基于高分辨質譜的非靶向代謝組學在食品造假鑒定中的研究進展

賴博文 劉玢 梁永康

（南昌市食品藥品檢驗所，南昌 330038）

隨著人們生活水平日益提高，當下食品消費不僅滿足人們的營養(yǎng)和能量供給，多樣化的食品選擇還能有效提升生活幸福感。高附加值食品如有機食品、認可度高的品牌、有產地保護標簽的食品意味著能賣出更高的價格［1］。同類食品價格懸殊較大，這也讓造假者有機可乘，掛羊頭賣狗肉，以次充好，冒充原產地食品的報道屢見不鮮，馬肉冒充牛肉、葉綠素銅摻假大豆油冒充橄欖油，再到近期麥盧卡蜂蜜，摻假和貼牌“原產地”的食品充斥著市場，同時食品造假也存著過敏源的隱患，讓消費者利益受到損害。這些食品造假屬于以經濟利益為驅動的食品欺詐，是目前影響及破壞食品安全秩序的重要因素之一［2］。

目前針對這類食品造假的甄別，已開發(fā)了很多方法，如DNA鑒定、蛋白鑒定、元素鑒定、同位素質譜及拉曼光譜等，而這些鑒別方法主要針對已知造假方式的某些靶標化合物進行檢測，或者只對原料的物種進行鑒定，難以有效鑒別當今原料的稀釋、替代等多種造假方式，如造假者可以就食品中的特征標志物進行合成額外添加以應對單一化合物鑒別從而達到牟取暴力的目的，或者在原料中摻入相似原料以達到造假目的，諸如此類，造假方式的多樣化，為食品造假鑒定帶來了巨大的挑戰(zhàn)。相比較其他農殘獸殘等有害物的靶向篩查，食品造假檢測需要對未知的造假模式進行監(jiān)督和預防，近年來，隨著高分辨質譜技術的成熟和普及，在食品中也相應開發(fā)了非靶向代謝組學的鑒定手段，本文就近幾年基于高分辨質譜（High resolution mass spectrometry，HRMS）的非靶向代謝組學（Non-targeted metabolomics，NTM）在食品造假鑒定中的研究進展進行了綜述，旨在對食品檢測中代謝組學的最新研究進展進行總結和歸納。

1 食品造假鑒定的范疇

食品造假自古以來就存在，并且在全球范圍里廣泛存在，隨著各國食品安全立法對食品造假行為的逐步打擊，食品造假事件有所減少，但隨著科學技術和化學工業(yè)的更新變化，食品造假的形式和內容趨于越來越復雜，造假手段的隱蔽性、可變性的不可預知性均給食品造假鑒定帶來了很大的困難。造假者在施行造假行為時，其造假方式他人很難了解或者掌握，如我國2008年三聚氰胺奶粉事故是由于發(fā)現很多嬰幼兒消費者患上腎結石，隨后才發(fā)現奶制品中含有三聚氰胺［3］。而造假者對現有法律法規(guī)尚未涉及或者無法涉及的漏洞或者盲點進行造假，這種有針對性的造假手段給食品安全監(jiān)管也帶來很大的困難。

目前食品造假主要包括兩個類型［4-5］：一是摻假或替換，即食品中摻入一些造假成分，以次充好和以假亂真，以劣質原料、產品成分代替高品質原料或產品成分，如在牛奶中摻入三聚氰胺、羊肉中添加鴨肉成分、陳茶葉充新茶葉、變質腐敗的牛奶混入鮮奶、蜂蜜中加水等，是最常見的造假方式；二是信息的虛報或欺騙，廠商隱瞞食品原料或產品中的某種質量缺陷，或者為提高產品質量，添加未知的或未申報過的成分，包括虛報食品、食品成分、食品包裝，或對某產品進行欺騙或誤導性的描述，這類造假類型在保健食品中尤為嚴重［6］。據以往統計，水產品食品造假案例最多，占比20.6%；其次是肉制品（13.4%）、水果和蔬菜（10.4%）［5］。

