵溶氧維持在25%-35%，初始攪拌轉速 300 r/min，發(fā)酵溫度30℃，流加 25%的氨水以控制 pH在6.9-7.0，發(fā)酵期間每隔2 h 取樣檢測菌體生物量及殘?zhí)?，根?jù)耗糖速率確定補料量；當殘?zhí)墙抵?5.0 g/L 以下時連續(xù)流加700 g/L 的葡萄糖，維持殘?zhí)菨舛仍?.0-10 g/L，發(fā)酵結束前4 h，停止流加葡萄糖，當殘?zhí)腔竞谋M時，發(fā)酵結束，整個發(fā)酵周期約60 h。

2 結果

2.1 lysC-asdA串聯(lián)基因的克隆

以谷氨酸棒狀桿菌生產(chǎn)菌T11基因組為模板，引物CA-F、CA-R為引物對擴增出一段約2 300 bp條帶，并對目的產(chǎn)物進行膠回收（圖3），其與相似基因組ATCC13869的lysC-asdA的理論大?。? 324 bp）基本一致。

圖3 lysC-asdA基因PCR擴增及回收

2.2 pZ8-1-lysC-asdA重組載體的構建及l(fā)ysC的定點突變

轉化經(jīng)酶切的質粒與目的基因，長出單菌落后隨機挑取9個單克隆，用驗證引物直接進行菌落PCR驗證，隨機挑取的8個單克隆均為陽性克?。▓D4-A），篩選菌落PCR陽性的單克隆進行質粒抽提和單切和雙切驗證，確認質粒pZ8-1中插入大小約為2 400 bp的目的片段（圖4-B）。另外，測序結果顯示插入的基因片段確為目標片段，確認pZ8-1-lysC-asdA構建成功。

值得注意的是，克隆的lysC-asdA基因較親緣關系最近（相似性為99%）的ATCC13869存在顯著差異，其lysC基因的ORF區(qū)域有多達8個堿基的突變，其中6個為無義突變，但該突變在理論上都與密碼子識別相關，另外兩個堿基的突變都導致了氨基酸的突變；asdA基因也有4個堿基的突變，但都是無義突變，這4個堿基的突變都同樣涉及到密碼子優(yōu)化的問題。這極有可能和出發(fā)菌株T11本身經(jīng)歷過多輪次的誘變選育有關。pZ8-1-lysC-asdA質粒載體經(jīng)EcoRⅠ和BamHⅠ酶切后，出現(xiàn)7 000 bp和2 400 bp的兩條帶，與預期結果一致。

A. 重組表達質粒pZ8-1-lysC-asdA的菌落PCR驗證；B. pZ8-1-lysC-asdA質粒的酶切驗證；（A：M：200 bp Ladder DNA marke；1-7：重組表達質粒pZ8-1-lysC-asdA菌落PCR驗證；8：pZ8-1空質粒對照；9：T11出發(fā)菌株對照；B：M：λ-Hind Ⅲ digest DNA marker；1：pZ8-1-lysC-asdA質粒經(jīng)BamHⅠ單酶切；2：pZ8-1質粒經(jīng)BamHⅠ單酶切；3：pZ8-1-lysC-asdA質粒經(jīng)EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切）

為進一步提高lysC基因的抗反饋抑制的能力，采用PCR介導的方式對lysC基因進行另一關鍵位點的定點突變。獲得的陽性克隆中提取質粒并進行測序分析，結果顯示，突變后的lysCr-asdA基因與突變前的基因差異在第279位密碼子由GCT突變成ACT，所編碼的氨基酸由丙氨酸變?yōu)樘K氨酸，與定點突變設計目標一致，表明表達載體pZ8-1-lysCrasdA構建成功。

