布尼亞病毒基因重排機(jī)制研究進(jìn)展

石坤 林祥梅 呂繼洲 鄧俊花 吳紹強(qiáng)

（中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院動(dòng)物檢疫研究所，北京 100176）

近年來，發(fā)熱伴血小板減少綜合征（俗稱“蜱咬病”）、施馬倫貝格病等的新發(fā)引起人類對(duì)布尼亞病毒的廣泛關(guān)注。布尼亞病毒是一類傳染性強(qiáng)、致死率高的負(fù)鏈RNA病毒，許多布尼亞病毒可引起嚴(yán)重的人類疾病。如漢坦病毒科的漢坦病毒可引起嚴(yán)重的人畜共患病，世界衛(wèi)生組織已將其列為可通過氣溶膠傳播的生物武器［1］。該病原體于1978年在韓國漢坦河附近被分離到。1993年，美國的亞利桑那州、科羅拉多州、新墨西哥州和猶他州暴發(fā)的“死亡的峽谷”，病原即為漢坦病毒，死亡率高達(dá)50%［2］。在南美洲和中美洲流行的人畜共患病——奧羅普切熱的病原為周布尼亞病毒科的奧羅普切病毒（Oropouche virus，OROV）。在過去的60年中，巴西、秘魯、巴拿馬、特立尼達(dá)和多巴哥報(bào)道了30多起流行病和超過50萬例OROV感染的臨床病例。在巴西，奧羅普切熱被認(rèn)為是除登革熱以外第二種最常見的蟲媒病毒性發(fā)熱疾?。?］。1965年以來我國新疆巴楚地區(qū)爆發(fā)的出血熱疫情的病原為克里米亞-剛果出血熱病毒（Crimean-Congo hemorrhagic fever virus，CCHFV），此后該病在南疆地區(qū)一直流行，死亡率達(dá)30%［4］。2010年夏季，我國河南等地爆發(fā)的由蜱蟲叮咬引發(fā)的“蜱咬病”的病原為發(fā)熱伴血小板減少綜合癥病毒（Severe fever with thrombocytopenia syndrome virus，SFTSV），死亡率達(dá)12%-30%［5］。此外，裂谷熱病毒（Rift valley fever virus，RVFV）、布尼韋爾病毒（Bunyamwera virus，BUNV）、拉克羅斯病毒（La Crosse encephalitis virus、LACV）、巴泰病毒（Batai，BATV）及阿里病毒（Ngari，NRIV）則能夠在家畜、鳥類和人類中引發(fā)疾病。

1 布尼亞病毒的基因組結(jié)構(gòu)與功能

布尼亞病毒是目前已知最大的RNA病毒家族，已發(fā)現(xiàn)350多種病毒［6］。由于布尼亞病毒數(shù)目龐大，2016年召開的第10次國際病毒分類委員會(huì)（ICTV）會(huì)議上將布尼亞病毒科升級(jí)為布尼亞病毒目，由周布尼亞病毒科（Peribunyaviridae）、白細(xì)病毒科（Phenuiviridae）、漢坦病毒科（Hantaviridae）和內(nèi)羅病毒科（Nairoviridae）等9個(gè)科組成。絕大多數(shù)布尼亞病毒基因組均由3條單股負(fù)鏈RNA組成，分別為大（L）、中（M）、?。⊿）三段。它們都含有一個(gè)編碼區(qū)以及編碼區(qū)兩側(cè)的3' UTRs和5' UTRs。其中同一種屬內(nèi)的基因組RNA片段大小一致，L基因約為6.9 kb，M基因約為4.5 kb和S基因約為1.0 kb（圖1），其中S基因編碼N蛋白，M基因編碼糖蛋白前體，L基因編碼RNA 依賴的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp）。糖蛋白前體為多蛋白體，其中含有非結(jié)構(gòu)蛋白NSm。M基因的mRNA在宿主蛋白酶作用下翻譯產(chǎn)生3種蛋白質(zhì)，編碼順序是Gn-NSm-Gc。布尼亞病毒顆粒呈球形，直徑為80-140 nm，包括4種結(jié)構(gòu)蛋白：兩種表面糖蛋白，分別稱為Gn和Gc，主要介導(dǎo)病毒的入侵；兩種內(nèi)部蛋白質(zhì)，分別稱為N蛋白和L蛋白，其中N蛋白為核衣殼蛋白，它將布尼亞病毒的L、M和S三個(gè)RNA節(jié)段基因組包裹，并與RdRp形成核糖核蛋白復(fù)合物（Ribonucleoprotein complex，RNP），并被包裹在脂質(zhì)囊膜中，負(fù)責(zé)病毒轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。L蛋白質(zhì)為RdRp，在病毒轉(zhuǎn)錄和復(fù)制中起到重要的作用。