2 高分辨質譜在代謝組學中的應用

高分辨質譜屬于代謝組學中的一種較為新型的技術手段，代謝組學是由英國倫敦大學帝國學院的Nicholson［7］教授于1999年首先提出來的概念，是繼基因組學、轉錄組學和蛋白質組學之后新興發(fā)展起來的一門學科，相比較基因組學、轉錄組學和蛋白質組學分別從基因、基因調控和蛋白質層面探尋生命活動，代謝組學可以直接檢測某一時刻生物體內的代謝產物，能實時直接反映該生物體所處狀態(tài)，對代謝產物進行定性定量分析，分析研究的對象是相對分子量在1 kD以內的小分子代謝產物。代謝組學研究又可以分為靶向代謝組學和非靶向代謝組學，靶向代謝組學主要是測定某個或幾個或一類已知目標化合物，非靶向代謝組學主要包括測定限定條件下的特定生物樣品中所有代謝組分，后者主要原則是盡可能多地定性和相對定量生物體內代謝物，最大程度反映總的代謝物信息。目前常應用于代謝組學化學計量分析儀器主要有色譜質譜聯用和核磁共振（Nuclear magnetic resonance，NMR）兩種，其中核磁共振樣品前處理簡單，不會破壞樣品結構和性質，可進行實時檢測，但靈敏度較差，且多種內源性代謝物譜峰容易重疊，影響了對代謝物的定性定量分析，目前還是以色譜質譜聯用技術為代謝組學主要技術手段。

受前處理方法和儀器設備的限制，我國現有的食品檢測標準基本上都是基于靶向代謝組學技術的應用，針對已知的目標物質進行定量檢測的方法，已經在食品中農獸藥殘留檢測、食品中非法添加檢測等領域中取得很好的效果。但靶向代謝組學在食品造假鑒定時，由于不法分子會對目標物質進行有針對性的添加，常規(guī)的靶向代謝組學檢測方法不足以有效抑制食品造假。近年來，隨著樣品前處理技術的優(yōu)化以及高分辨質譜結合數據處理模型的優(yōu)化，基于高分辨質譜的非靶向代謝組學已經開始在食品造假檢測中被普遍認可和廣泛應用。相比較傳統低分辨質譜，高分辨質譜能達到小數點后4位（m/z），分辨率能達10 000以上，通過精確分子量結合軟件，可以推導出化合物元素組成，高分辨質譜在對于未知化合物定性上有著絕對的優(yōu)勢。

高分辨質譜主要有飛行時間質譜（Time-of-flight MS，TOF-MS）、傅立葉變換離子回旋共振質譜（Fourier transform ion cyclotron resonance MS，FTICRMS）、磁質譜（Sector-MS），以及近年出現的靜電場軌道阱質譜（Orbitrap-MS）。其中Sector-MS運行速度慢，FTICR-MS雖然具有高分辨率、高準確度和高靈敏度的特點，但是體積龐大、價格昂貴且操作復雜，目前這兩種高分辨質譜在食品檢測領域中并不常用。TOF-MS具有極快的掃描速度和較高的靈敏度，分辨率可達到15 000以上，質量準確度可達5 ppm級，能夠獲得樣品的全掃描質譜圖和精確質量數，可以通過精確質量數對化合物進行定性分析，目前廣泛應用于食品中未知物的篩查［8］。TOF-MS包括氣相色譜飛行時間質譜（Gas chromatograph time-of-flight MS，GC-TOF-MS）、液相色譜飛行時間質譜（Liquid chromatography time-of-flight MS，GC-TOF-MS）、 液相色譜四極桿飛行時間質譜（Liquid chromatography quadrupole-time-of-flight MS，LC-qTOF-MS）、 全 二維氣相色譜-飛行時間質譜（Two dimensional gas chromatograph time-of-flight MS，GC×GC-TOF-MS）。Orbitrap-MS是于2000年開發(fā)的新型質譜，采用了靜電場軌道阱作為離子的旋轉振蕩，使離子圍繞中心電極的軌道旋轉從而捕獲離子的裝置，是一種結合靜電場離子阱和快速傅里葉變換技術的新型質譜［9］，由于其簡化了FTICR-MS的運轉過程，較大的降低使用成本，迅速得到了商品化的應用。Orbitrap-MS分辨率可達100 000，質量準確度能達到2-5 ppm，相比較TOF-MS，Orbitrap-MS對食品復雜基質樣品更能節(jié)省樣品前處理和方法優(yōu)化的時間，而TOF-MS主要體現在掃描速度的優(yōu)勢上。

3 非靶向高分辨質譜的食品造假鑒定流程

針對已知的造假靶標化合物，不法分子摻入量往往較大較易識別，而對于原料品種、原料或者產地的造假，由于食品基質復雜多樣，各種代謝物濃度范圍相差較大對后續(xù)分析帶來不便；另一方面HRMS一次產生大量代謝物數據，目前利用UPLC-qTOF-MS運行一次可以實現幾千種化合物的分離。非靶向代謝組學意味著代謝組學的“大數據時代”來臨，而海量代謝物的定性定量都給非靶向代謝組學在食品造假的鑒定帶來前所未有的挑戰(zhàn)。