2.3 工程菌株獲得及其篩選

將獲得的含有抗反饋抑制突變的串聯(lián)表達質粒 pZ8-1-lysCr-asdA電轉化至L-蘇氨酸菌株C.glutamicumT11感受態(tài)細胞，采用含卡那霉素抗性平板進行篩選，隨機挑取單菌落，驗證引物F和R組成的引物對其進行菌落PCR鑒定，結果顯示在約2 800 bp的特異條帶，與理論預測大小一致，說明外源質粒導入宿主菌株，成功獲得含有表達載體的工程菌。

挑選了300個單克隆進行96孔板初篩，并從中獲得10株生長速度較快且L-蘇氨酸含量較高的菌株進行搖瓶復篩和遺傳穩(wěn)定性驗證。結果顯示，選取的10株相對高產(chǎn)的菌株中，幾株菌株傳至第二代遺傳穩(wěn)定性逐漸降低，在斜面?zhèn)髦恋谌鷷r，產(chǎn)酸明顯下降，再繼續(xù)傳代，L-蘇氨酸產(chǎn)量下降最高達到14.4%。相對而言，其中一株菌株L-蘇氨酸產(chǎn)量最高，而且穩(wěn)定性維持在較高水平，具備進行進一步發(fā)酵驗證和分析的潛力，將該工程菌株菌株命名為T11/pZ8-1-lysCr-asdA。

2.4 工程菌株T11/pZ8-1-lysCr-asdA搖瓶發(fā)酵產(chǎn)L-蘇氨酸能力分析

為了分析工程菌株T11/pZ8-1-lysCr-asdA發(fā)酵合成L-蘇氨酸的能力，將其與菌株T11/pZ8-1和T11/pZ8-1-lysC-asdA及出發(fā)菌株T11在相同條件下進行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，考察L-蘇氨酸濃度、主要雜酸情況及菌株生物量（OD562nm），結果見表1。

從L-蘇氨酸的生物合成和生物量來說，菌株T11/pZ8-1-lysCr-asdA的L-蘇氨酸的濃度和細胞密度都最高，T11/pZ8-1-lysC-asdA次之，這說明串聯(lián)基因簇的表達對于L-蘇氨酸的合成與積累作用顯著，而且通過調控其他氨基酸的生物合成，一定程度上對細胞的生長代謝帶來了益處；轉入空載體pZ8-1/T11菌株無論是細胞密度還是L-蘇氨酸濃度都是最低的，這可能與空載體在宿主細胞內消耗了一定的能量，從而影響細胞繁殖和氨基酸的代謝合成有關。

表1 T11/ pZ8-1-lysCr-asdA發(fā)酵性能比較

另外，從主要雜酸的生物合成情況來看，出發(fā)菌T11與對照菌株T11/pZ8-1的賴氨酸、丙氨酸、和甘氨酸含量接近，而含有串聯(lián)基因簇的工程菌株，其丙氨酸含量顯著降低，但賴氨酸和甘氨酸含量有所提高，說明lysC-asdA的串聯(lián)表達加速了前體物丙酮酸的轉化，有效地將碳流量引入了合成蘇氨酸的合成途徑，顯著提高天冬氨酸族合成代謝流，但這其中碳流向不僅包括蘇氨酸的生物合成，還有一部分流向了賴氨酸的生物合成，而甘氨酸作為蘇氨酸的降解途徑之一，其生物合成的增加意味著更多的蘇氨酸在細胞內被降解。

相比較T11/pZ8-1-lysC-asdA與T11/pZ8-1-lysCrasdA菌株，lysC基因的突變對于L-蘇氨酸的生物合成有積極意義，其進一步提高了lysC基因編碼產(chǎn)物抗反饋抑制的能力，增強了L-蘇氨酸生物合成代謝流。而對于提高 L-蘇氨酸產(chǎn)量，lysCr-asdA的定點突變和串聯(lián)表達較lysC-asdA串聯(lián)表達具有更顯著的作用。

