土拉弗朗西斯氏菌LAMP快速檢測方法的應用

李子微 鄧仲良

（南華大學公共衛(wèi)生學院，衡陽 417000）

土拉弗朗西斯氏菌（Francisella tularensis）是一種革蘭氏陰性菌，可引起急性、感染性人畜共患疾?。?-2］。野兔和鼠類為主要傳染源，蜱蟲為主要傳播媒介。土拉弗朗西斯氏菌有4個亞種［3］，其中A型土拉熱亞種毒力最強［4］，在缺乏抗生素治療的情況下，感染10個細菌可引發(fā)急性的、甚至致命的病癥［5］，臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、黃瘟等，嚴重者死亡。其傳播途徑多樣，易擴散、毒性強、病死率高，被美國預防與疾控控制中心列為A類生物恐怖制劑［6］。40年前，在我國新疆、黑龍江和內蒙古曾有“野兔熱”的報道［7］。

土拉弗朗西斯氏菌生長十分緩慢且可經(jīng)氣溶膠傳播，采用細菌培養(yǎng)的方法檢測診斷難度較大，同時，土拉弗朗西斯氏菌易與變形桿菌、鼠疫耶爾森氏菌菌產(chǎn)生血清學交叉反應。目前，土拉弗朗西斯氏菌病早期的核酸快速檢測方法有普通PCR、Realtime PCR等，需借助大型儀器，且不適合現(xiàn)場實時檢測和基層的推廣。近年來尋求對土拉弗朗西斯氏菌進行快速、準確、操作簡便的檢測技術一直是相關研究的熱點。2000年，Notomi等［8］發(fā)明了一種新型的核酸等溫擴增技術-環(huán)介導等溫擴增技術（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP），利用具有鏈置換活性的BstDNA 聚合酶（Bst DNA polymerase）提供反應的動力，在65℃條件下反應15-60 min，能將目標片段可以擴增到1010倍左右，反應結果可通過反應副產(chǎn)物焦磷酸鎂白色沉淀的混濁度來判定［9-11］。該方法規(guī)避了常規(guī)PCR反應的變性、退火、延伸等一系列復雜的過程，大大節(jié)省了反應時間和成本，且同時具有高特異性、高靈敏度、高效簡便的特點，為臨床和現(xiàn)場一線的快速檢測提供可能。自開發(fā)以來，LAMP技術已被應用于對細菌、病毒、寄生蟲的檢測和動物胚胎性別鑒定等領域［12］。

目前，國內外尚未見LAMP方法檢測土拉弗朗西斯氏菌的報道，本研究根據(jù)土拉弗朗西斯氏菌FopA基因片段設計LAMP引物［13］，對土拉弗朗西斯氏菌進行檢測，優(yōu)化反應條件，驗證特異性和靈敏度，并應用于土壤模擬樣品的直接檢測，建立針對土拉弗朗西斯氏菌的LAMP快速檢測方法。本研究對于防止野兔熱的暴發(fā)流行，防范公共安全事件均具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 土拉弗朗西斯氏菌、布魯氏菌、鼠疫耶爾森氏菌和蜱DNA由中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院微生物流行病研究所提供；副溶血性弧菌、大腸桿菌（Escherichia coli）O157型、單增李斯特氏菌、沙門氏桿菌、金黃色葡萄球菌、聚合擬桿菌、脆弱擬桿菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌由北京熱景生物技術股份有限公司提供。

1.1.2 主要試劑與儀器 BstDNA聚合酶大片段（New England Biolabs）；細菌純培養(yǎng)物DNA提取試劑盒（北京開景基因技術有限公司）；betaine（Sigmaaldrich）；D30核酸蛋白測定儀（艾本德中國有限公司）；XMTD-6000電熱恒溫水浴鍋（北京市長風儀器儀表公司）；DYY-8C型電泳儀（北京市六一儀器廠）；質粒提取試劑盒（天根生化科技有限公司，北京）。

1.2 方法

1.2.1 引物的設計與合成 根據(jù)土拉弗朗西斯氏 菌FopA基 因 序 列（GenBank accession no.：HM371345.1），利用軟件PrimerExplorer V5（日本榮研化學株式會社）設計特異的LAMP引物，引物由北京梓熙生物科技有限公司合成，序列如表1所示。

