利用大腸埃希氏菌光控基因表達系統(tǒng)降解多菌靈農(nóng)殘

余姝僑 官昭瑛 陳紅

（深圳技師學(xué)院應(yīng)用生物系，深圳 518116）

多菌靈（Methyl-1H-benzimidazol-2-yl carbamate，MBC）是一種農(nóng)林業(yè)中常用的廣譜農(nóng)藥產(chǎn)品，對由真菌引起的病害有防治效果，在我國的使用范圍廣泛［1］。多菌靈也是多種常用殺菌劑（苯菌靈、甲基噻吩酯等）的有效成分或水解產(chǎn)物［2］。多菌靈為可疑致癌物、致突變物和內(nèi)分泌干擾物，在環(huán)境中較穩(wěn)定，對哺乳動物有毒害，其殘留可引起肝病和染色體畸變，土壤中的多菌靈殘留也可進入地下水系統(tǒng)危害水生生物［2-4］。它的使用在很多發(fā)達國家被嚴格控制，但在我國的使用量較大［5］。土壤和水中的多菌靈殘留通常經(jīng)微生物自然降解，如結(jié)核分枝桿菌屬、諾卡氏菌和紅球菌等［6-10］。然而，天然微生物降解效率和底物特異較低。同時，化學(xué)殺真菌劑的長期使用會改變土壤中微生物菌群的平衡，影響降解效能［11］。其他的物理或化學(xué)降解方法起效較慢，價格昂貴，設(shè)施復(fù)雜，不利于大規(guī)模推廣［12］。因此，開發(fā)合理的人工微生物降解方法對降低或去除多菌靈殘留有重要的意義。

大腸埃希氏菌（Escherichia coli）作為常用的基因工程載體，具有快速繁殖和易于進行靶基因表達調(diào)控的優(yōu)勢。選擇適合的表達系統(tǒng)對靶基因的調(diào)控具有重要意義，如誘導(dǎo)型表達系統(tǒng)可限時表達靶基因，減少過表達引發(fā)的多效性效應(yīng)，并通過規(guī)避代謝負擔(dān)獲得產(chǎn)品的最大量產(chǎn)［13-14］。常用的誘導(dǎo)系統(tǒng)通過添加化學(xué)誘導(dǎo)劑如異丙基β-D-1硫代氨基吡喃糖苷（IPTG）、脫水四環(huán)素（ATC）、阿拉伯糖或調(diào)整物理化學(xué)因素如pH、溫度或紫外光（UV）達到［15-17］?；瘜W(xué)誘導(dǎo)劑價格昂貴，有毒性，需人為添加和分離，并且不易去除，難以精準調(diào)控［15］。物理化學(xué)誘導(dǎo)方法或引起蛋白質(zhì)熱聚集（溫度誘導(dǎo)），導(dǎo)致可溶性蛋白產(chǎn)量低；或誘發(fā)細胞分子結(jié)構(gòu)變化和生化反應(yīng)（Ph誘導(dǎo)）；或產(chǎn)生細胞光毒性（紫外光誘導(dǎo)）［17-20］。光誘導(dǎo)具有廉價、環(huán)保、無細胞毒性，可隨時添加/去除，無需分離等優(yōu)勢，避免了上述誘導(dǎo)劑的劣勢，在合成生物學(xué)和生物工程中具有廣泛的應(yīng)用價值［21］。

近年來，利用重組大腸埃希氏菌降解土壤農(nóng)殘的報道逐年增加，此類應(yīng)用在大規(guī)模解毒過程中具有優(yōu)勢［6，22-24］。大多數(shù)的異源基因表達采用的是傳統(tǒng)的化學(xué)誘導(dǎo)方法。本研究根據(jù)一種由華東理工大學(xué)建立的新型的大腸埃希氏菌光控基因表達系統(tǒng)［25-26］，構(gòu)建一株可利用光源作為誘導(dǎo)劑合成多菌靈水解酶（MBC hydrolyzing esterase）的重組大腸埃希氏菌。該光控基因表達系統(tǒng)的原理為：將從粗糙鏈孢霉（Neurospora crassa）中分離的光氧電壓（LOV）結(jié)構(gòu)域蛋白（藍光傳感器VIVID），克隆到大腸埃希氏菌LexA repressor 的C端，構(gòu)成一個名為LEV1（LexA-LOV）的光敏融合蛋白，在光照條件下可形成同源二聚體，抑制下游基因的表達；而黑暗條件下，同源二聚體自然分解，下游基因得以表達（圖1）。試圖證明該光控系統(tǒng)可表達具有生物活性的多菌靈水解酶，具備廉價，高效，可操控等技術(shù)優(yōu)勢?？赏麨槎嗑`類農(nóng)藥殘留的生物降解提供新的技術(shù)手段和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