2.5 工程菌株T11/pZ8-1-lysCr-asdA 30L罐的補料分批發(fā)酵

為進一步分析T11/pZ8-1-lysCr-asdA工程菌株的代謝情況，以出發(fā)菌株T11為對照，在30 L 全自動發(fā)酵罐中進行補料分批發(fā)酵，考察菌株的發(fā)酵生產(chǎn)性能。發(fā)酵過程代謝曲線見圖5，工程菌株T11/pZ8-1-lysCr-asdAL-蘇氨酸發(fā)酵產(chǎn)量達65.5 g/L，糖酸轉化率達 39.5%，較出發(fā)菌株分別提高29.5%和33.9%。

發(fā)酵0-16 h，菌株處于適應期，細胞密度均增長較慢，但細胞的耗糖速率有差別，工程菌株T11/pZ8-1-lysCr-asdA的耗糖速率明顯要大，說明其細胞更為活躍，代謝更為旺盛；發(fā)酵16 h之后，細胞均進入對數(shù)生長期，菌株T11/pZ8-1-lysCr-asdA在發(fā)酵24 h開始流加補糖，36 h時達到最大菌濃，其最大菌濃時OD562nm為112.6，補糖時間和達到最大菌濃時間均較對照菌株提前6 h，最大菌濃也較對照菌株T11高16.8%；發(fā)酵36 h后，L-蘇氨酸的積累速率明顯加快，兩者均在發(fā)酵56 h時達到最大的產(chǎn)酸率，隨著發(fā)酵的進行，L-蘇氨酸的積累和生物量在56 h和60 h之間降低，因此，發(fā)酵在60 h終止。

3 討論

AK是整個天冬氨酸族氨基酸合成途徑上的第一個關鍵酶，由lysC基因編碼，控制合成天冬氨酸族氨基酸的碳流量。ASD是繼AK后另一個關鍵限速酶，這兩個基因的轉錄皆受L-賴氨酸、L-蘇氨酸反饋阻遏調控。故對于構建天冬氨酸族氨基酸如L-賴氨酸、L-甲硫氨酸、L-蘇氨酸、L-異亮氨酸高產(chǎn)菌株具有重要意義。Kalinowski等［13-14］發(fā)現(xiàn)lysC基因與asdA基因是同一基因簇的相鄰基因，其中l(wèi)ysC基因編碼蛋白由兩個亞基α和β相互重疊組成，而當β亞基中的一個堿基發(fā)生改變時，整個AK蛋白表現(xiàn)抗反饋特性。本研究以一株Met-、Ile-和蘇氨酸結構類似物抗性的蘇氨酸產(chǎn)生菌為出發(fā)菌株，在獲得已鑒定突變的基礎上，進一步對lysC基因的第279位密碼子進行定點突變，核苷酸由GCT突變?yōu)锳CT，所編碼的氨基酸由丙氨酸突變蘇氨酸，氨基酸由疏水性變?yōu)橛H水性，這可能進一步改變AK的分子構象，可能Ala279位點具有穩(wěn)定配體Lys與AK結合的作用，從而加強了Lys對AK的反饋抑制。故將該位點改變打破了其與Lys間的非共價鍵作用，從而解除賴氨酸對天冬氨酸激酶的反饋抑制，削弱L-蘇氨酸和L-賴氨酸對AK酶抑制能力，同時提升了磷酸-天冬氨酸對AK的親和能力，從而增強L-蘇氨酸代謝流。這一點，與工程菌株的蘇氨酸生物合成和積累的情況一致，lysC的突變有效的提高了蘇氨酸合成的碳流量，使L-蘇氨酸產(chǎn)量提高。