目前對于食品造假的HRMS研究，不僅包括以往常規(guī)的樣品制備、樣品前處理優(yōu)化，還更側重于后期的數據分析。針對HRMS產生的大數據，各大質譜公司已經開發(fā)了相應的數據處理軟件， 如 Waters公 司 的 MarkerLynx、Agilent公 司的 MassHunter、Thermo Scientific公 司 的 Sieve， 這些軟件能自動對峰圖進行峰降噪、峰過濾、峰識別和峰匹配，篩選出來的生物標志物還可以通過XCMS［10］、ChemSpider（http ：//www.chemspider.com）、PubChem［11］、SciFinder（https：//scifinder.cas.org）和METLIN［12］等軟件進行在線匹配預測化合物。最后對篩選出來的生物標志物的標準品進行驗證并驗證生物標志物在造假鑒定中的有效性，圖1概括了基于HRMS的非靶向代謝組學在食品造假鑒定中的工作流程。

圖1 基于HRMS的非靶向代謝組學在食品造假鑒定中的工作流程

目前對非靶向高分辨質譜產生的大數據進行生物標志物篩查主要有基于非監(jiān)督方法（Unsupervised method）和有監(jiān)督方法（Supervised method）兩種模式。其中非監(jiān)督方法的模式主要有主成分分析（Principal components analysis，PCA）、 非 線 性 映射（Nonlinear mapping，NLM）和聚類分析（Cluster analysis，CA）。而PCA是應用最廣泛的非監(jiān)督模式，非監(jiān)督方法的模式主要用于完全未知樣品的原始數據處理，可以對原始數據的樣本特性進行有效降維和聚類，最終將具有相似特征的目標化合物篩選出來。Vaclavik等［13］利用PCA方法對摻假15%蘋果汁或者葡萄汁的橙汁的數據進行聚類而將摻假果汁識別出來，PCA方法還能對有機農產品進行監(jiān)管，Tengstrand等［14］利用UPLC-qTOF-MS的非靶向代謝組學利用PCA方法進行聚類，可以對未知污染物進行有效監(jiān)督，從而達到對有機農產品質量的監(jiān)管。而有監(jiān)督方法的模式主要有線性判別分析（Linear discriminant analysis，LDA）、偏最小二乘法-判 別 分 析（Partial least squares discriminant，PLSDA）和正交信號校正技術偏最小二乘法-判別分析（Orthogonal signal correction-Partial least squares discriminant，OPLS-DA）等。有監(jiān)督方法主要是對已知樣品類型進行數據處理，根據樣品進行分型建立數據模型，并從中對未知樣品進行辨識、歸類和預測，以此來判定未知樣品類型，可以有效地應用在可疑樣品和已知實物樣品間的篩查中。在食品造假數據處理中，有監(jiān)督方法往往和無監(jiān)督方法配合使用，如Hrbek等［15］利用PCA和LDA方法對有機乳制品進行確認；Cajka等［16］利用PCA和OPLSDA方法對雞肉摻假進行鑒定；Hurtado-Fernández［17］用PCA和PLS-DA方法對牛油果的成熟度進行聚類分析。以上數據分析模型可以根據具體研究樣品量和數據量來進行選擇。

4 高分辨質譜在食品造假鑒定中的應用

4.1 高分辨質譜在食品物種（品種）鑒別中的應用

食品的品質和相關特征主要取決于其食品原料農產品的遺傳背景和環(huán)境因素，不同品種有著不同的特征、品質和口味，利用氣相色譜、液相色譜，特別是超高效液相色譜（Ultra performance liquid chromatography，UPLC）和高分辨質譜聯用技術能有效地鑒別不同品種的代謝差異。Jandri?等［18-20］利用UPLC-qTOF-MS可以有效區(qū)分橙子、西柚、柑橘、鳳梨等不同水果果汁，還能對不同花源的蜂蜜進行區(qū)分；Moco等［21］利用LC-TOF-MS發(fā)現不同品種之間有8種柚皮素或柚皮素查爾酮衍生物具有含量差異；MacKenzie等［22］利用 GC-TOF-MS檢測不同酵母菌株發(fā)酵的代謝差異物；Dobson等［23］利用GCTOF-MS發(fā)現可以通過糖、氨基酸和一些微量脂類的差異而區(qū)分不同品種的馬鈴薯；Hrbek等［24］利用UPLC-TOF-MS和實時直接分析離子源耦合Orbitrap-MS（Direct analysis in real time ion source coupled Orbitrap-MS，DART-Orbitrap-MS）發(fā)現轉基因和非轉基因大豆之間磷脂酰膽堿和糖含量的代謝差異。