圖1 大腸埃希氏菌光控誘導(dǎo)表達系統(tǒng)的原理

1.1.1 材料與試劑 大腸埃希氏菌DH5a菌株（TaKaRa Code No.9057），質(zhì)粒DNA純化試劑盒plasmid purification kit（TaKaRa Code No.9760）， 多菌靈MBC農(nóng)藥標(biāo)準品（上海楷岳生物科技），多菌靈水解酶酶聯(lián)免疫反應(yīng)試劑盒（上海通蔚實業(yè)有限公司），大腸埃希氏菌細菌總蛋白提取試劑盒（貝博生物），SDS-PAGE蛋白凝膠配置試劑盒（詡圣生物），限 制 性 內(nèi) 切 酶EcoRI（TaKaRa Code No.1040S），KpnI（TaKaRa Code No.1068S），BglII（TaKaRa Code No.1021S），Taq DNA聚 合 酶（TaKaRa Code No.2011A），青鏈霉素（Solaria）。

1.1.2 儀器 醫(yī)用型潔凈工作臺（蘇凈安泰 SW-CJ-1F），壓力蒸汽滅菌器（雅瑪拓立式SN310C），電熱恒溫培養(yǎng)箱（一恒 DHP系列-立式），凝膠成像儀（BioRad），高速冷凍離心機（Sigma），多功能酶標(biāo)儀（Biotek），NanoDrop ND-1000 分光光度計（IMPLEN），紫外分光光度計（島津），多功能PCR機（LongGene）。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建生產(chǎn)多菌靈水解酶的光控基因表達載體 光控基因表達載體使用的載體骨架為pCDFDuet1，其中的啟動子和MCS序列被去除。組成 型 啟 動 子（bba_J23116，http：//parts.igem.org/Promoters/Catalog/Constitutive）、光敏融合蛋白LEV1和兩個大腸埃希氏菌終止子rrnB（從pBAD/His載體獲得）插入其中的EcoRI和BglII酶切位點，獲得pLEV1質(zhì)粒。在此基礎(chǔ)上，PColE啟動子（含有一個可供光敏蛋白結(jié)合的操縱子序列）、多菌靈水解酶基因mheI（從分枝桿菌中獲得，Gene bank：KX698097.2）、和報告基因mCherry均根據(jù)公布的基因序列商業(yè)合成獲得（廣州華大基因研究院），并插入到pLEV1質(zhì)粒中的KpnI和BgIII的酶切位點中，獲得pLEV1-mheI-mCherry質(zhì)粒（圖2），并通過菌落PCR驗證。菌落PCR的引物序列為：mheI-F（5'-GCGGCGTAGCTTTTATGCTG-3'），mheI-R（5'-CCATGTTATCCTCCTCGCCC-3'）。PCR 產(chǎn) 物 通過瓊脂糖凝膠電泳檢測。另外我們還設(shè)計了不含mheI基因，只有mCherry報告基因的質(zhì)粒，命名為pLEV1-mCherry，用于陰性對照。

圖2 大腸埃希氏菌pLEV1-mheI-mCherry的質(zhì)粒構(gòu)建展示（局部）

1.2.2mheI基因的表達和多菌靈水解酶的產(chǎn)量測定 將pLEV1-mheI-mCherry轉(zhuǎn)化到DH5a菌株，37℃過夜黑暗培養(yǎng)。從平板上挑取單克隆到5 mL的LB液體培養(yǎng)基（含1 μg/mL青鏈霉素）中37℃黑暗培養(yǎng)至OD600為0.6-0.8。將培養(yǎng)基中的菌液稀釋100倍到兩個20 mL的LB液體培養(yǎng)基（含青鏈霉素）中，分別光照（自然光，光照強度為普通日照）和黑暗（雙層錫箔紙包裹）過夜培養(yǎng)，溫度為37℃。重組DH5a生產(chǎn)的粗蛋白酶液通過超聲破碎的方式提?。ㄘ悓毚竽c埃希氏菌總蛋白提取試劑盒）。BCA蛋白定量試劑盒用于測定可溶性蛋白溶液，聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）用以檢測全蛋白液，酶聯(lián)免疫法測定粗酶液中多菌靈水解酶的含量。