加速限速反應作為菌株選育的常用策略，除了解除終產(chǎn)物的反饋抑制手段之外，關鍵酶基因的高效表達則更能從關鍵酶的表達量上實現(xiàn)限速反應的加速進程。Ishida等［15］通過構建重組質粒pDR34，在乳糖發(fā)酵短桿菌同時串聯(lián)表達了hom、thrB和thrC基因，發(fā)酵72 h使得L-蘇氨酸產(chǎn)量從17.9 g/L達到24.8 g/L。Dong等［16］將谷氨酸棒桿菌ATCC 13869 敲除ddh基因和lysE基因使蘇氨酸產(chǎn)量提高28%，賴氨酸的量降低95%，同時串聯(lián)表達lysC、hom和thrB基因進行72 h搖瓶發(fā)酵驗證蘇氨酸含量達到7.27 g/L。本研究以強啟動子tac作為起始元件，在已有菌株特性的基礎上，串聯(lián)表達抗反饋抑制的關鍵酶基因，極大的提高了蘇氨酸產(chǎn)量。但在甲硫氨酸和異亮氨酸合成受阻的基礎上，蘇氨酸的另一支路——賴氨酸的合成同樣得到了增強，不僅如此，作為蘇氨酸的分解代謝產(chǎn)物之一的甘氨酸的含量也有所增加，其實這些都和關鍵酶基因表達之后的代謝流增強有關。這也提示我們在關注蘇氨酸積累的同時，需要進一步系統(tǒng)的考慮其他的支路代謝和氨基酸轉運體系，比如阻斷蘇氨酸競爭代謝支路，即抑制或敲除賴氨酸的表達；降低蘇氨酸胞外降解途徑，即敲除合成甘氨酸相關酶基因，運用代謝流分析的原理與方法對蘇氨酸代謝途徑進行全面分析，為我們進一步的改造明確方向。

與搖瓶發(fā)酵不同，30 L罐通過流加補料的方式保持細胞的生長和代謝性能，其目標產(chǎn)物的產(chǎn)量往往會得到大幅度的增長。值得注意的是，本研究中工程菌株T11/pZ8-1-lysCr-asdA相較出發(fā)菌株T11來說，其較出發(fā)菌株糖耗時間提前，菌株生長速度加快，最終體現(xiàn)為菌株發(fā)酵產(chǎn)酸時間提前，展現(xiàn)了更好的高密度發(fā)酵的適應性，較出發(fā)菌株其生長速率更快，原因可能一是改造后菌株的前體物丙酮酸轉化成生長抑制物如乳酸、乙酸量降低，從而減少了細胞生長的傷害，相對的加速其轉化成草酰乙酸方向，從而使碳流量更多的合成蘇氨酸的方向。二是lysCr-asdA基因與含強啟動子的pZ8-1載體串聯(lián)表達不僅使菌株的AK和ASD酶高效表達，也使碳流量方向途徑中其他的酶活得到促進，從而代謝速率加快，而且在流加補糖的過程中保持較高的L-蘇氨酸的比合成速率，這說明外源基因的表達不僅直接促進了蘇氨酸的合成，對于細胞生長和其他所需氨基酸的代謝調控也要一定的影響。

4 結論

本研究以一株Met-、Ile-和AHV抗性的蘇氨酸產(chǎn)生菌T11為出發(fā)菌株，在獲得已鑒定突變的基礎上，進一步對lysC基因的第279位密碼子進行定點突變同時串聯(lián)基因簇lysCr-asdA。成功構建pZ8-1-lysCr-asdA表達組件，串聯(lián)表達抗反饋抑制的關鍵酶基因，轉入出發(fā)菌株T11并通過96孔板高通量初篩和搖瓶復篩得到一株高產(chǎn)L-蘇氨酸且遺傳穩(wěn)定工程菌T11/pZ8-1-lysCr-asdA。發(fā)酵結果顯示其 L-蘇氨酸產(chǎn)量顯著提高，L-賴氨酸、L-甘氨酸含量均比出發(fā)菌株提高，而丙氨酸的含量下降，表明lysC的定點突變及l(fā)ysC、asdA基因的串聯(lián)表達對谷氨酸棒桿菌L-蘇氨酸的代謝流有明顯影響。