4.2 高分辨質譜在食品產地鑒定中的應用

除了食品原料的遺傳背景，原料生長的自然生態(tài)環(huán)境、種植方式等條件也對最終的食品特征、品質和口味有著很大的影響。傳統的原產地分析方法主要是測定其有機物、無機元素、穩(wěn)定同位素質譜等，再通過一系列的計量方法建立特征性成分與產地的聯系，而以上均需要大量的樣本，涉及檢測項目越多其產地鑒定越準，實際操作鑒定方法繁瑣，而利用高分辨質譜，可以簡化鑒定流程，并且可以輕松實現小樣本的鑒定。Mattarucchi和Cajka等［25-26］利用UPLC-qTOF-MS和GC-TOF-MS對Trappist啤酒真?zhèn)芜M行驗證；Jin等［27］利用LC-qTOF-MS對姜黃進行代謝物分析，可以根據姜黃素類化合物的含量高低對不同產地的姜黃進行聚類；Arbulu等［28］利用LC-qTOF-MS對Graciano葡萄酒進行鑒定發(fā)現，一些糖、氨基酸、高碳醇、生物胺、有機酸和酚類物質可以作為其特征代謝物。

4.3 高分辨質譜在食品品質鑒定中的應用

除了對食品原料品種和產地進行檢測，高分辨質譜還在食品的品質鑒定中發(fā)揮了重要作用，可以在食品的加工工藝質控和有機食品認證等環(huán)節(jié)進行有效監(jiān)管和檢測，可以有效地監(jiān)管食品造假行為。Capanoglu等［29］利用LC-TOF-MS發(fā)現加工后番茄與鮮番茄之間的營養(yǎng)差別；Ruiz-Aracama等利用UPLC-QTOF-MS在有機養(yǎng)殖和普通養(yǎng)殖的雞肉中發(fā)現N，N’-二阿魏酸丁二胺和異黃酮的含量差異［30］；Hrbek等［31］對不同產地的大蒜進行高分辨質譜分析，發(fā)現蒜氨酸、磷脂酰膽堿（16∶0/18∶2）、精氨酸、脫氫丙氨酸、磷脂酰乙醇胺（16∶0/22∶6）、L-γ-谷氨酰基-S-烯丙基-L-半胱氨酸和甘磷酸膽堿可作為大蒜的靶標化合物。

5 總結與展望

高分辨質譜應用于食品監(jiān)管領域有著分辨率高，掃描速度快等優(yōu)勢。高分辨質譜可以進行精確質量測定，同時獲得精確質量信息和碰撞破裂后的精確碎片離子質量信息，在對食品中可疑未知化合物定性有著無可比擬的優(yōu)勢。而目前高分辨質譜面臨的主要問題是，一方面 相較于低分辨質譜來說高分辨質譜價格昂貴，不能在各個食品監(jiān)管實驗室普及；另一方面，高分辨質譜其定量靈敏度不及傳統三重四級桿質譜。因此，在利用高分辨質譜進行食品摻假物的定性分析，最后還將依賴于傳統三重四級桿質譜來進行方法開發(fā)，以便于行業(yè)內應用推廣。

隨著高分辨質譜的廣泛應用，基于高分辨質譜的非靶向代謝組學將作為現有食品監(jiān)管檢測方法的一個有效補充方法，以此方法開發(fā)相應的檢測流程，并且有可能以此建立相應檢測標準。同時各國政府對食品安全和標識監(jiān)管的不斷完善，加上各國對食品造假行為的加大打擊，相信未來食品造假事件會有所減少。而隨著人們生活水平的提高，對食品的需求將越來越多元化，食品的營養(yǎng)需求會越來越細分，基于HRMS非靶向代謝組學不僅僅是應用在食品造假鑒定檢測中，還會應用在食品營養(yǎng)分析、個人營養(yǎng)需求定制等方向。相信在不久的將來，基于高分辨質譜的非靶向代謝組學在食品中運用將越來越廣泛。