1.2.3 多菌靈水解酶的活性測定 多菌靈水解酶的活性測定方法參照Lei等［6］的方法。具體操作為：在5 mL濃度為20 mmol/L 的Tris-HCl（pH 7.4）的緩沖液中加入40 μmol的 MBC作為底物和多菌靈水解酶作為反應(yīng)物，在30℃孵化1 h產(chǎn)生反應(yīng)。反應(yīng)以加入0.1 μg/mL的含多菌靈水解酶的粗蛋白酶液開始，到加入同等體積的乙酸乙酯終止。反應(yīng)完成后，提取上層有機相，用紫外分光光度計檢測MBC在287 nm的吸光度。一個單位的酶的活性被定義為在30℃時，1 min內(nèi)1 μmol的底物MBC被水解成二級產(chǎn)物氨基苯并咪銼（2-AB）的所需酶的量。含LEV1-mheI-mCherry質(zhì)粒的菌落在光照條件下提取出的粗酶液作為測試品。在光抑制條件下提取出的粗酶液經(jīng)過高溫沸水浴，以及不含mheI基因的pLEV1-mCherry空載體作為陰性對照。

1.2.4 mheI水解酶用于降解土壤中的MBC 土壤樣品從深圳某私家花園的場地中獲取。將從地表到地下約10 cm處的土壤用收集器收集，高壓高溫（121℃）滅菌30 min以去除所含野生微生物［19］。底物MBC以10 mg/kg的濃度被加入到約50 g的滅菌土壤樣品和50 g的未滅菌樣品，底物在無菌環(huán)境下被充分混合后，再加入4 mL的含多菌靈水解酶的粗酶液，充分混合。另取含底物MBC的未滅菌土壤作為陰性對照。每個土壤樣品的濕度調(diào)節(jié)到約30%，在30℃ 中培育76 h后，每12-16 h提取土壤樣品檢測其MBC的含量。方法參考Wang等［10］的操作并稍作改進，具體如下：5 g土壤樣品與5 mL的甲醇∶水溶液（4∶1，V/V）混合，在200 r/min的搖床混合15分鐘，離心收集上清液。此步驟重復(fù)3次共獲取約15 mL的上清液。上清液中加入10 mL的石油醚，在200 r/min的搖床混合20 min，去除石油醚層。剩余的水溶液在真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀和65℃烘箱中蒸干。殘渣溶解于2 mL的甲醇，用紫外分光光度計在287 nm檢測吸光值（參考1.2.3）。

1.2.5 統(tǒng)計分析 采用SPSS軟件（SPSS Statistics 21）進行統(tǒng)計分析與檢驗。兩組多菌靈水解酶的酶聯(lián)反應(yīng)結(jié)果使用獨立樣本t檢驗進行分析；不同實驗組多菌靈水解酶的酶活力差異，以及土壤樣本中MBC降解隨時間的變化采用單因素方差分析（oneway ANOVA）和最小顯著差異法（LSD）比較。以P＜0 .05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大腸埃希氏菌光控基因表達系統(tǒng)對mheI基因的表達

首先通過菌落PCR的方式證實重組質(zhì)粒pLEV1-mheI-mCherry的成功構(gòu)建（圖3）。含此質(zhì)粒的重組大腸埃希氏菌在黑暗誘導(dǎo)下合成多菌靈水解酶和mCherry的融合蛋白，菌液經(jīng)過夜搖瓶培養(yǎng)，可產(chǎn)生肉眼可見的粉紫色顏色變化，該顏色變化表明報告基因mCherry被成功表達；而在可見光誘導(dǎo)條件下，菌液為原色（圖4）。

圖3 瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示重組質(zhì)粒pLEV1-mheI-mCherry的成功構(gòu)建