2 自然界中的布尼亞病毒重排

布尼亞病毒之所以種類繁多，是因?yàn)槠浠蚪M易發(fā)生變異的關(guān)系。布尼亞病毒基因組的分段性質(zhì)，增加了病毒成員之間基因重排的機(jī)率，這種現(xiàn)象在幾年前已經(jīng)被反復(fù)驗(yàn)證。最新的ICTV分類建議列出了48種漢坦病毒，除澳大利亞和南極洲以外的所有大洲均有分布［7］。在美國發(fā)現(xiàn)漢坦病毒肺綜合征及其病原體辛諾柏病毒（Sin nombre virus，SNV）后，很快就檢測(cè)到它的重組體。尤其是SNV中的NMR11和CC107這兩種親緣關(guān)系密切的毒株感染同一個(gè)嚙齒動(dòng)物時(shí)，基因重排的現(xiàn)象非常普遍［2］。Luis 等和Saeed等［8-9］用 SNV的毒株NMR11和 CC107混合感染Vero E6細(xì)胞時(shí)產(chǎn)生了294個(gè)子代噬斑，其中25個(gè)噬斑為重組體，重組率為8.5%。賈托巴病毒（Jatobal，JATV）是在1985年從巴西帕拉州的南美長鼻浣熊中分離出來的，JATV和OROV序列在核苷酸水平上的相似性為65.6%，其中S片段與OROV的秘魯基因型相似性高達(dá)95.9%-97.3%。這些結(jié)果表明，JATV很可能是含有OROV的S片段的重配體［9］。伊基托斯病毒（Iquitos，IQTV）于1999年首次從秘魯伊基托斯的一名發(fā)燒患者身上分離到。它也是OROV的重組體［10］。這種病毒擁有OROV的S和L片段。核酸序列分析表明，歐洲2011新發(fā)的SBV的M片段與薩蘇伯里病毒（Sathuperi virus，SATV）的日本株的序列相似性在81.8%-82.2%之間，與沙門達(dá)病毒（Shamonda virus，SHAV）的S片段相似性為 97%，L片段的相似性是94%，SBV可能是SATV與SHAV的基因重排產(chǎn)物［11］。AKAV的分離株之間的基因重排也非常頻繁，Kobayashi等［12］對(duì)日本、臺(tái)灣、澳大利亞和肯尼亞的赤羽病病毒（Akabane virus，AKAV）以及澳大利亞和日本發(fā)現(xiàn)的蒂納羅病毒（Tinaroo virus，TINV）進(jìn)行了測(cè)序和系統(tǒng)遺傳學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，TINV的S和L片段來自AKAV。此外，研究表明在自然界中，NRIV是BUNV和BATV產(chǎn)生的一個(gè)重組株，艾諾病毒（Aino virus，AINOV） 和 皮 通 病 毒 PEAV（Peaton virus，PEAV）之間也產(chǎn)生了一種重組株［13-14］。

3 布尼亞病毒的基因重排機(jī)理

3.1 布尼亞病毒的基因重排的分子機(jī)制

所有分節(jié)段的RNA病毒在共感染過程中都具有交換基因組片段的能力，具體而言，當(dāng)兩種或更多種病毒感染單個(gè)宿主細(xì)胞時(shí)，它們可將彼此的基因組片段包裝到新生病毒粒子中，從而產(chǎn)生雜交后代，流感病毒大流行中變異毒株的出現(xiàn)證實(shí)了上述觀點(diǎn)［15］。與所有負(fù)鏈RNA病毒一樣，布尼亞病毒依賴RNA聚合酶（RdRp）缺乏核酸校對(duì)功能，病毒復(fù)制而產(chǎn)生的基因組數(shù)量龐大，這有助于基因變異的產(chǎn)生。由于布尼亞病毒結(jié)構(gòu)的“分節(jié)段”性，使它們能夠更容易、更快速重組它們的基因組片段，當(dāng)兩種不同的病毒同時(shí)感染單個(gè)細(xì)胞，除了可以產(chǎn)生與親本病毒相同的后代外，基因重排還可產(chǎn)生6種潛在的重組病毒（圖2）［16］。然而，這種重排的發(fā)生也是有限制的，在Iroegbu和Pringle等［17］進(jìn)行的體外實(shí)驗(yàn)證明，基因重排只發(fā)生在關(guān)系密切的布尼亞病毒之間，且這些病毒的基因組片段相互兼容，才可能產(chǎn)生有效的重配株。對(duì)某些不相容的病毒基因組片段組合還有更多的限制。相關(guān)研究還顯示，現(xiàn)有的布尼亞病毒重組體傾向于L和S片段來自親本病毒，M片段來自供體病毒［17］。因?yàn)長和S片段編碼病毒復(fù)制必不可少的N蛋白以及病毒RNA聚合酶，而M片段編碼Gn和Gc蛋白，其可以和宿主細(xì)胞上的附著受體和進(jìn)入受體結(jié)合，在病毒傳播和媒介范圍選擇方面起到重要作用。因此，來自供體的M片段使重組子代病毒會(huì)含有新的遺傳信息，潛在地改變?cè)摬《緦?duì)組織和宿主的嗜性［18］。