表1 擴增土拉弗朗西斯氏菌FopA基因的LAMP引物序列

1.2.2 DNA模板的制備

1.2.2.1 試劑盒法 按照試劑盒說明書提取細菌純培養(yǎng)物DNA。

1.2.2.2 煮沸法 吸取細菌培養(yǎng)液1 mL，沸水浴中煮沸10 min，10 000×g離心3 min，上清液作為擴增模板。

1.2.3 LAMP反應體系的配制 10×Thermopol buffer（1 μL），1.8 mmol MgSO4，0.24 mmol dNTPs Mix，10 mmol Betaine，1 pmol F3，1 pmol B3，6 pmol FIP，6 pmol BIP，4 pmol LB，128 U/mL Bst DNA Polymerase，H2O補足至10 μL，模板（2 μL），混勻；同時，采用滅菌水為模板（2 μL）作為陰性對照，混勻。迅速置于65℃恒溫水浴鍋，反應60 min，80℃滅活5 min，終止反應。肉眼觀察反應體系的濁度，產(chǎn)物于2%的瓊脂糖凝膠進行電泳分析。

1.2.4 LAMP反應體系和反應條件的優(yōu)化 （1）反應溫度：分別于59℃、61℃、63℃、65℃、67℃、68℃反應60 min，確定最佳反應溫度。（2）外內引物對比例：選擇外引物與內引物比例依次為1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10進行擴增，確定最佳比例關系。（3）Mg2+濃度：選擇Mg2+濃度依次為2、2.5、3、3.5和4 mmol/L進行擴增，確定Mg2+的最佳濃度。（4）甜菜堿濃度：選擇甜菜堿濃度依次為8、9、10、11、12、13、14和15 mmol/L進行擴增，確定甜菜堿的最佳濃度。（5）dNTPs濃度：選擇dNTPs濃度依次為4、6、10、14、16和18 mmol/L進行擴增，確定dNTPs的最佳濃度。

1.2.5 特異性實驗 采用建立的LAMP方法分別對土拉弗朗西斯氏菌、布魯氏菌、鼠疫耶爾森氏菌、副溶血性弧菌、O157型大腸桿菌、單增李斯特氏菌、沙門氏桿菌、金黃色葡萄球菌、聚合擬桿菌、脆弱擬桿菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌和蜱的DNA進行擴增，電泳觀察擴增結果，驗證方法的特異性。

1.2.6 靈敏度實驗

1.2.6.1 細菌純培養(yǎng)物檢測靈敏度 提取過夜培養(yǎng)的土拉弗朗西斯氏菌菌液DNA，10倍倍比稀釋至4.9×10-4.9×108pg/mL，分別取2 μL作為反應模板，進行LAMP擴增。

1.2.6.2 克隆質粒檢測靈敏度 提取土拉弗朗西斯氏菌克隆株質粒DNA，10倍倍比稀釋至1×10-1×109copies/μL，分別取2 μL作為反應模板，進行LAMP擴增，同時與普通PCR方法進行比較分析。

1.2.7 污染土壤模擬樣品實驗 采用10倍倍比稀釋的土拉弗朗西斯氏菌克隆菌株懸液污染土壤，4℃過夜后，經(jīng)煮沸法提取DNA，通過熒光定量PCR和LAMP對比檢測，比較分析該方法的準確率和實際應用價值。

2 結果

2.1 LAMP反應條件的優(yōu)化

從圖1可以看出，在擴增溫度為65℃（圖1-A）、外引物與內引物比例為1∶6（圖1-B）、Mg2+濃度為2.5 mmol/L（圖1-C）、甜菜堿濃度為9-10 mmol/L（圖1-D）、dNTPs濃度為10 mmol/L（圖 1-E）時，土拉弗朗西斯氏菌DNA的擴增效果較好，由此確定反應體系。