圖4 重組大腸埃希氏菌經(jīng)光控誘導(dǎo)成功表達顯色蛋白

由于多菌靈水解酶與mCherry為融合蛋白，顏色反應(yīng)間接表明多菌靈水解酶被成功合成。SDSPAGE的結(jié)果證實，在光抑制條件下，胞內(nèi)上清含有疑似多菌靈水解酶（MHE）和mCherry的融合蛋白（～52 kD），而在光照條件下，該融合蛋白的表達量低（圖5）。多菌靈水解酶酶聯(lián)反應(yīng)的定性實驗結(jié)果（圖6）表明，光照條件下產(chǎn)生的多菌靈水解酶的量很低，而在黑暗條件下，mheI基因被成功超量表達，多菌靈水解酶的產(chǎn)量有顯著的提高（P＜0.05）。該結(jié)果同時也表明我們采用的這種光控表達系統(tǒng)的泄露率較低，在非誘導(dǎo)（光照）條件下產(chǎn)物生產(chǎn)量極少。

圖5 SDS-PAGE凝膠電泳檢測在光抑制（lane 1）或光照（lane 2）條件下產(chǎn)生的粗酶液的蛋白組成

圖 6 多菌靈水解酶酶聯(lián)免疫法檢測在光抑制（mheI dark）或光照（mheI light）條件下粗酶液與底MBC的反應(yīng)情況

2.2 多菌靈水解酶對溶液中MBC的降解

檢測光控基因表達系統(tǒng)下生成的融合蛋白的酶活能力。從含pLEV1-mheI-mCherry質(zhì)粒的菌液在黑暗的誘導(dǎo)條件下提取的粗酶液（含多菌靈水解酶），與從含pLEV1-mheI-mCherry質(zhì)粒的菌液在光照條件下提取的粗酶液（含多菌靈水解酶），和含pLEV1-mheI-mCherry質(zhì)粒的菌液在光抑制條件下提取的粗酶液（含多菌靈水解酶）經(jīng)過高溫沸水浴使其中的酶失活，以及含pLEV1-mCherry對照載體的菌液在黑暗條件下提取的粗酶液（不含多菌靈水解酶），作為對比。結(jié)果（圖7）表明，在黑暗誘導(dǎo)條件下提取的含多菌靈水解酶的粗酶液具有顯著的酶活性（F=477.928，P＜0.05），可分解溶液中的MBC底物，其他對照組的粗酶液均不具有多菌靈水解酶的活性。

mheI（dark）為光抑制條件下提取的含多菌靈水解酶的粗酶液，Inactive mheI為光抑制條件下提取的粗酶液經(jīng)過高溫失活，mheI（light）為光照條件下提取的粗酶液，LightOFF為不含mheI基因的空載體。誤差線為標(biāo)準誤（n=3），統(tǒng)計分析用單因素方差分析，*表示P＜0.05

2.3 多菌靈水解酶對土壤中MBC的降解

土壤樣品在混合MBC底物并孵化76 h后，絕大部分（＞95%）的MBC底物可從該土壤樣品中檢測出，說明MBC較穩(wěn)定，不易分解。當(dāng)加入含多菌靈水解酶的粗蛋白液后，MBC底物被快速降解。此降解在前12 h較顯著，在隨后的60 h內(nèi)逐漸變緩，可推測為多菌靈水解酶的含量逐漸減少所致（圖8）。對于加入了含多菌靈水解酶的粗蛋白液的土壤樣品，無論事先滅菌與否，MBC底物的濃度在76 h后均下降到不足30%，表明多菌靈水解酶能夠在土壤環(huán)境中有效降解MBC，不受其他野生微生物存在的影響。