3.2 蚊子體內(nèi)布尼亞病毒基因重排的發(fā)生機(jī)制

Chastel認(rèn)為，被蟲媒叮咬后無感染癥狀的宿主可能會(huì)成為“特洛伊木馬”，將流行的蟲媒病毒傳入非疫區(qū)［16］。脊椎動(dòng)物與作為病毒載體的節(jié)肢動(dòng)物蟲媒發(fā)生短時(shí)間密切接觸后可以充當(dāng)病毒的“生物容器”。當(dāng)蚊子同時(shí)感染兩種不同的布尼亞病毒時(shí)，就可能導(dǎo)致基因重排。因?yàn)橄x媒病毒能夠在嗜血節(jié)肢動(dòng)物和脊椎動(dòng)物中交替地復(fù)制，對(duì)脊椎動(dòng)物的細(xì)胞有溶解性的破壞，但對(duì)節(jié)肢動(dòng)物的細(xì)胞很少或沒有致病力。而且，節(jié)肢動(dòng)物宿主是不產(chǎn)生抗體的，更有利于病毒的感染和復(fù)制［19］。

以吸食血液為生的節(jié)肢動(dòng)物在其生命周期內(nèi)可能會(huì)吸食多次血液，這就增加了雙重病毒感染的機(jī)率，因此也會(huì)增加基因重排的機(jī)會(huì)。絕大多數(shù)重組病毒被預(yù)測(cè)是由蚊子而不是由蜱傳播而來的，這可能是由于雙翅類動(dòng)物的覓食方式?jīng)Q定，因?yàn)槲米涌梢栽诓煌募棺祫?dòng)物身上進(jìn)食，而這些脊椎動(dòng)物可能會(huì)感染不同的病毒，因而基因組片段的重排機(jī)率很高；而蜱的壽命雖然較長，但卻很少進(jìn)食，從而減少了雙重感染的機(jī)率［19］。布尼亞病毒在蚊子體內(nèi)進(jìn)行基因重排的前提是蚊子必須感染兩種不同的病毒，在自然界中存在以下幾種感染機(jī)制。一是口服感染，同一只蚊子吸入兩種感染不同病毒的宿主血液，在這個(gè)過程中，它可能會(huì)多次吸食血液，或者是吸食一個(gè)宿主的血液時(shí)被打斷，接著在另一個(gè)寄主身上吸血結(jié)束［20］。自然界中共感染的發(fā)生又受雙重感染抗性的限制，即在感染第一種病毒后一段時(shí)間內(nèi)，再次感染第二種病毒受到抑制。這種雙重感染阻力的現(xiàn)象在布尼亞病毒中同時(shí)存在，多發(fā)生在感染第一種病毒后的幾天內(nèi)并隨著時(shí)間的推移而加重，限制了基因重排的發(fā)生。第二種機(jī)制是經(jīng)卵感染，如果雌蚊本身攜帶病毒，它的子代也會(huì)攜帶與母體相同的病毒［21］。第三種機(jī)制是交配傳播病毒，如LACV或TAHV可與另一種加利福尼亞血清群的正布尼亞病毒發(fā)生雙重感染。原因可能是經(jīng)卵感染一種病毒的雄蚊對(duì)感染異種病毒的雌蚊進(jìn)行授精，導(dǎo)致雌蚊的雙重感染。由于經(jīng)卵感染的蚊子可能要比口服感染相同病毒的蚊子在中腸中的病毒滴度要低得多，所以使雙重感染阻力減小，經(jīng)卵感染一種布尼亞病毒的蚊子還能感染另一種布尼亞病毒［22-23］。