A：反應溫度優(yōu)化結果：M：100 bp marker；1：59℃；2：61℃；3：63℃；4：65℃；5：67℃；6：69℃；7：陰性對照。B：外內引物對比例優(yōu)化結果：M：100 bp marker；1∶1∶2；2∶1∶4；3∶1∶6；4∶1∶8；5∶1∶10；6：陰性對照。C：Mg2+濃度優(yōu)化結果：M：100 bp marker；1：2 mmol/L；2：2.5 mmol/L；3：3 mmol/L；4：3.5 mmol/L；5：4 mmol/L；6：陰性對照。D：甜菜堿濃度優(yōu)化：M：100 bp marker；1：8 mmol/L；2：9 mmol/L；3：10 mmol/L；4：11 mmol/L；5：12 mmol/L；6：13 mmol/L；7：14 mmol/L；8：15 mmol/L；9：陰性對照。E：dNTPs濃度優(yōu)化結果 M：100 bp marker；1：4 mmol/L；2：6 mmol/L；3：10 mmol/L；4：14 mmol/L；5：16 mmol/L；6：18 mmol/L；7：陰性對照

2.2 特異性試驗

特異性實驗結果（圖2）顯示，僅土拉弗朗西斯氏菌純培養(yǎng)物DNA出現(xiàn)了LAMP反應特有的階梯狀條帶，其他11株非土拉弗朗西斯氏菌DNA和蜱的DNA均未出現(xiàn)階梯狀條帶。

2.3 靈敏度實驗

根據(jù)土拉弗朗西斯氏菌的行業(yè)標準，對土拉弗朗西斯氏菌純培養(yǎng)物、土拉弗朗西斯氏菌克隆質粒進行LAMP靈敏度檢測，同時對土拉弗朗西斯氏菌克隆質粒進行PCR靈敏度檢測，由圖3可知，LAMP檢測土拉弗朗西斯氏菌純培養(yǎng)物靈敏度為4.9×102pg/mL（圖3-A）；LAMP檢測土拉弗朗西斯氏菌克隆質?？蛇_到8 copies/μL（圖3-B），高于PCR檢測靈敏度103copies/μL（圖3-C）。

圖2 LAMP特異性實驗結果

圖3 LAMP靈敏度實驗結果

2.4 土壤模擬樣品檢測

圖4顯示，對土壤模擬樣本LAMP檢測結果與預期完全一致，且與行業(yè)標準認可的熒光定量PCR方法的檢測結果相吻合，無假陽性或假陰性結果出現(xiàn)，說明該方法具有良好的特異性和實用價值。

圖4 24份不同稀釋度土壤模擬樣本電泳圖

3 討論

土拉菌致病性強，致死率高，長期以來一直被視為危險的生物武器，與鼠疫、炭疽等被列為A類生物恐怖戰(zhàn)劑，其嚴重的危害性引起了人們的高度關注，已成為反恐和世界衛(wèi)生安全的重要問題之一。

FopA蛋白是的土拉弗朗西斯氏菌外膜蛋白之一，特異性強、保守性好，并具有良好的抗原性?；颊咴诨謴推?，血清中仍然存在抗FopA抗體，由土拉弗朗西斯氏菌FopA基因編碼，其高度保守性使其適用于土拉弗朗西斯氏菌的核酸診斷。因此，本研究選擇土拉弗朗西斯氏菌FopA基因為靶基因建立LAMP檢測方法。本研究針對土拉弗朗西斯氏菌FopA基因設計一套LAMP引物進行核酸擴增，通過電泳分析法優(yōu)化反應條件，并驗證其特異性、靈敏度，建立了簡便、靈敏、快速，可特異性檢測土拉弗朗西斯氏菌的方法。在研究過程中，采用優(yōu)化后的LAMP方法和熒光定量PCR技術分別土拉弗朗西斯氏菌的基因組DNA進行核酸擴增，結果顯示明顯的陽性擴增；而對鼠疫耶爾森氏菌、布魯氏菌、大腸桿菌等11種標準菌株的基因組DNA和蜱蟲DNA進行核酸擴增，均未出現(xiàn)非特異性擴增。靈敏度測試采用了土拉弗朗西斯氏菌基因組DNA和克隆株質粒進行同時確定，從土拉弗朗西斯氏菌活菌中提取的土拉弗朗西斯氏菌基因組DNA保證了靈敏度實驗的可靠性，為了避免活菌細胞裂解不完全，影響靈敏度檢測結果，采用構建質粒的方式進一步精確計算靈敏度。LAMP檢測土拉弗朗西斯氏菌克隆質粒的靈敏度為10 copies/μL，達到文獻報道的應用TaqMan熒光定量PCR檢測土拉弗朗西斯氏菌［14］的靈敏度。此外，LAMP檢測土拉弗朗西斯氏菌的基因組DNA靈敏度為490 pg/mL。土壤資源是生態(tài)基礎中非常重要的部分，也是各種生物生存發(fā)展的基礎；土壤環(huán)境中存在成千上萬種微生物，環(huán)境復雜，土拉弗朗西斯氏菌的檢測易受土壤環(huán)境中其他微生物和其他物質的干擾。優(yōu)化后的LAMP技術可直接對土壤中的土拉弗朗西斯氏菌進行檢測，且檢出限達44 CFU/g，低于TaqMan探針實時熒光定量PCR快速檢測土壤樣本中土拉弗朗西斯氏菌［14］的檢出限440 CFU/g，驗證了LAMP技術檢測土拉弗朗西斯氏菌的實用價值。