3 討論

圖 8 不同土壤樣品中MBC的降解情況

常見的細菌異源基因表達系統(tǒng)中，傳統(tǒng)的化學(xué)或物理方法雖然能夠誘導(dǎo)靶基因的表達，但自身的局限性和外源添加的操作特點限制了其在生產(chǎn)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。光源，尤其是可見光，基于其廉價，低毒性、易操作、可調(diào)控等特點，成為一種新的誘導(dǎo)方法［21］。我們根據(jù)一種已公布的新型的大腸埃希氏菌光控誘導(dǎo)系統(tǒng)，構(gòu)建一株通過可見光誘導(dǎo)，可異源表達從分枝桿菌中分離的多菌靈水解酶基因（mheI）的工程菌，從而有效生產(chǎn)多菌靈水解酶。實驗結(jié)果表明此方法生產(chǎn)出的多菌靈水解酶具有生物活性，可降解溶液以及土壤中的多菌靈農(nóng)藥殘留，對于土壤的修復(fù)具有一定的意義。該光控基因表達系統(tǒng)通過光抑制進行誘導(dǎo)表達，不僅操作簡便，還可進行精確的調(diào)控，可望成為一個具有較好應(yīng)用前景的新型的酶產(chǎn)品的生產(chǎn)模式。我們采用的這個光控系統(tǒng)只需一個單組件（LEV1融合光敏蛋白），便可在可見光條件下進行誘導(dǎo)，與其他之前報道的同類光控系統(tǒng)相比（PhyB-PIF3系統(tǒng)由兩個融合蛋白組成且只能在遠紅外線下誘導(dǎo)［27］，EnvZ/OmpR/Cph1系統(tǒng)有兩個組件且誘導(dǎo)表達不可逆［28］），可實現(xiàn)更簡便、快捷、精確和可逆的誘導(dǎo)表達。

目前常用的土壤修復(fù)方法分為微生物修復(fù)（Microbial bioremediation）和酶生物修復(fù)（Enzymatic bioremediation）［6，29-31］。相對于微生物修復(fù)，酶生物修復(fù)具有更強的底物親和性和更高的特異性，同時，酶在天然土壤中可自然降解［32］。土壤中有機磷等農(nóng)殘已廣泛采用酶生物修復(fù)的方法去除［22-23，33］，而多菌靈殘留還大多局限于天然微生物修復(fù)。因此，開發(fā)適合的生物酶用于多菌靈的去除以及土壤修復(fù)具有廣泛的現(xiàn)實意義?；蚬こ讨?，利用重組大腸埃希氏菌生產(chǎn)酶產(chǎn)品已是通用的技術(shù)手段［22-24，30，33-35］，但利用光源作為誘導(dǎo)劑的報道還鮮有見聞。我們第一次提出了此類操作在去除多菌靈農(nóng)殘上的應(yīng)用，其優(yōu)勢不僅在于工業(yè)生產(chǎn)成本的降低，操作程序的簡化，還在于其可逆和可調(diào)控性。我們的工程菌平時在光照條件下不啟動，在需要時通過光抑制方法誘導(dǎo)生成水解酶，并適時引入光照停止合成，可有效延長工程菌的傳代壽命。

眾多可降解多菌靈農(nóng)藥的微生物，如分歧桿菌屬和諾卡氏菌等，均具備先將多菌靈分解為二級代謝產(chǎn)物，再將其作為碳源使用的特性［6-10］，本次重組的大腸埃希氏菌仍需開發(fā)相應(yīng)的功能，以提高該系統(tǒng)的實用性。此外，重組大腸埃希氏菌雖可誘導(dǎo)生產(chǎn)水解酶，卻無法直接分泌到胞外。近年來，已有通過添加信號肽（如Tat pathway）獲得胞外分泌水解酶的工程菌的報道，或以革蘭氏陽性菌，如枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）為宿主，利用其自身含有的胞外表達系統(tǒng)分泌水解酶［22-23，36］。這些方法已成為構(gòu)建“活菌降解器”（Biocatalysts）的主要途徑［22，36］。活菌降解器同時具備微生物修復(fù)的便捷，和酶生物修復(fù)的高活性和底物專一性，成為未來土壤農(nóng)殘降解的新趨勢。下一步我們將嘗試利用上述方法獲得既可光控誘導(dǎo)又可胞外分泌水解酶的大腸埃希氏“活菌降解器”，可望成為新型的土壤降解多菌靈的生物工具。

4 結(jié)論

本研究首次提出將大腸埃希氏菌光控基因表達系統(tǒng)用于生物降解土壤中的多菌靈農(nóng)殘。研究結(jié)果表明改建的光控系統(tǒng)可表達出有生物活性的多菌靈水解酶，在水溶液和土壤樣品中可有效水解多菌靈底物。此光控系統(tǒng)僅由可見光調(diào)控，具有穩(wěn)定、快速、可逆、無毒害、無后續(xù)分離等優(yōu)勢，可成為生物降解農(nóng)殘的新應(yīng)用趨勢。