4 基因重排的潛在危害

基因重排可使現(xiàn)有的變異株基因庫進(jìn)行隨機(jī)重新分配，使病毒能夠適應(yīng)不斷變化的生態(tài)環(huán)境，并且還支持不同病毒之間的重排，這樣更容易產(chǎn)生新的遺傳性狀，從而改變子代病毒的毒性。尤其是基因型漂移和轉(zhuǎn)變會(huì)改變病毒的致病性，而且多表現(xiàn)為毒性增加。根據(jù)親代病毒和子代的特征，基因重排可產(chǎn)生病原性、媒介和宿主范圍擴(kuò)大的新型病毒。這給布尼亞病毒診斷、預(yù)防及控制帶來了更大的困難，增加了對(duì)公共衛(wèi)生的危害。據(jù)報(bào)道，在東非地區(qū)NRIV可導(dǎo)致人類嚴(yán)重的發(fā)熱性疾病。研究證據(jù)表明，NRIV是在BUNV和BATV同時(shí)感染同一宿主時(shí)，經(jīng)天然基因重組而產(chǎn)生的一種新病毒。因?yàn)镹RIV擁有BATV的M段，同時(shí)與BUNV的S和L段相結(jié)合［24］。BUNV引起人體輕微癥狀，如發(fā)熱、頭痛、關(guān)節(jié)痛和皮疹。兒童感染癥狀偏多，免疫功能低下的患者可能會(huì)發(fā)展為嚴(yán)重的腦炎。在家畜中，特別是反芻動(dòng)物中，感染后會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的癥狀如自然流產(chǎn)和致畸［25］。BATV引起人類輕度的流感樣疾病，但可使反芻動(dòng)物產(chǎn)生嚴(yán)重的疾病，其表現(xiàn)為流產(chǎn)、早產(chǎn)和致命性出血熱。NRIV致病力與母本病毒相比顯著增強(qiáng)，它能引起人的致命性出血熱，臨床表現(xiàn)與RVFV類似。在1998-1999年的肯尼亞和索馬里及2010年毛里塔尼亞都有爆發(fā)［26］。

2011年，在德國和荷蘭首次發(fā)現(xiàn)SBV，家畜感染這種病毒后會(huì)產(chǎn)下畸形甚至是死胎。從發(fā)現(xiàn)后的一年時(shí)間席卷整個(gè)歐洲；2012-2013年間，在歐洲的27個(gè)國家都有發(fā)現(xiàn)，涉及8 000多個(gè)農(nóng)場(chǎng)，嚴(yán)重威脅歐洲的畜牧業(yè)生產(chǎn)［27］。根據(jù)遺傳發(fā)育證據(jù)顯示，SBV與薩蘇伯里病毒、沙門達(dá)病毒在基因組序列上十分接近。SBV是這兩種病毒或突變的重組體。SATV和SHAV先后于1999年與2002年在日本發(fā)現(xiàn)，但兩種病毒感染動(dòng)物后無明顯癥狀。SBV的致病能力明顯高于SATV和SHAV，并能造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

5 展望

對(duì)于分節(jié)段基因組的病毒而言，基因重排和基因重組既是一種非常強(qiáng)大的進(jìn)化壓力，促使其獲得許多關(guān)鍵的適應(yīng)性突變，也是一種快速產(chǎn)生新病毒的方式，使其致病性增加、宿主范圍擴(kuò)大。因此，基因重排本質(zhì)上增大了布尼亞病毒對(duì)宿主的危害，從而對(duì)人類公共衛(wèi)生造成了更大的威脅。盡管現(xiàn)有的布尼亞病毒重排研究工作為病毒間的相互作用研究提供了大量有效信息，但是在變異方向、變異頻率等方面仍存在許多未解之謎。所以，監(jiān)測(cè)、研究病毒間、尤其是已知的可以感染哺乳動(dòng)物的布尼亞病毒間的基因重排和重組的發(fā)生仍是研究的重點(diǎn)。

由于很多布尼亞病毒可借助媒介在宿主動(dòng)物間傳播，要完全消滅這些病毒難度極大。基于傳統(tǒng)致弱減毒的疫苗也可能由于與自然界的野生型毒株發(fā)生遺傳交換而恢復(fù)或增加其致病性，目前也尚無可供使用的布尼亞病毒疫苗。因此，要對(duì)重要的布尼亞病毒進(jìn)行深入研究，進(jìn)一步探究病毒感染的遺傳決定因素、節(jié)肢動(dòng)物在布尼亞病毒傳播中的作用、傳播介質(zhì)阻斷病毒感染或傳播的機(jī)制以及驅(qū)動(dòng)布尼亞病毒基因重排的內(nèi)在機(jī)理，從而助推基因工程疫苗的開發(fā)及本病的免疫防控。