LAMP技術檢測土拉弗朗西斯氏菌不僅僅有特異性強、靈敏度高的特點，與傳統(tǒng)方法相比，還大大減少了檢測周期，擴增反應在15-60 min即可判斷結果，環(huán)引物的加入進一步提高了反應速度，縮短了檢測時間；反應在恒溫條件下進行，對實驗設備無特殊要求，僅需要恒溫加熱裝置即可。此外，由于LAMP獨特的核酸擴增機制，其產(chǎn)物是由多重復靶序列的莖-環(huán)結構狀DNA和花椰菜狀DNA所組成的混合物，在瓊脂糖凝膠電泳上呈現(xiàn)特有的的階梯狀條帶，結果易判斷；LAMP技術的擴增效率極高，在反應過程中，合成大量核酸，從dNTPs析出焦磷酸根離子，與反應體系中添加的鎂離子結合，產(chǎn)生副產(chǎn)物焦磷酸鎂白色沉淀，也可直接肉眼觀察或通過濁度計檢測，這是判斷目的基因是否存在最直接的參照方式。

綜上所述，此次研究建立的針對土拉弗朗西斯氏菌的LAMP檢測技術具有特異性強、靈敏度高、簡便高效等特點，為土拉弗朗西斯氏菌的快速檢測提供了新的發(fā)展方向，有望成為常規(guī)的快速檢測手段，可滿足基層實驗室、應急檢測和現(xiàn)場檢測等方面的使用需求，具有良好的應用價值和發(fā)展前景。但由于LAMP檢測技術建立的時間不長，依然存在有不足之處：檢測結果只有陽性與陰性兩種，只能定性不能定量，一旦產(chǎn)生非特異性擴增，不易鑒別；設計土拉弗朗西斯氏菌的LAMP引物時，采用了5條引物，且在恒溫條件下進行擴增，引物之間可能形成互補而擴增出非特異性的條帶，造成假陽性；LAMP擴增效率極高，過于靈敏和產(chǎn)物量大，實驗室一旦遭到擴增產(chǎn)物氣溶膠污染，易出現(xiàn)假陽性。為了減少污染，確保檢測結果的可信度，在實驗過程中，將試劑配制操作、陽性樣本加樣操作、水浴鍋反應操作分別在不同的封閉實驗室進行；將反應混合物加入反應管后，用封口膜封閉管口，防止擴增產(chǎn)物污染實驗室氣體環(huán)境；試劑和引物進行小瓶分裝使用，并于低溫條件下密封保存。這些措施均充分保證了檢測結果的可靠性。

4 結論

針對土拉弗朗西斯氏菌FopA基因設計引物并建立環(huán)介導等溫擴增技術，并應用于土壤模擬樣本的檢測，結果表現(xiàn)出特異性強、靈敏度高、速度快且設備要求簡單等特點。