豬流行性腹瀉病毒ＨＢ２０１６０２株的分離鑒定及Ｓ１基因序列分析

劉威 袁芳艷 周丹娜 劉澤文 楊克禮 段正贏 郭銳 高婷 梁婉 田永祥

摘要：從湖北地區(qū)規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)疑似腹瀉病料中成功檢測(cè)并分離獲得了一株豬流行性腹瀉病毒，分離毒株感染Vero細(xì)胞可引起明顯的細(xì)胞病變，病毒效價(jià)達(dá)1.0×105.6 TCID50/0.1 mL。間接免疫熒光結(jié)果顯示HB201602感染細(xì)胞后，能被抗PEDV S蛋白的特異性單克隆抗體所識(shí)別，進(jìn)一步證實(shí)所分離毒株為PEDV病毒?；赟1基因構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，表明2011年后分離的毒株大多以G2型變異毒株為主，HB201602屬于G2-a亞型（變異毒株）簇。S1基因遺傳變異分析發(fā)現(xiàn)G1-b亞型毒株與其他簇毒株相比存在9個(gè)特異的氨基酸突變，G1-a亞型經(jīng)典毒株存在4個(gè)特異的氨基酸突變，S1基因的變異分析將有助于了解PEDV的遺傳變異趨勢(shì)，為新型疫苗的研發(fā)提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：豬流行性腹瀉;分離鑒定;序列分析;系統(tǒng)發(fā)育樹(shù);遺傳變異

中圖分類(lèi)號(hào)：S852.65+1 ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2019）24-0227-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.24.055 ? ? ? ? ? 開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Isolation and identification of HB201602 strain of porcine epidemic

diarrhea virus and phylogenetic tree analyses based on S1 gene

LIU Wei，YUAN Fang-yan，ZHOU Dan-na，LIU Ze-wen，YANG Ke-li，DUAN Zheng-ying，

GUO Rui，GAO Ting，LIANG Wan，TIAN Yong-xiang

（Institute of Animal Science and Veterinary Medicine，Hubei Academy of Agricultural Science/Hubei Science-observation Experiment Station of Veterinary Medicine and Diagnostic Technology （Ministry of Agriculture and Rural Affairs），Wuhan 430064，China）

Abstract： Porcine epidemic diarrhea virus （PEDV） HB201602 strain was isolated from the piglets suspected to be suffering a severe diarrhea in Hubei Province. The isolated strain can infect Vero cells and cause obvious cell pathological change， with viral titer up to 1.0×105.6 TCID50/0.1ml. Indirect immunofluorescence results indicated that HB201602 infected cells could be recognized by monoclonal antibodies against PEDV S protein， further confirming that the isolated strain was PEDV virus. Phylogenetic trees were constructed based on S1 gene， and the results indicated that most of the strains isolated after 2011 were G2 variant strains， and HB201602 belonged to G2-a subtype （variant strain） cluster. Genetic variation analysis of S1 gene shows that G1-b subtype strain has 9 specific single amino acid mutations compared with other cluster strains， and G1-a subtype classical strain has 4 specific amino acid mutations. Variation analysis of S1 gene will provide a basis for understanding the genetic variation trend of PEDV and the development of new vaccines.

Key words： porcine epidemic diarrhea virus; isolation; sequence analysis; phylogenetic tree; genetic variation

豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的一種高度接觸性腸道傳染病[1]，各年齡和品種的豬均易感，成年豬感染后臨床癥狀表現(xiàn)輕微，但對(duì)哺乳仔豬危害最為嚴(yán)重，感染仔豬臨床表現(xiàn)為腹瀉、嘔吐、脫水甚至死亡，發(fā)病率高達(dá)100%，死亡率為30%～80%[2]。

1971年，該病在英國(guó)首次報(bào)道，隨后在英國(guó)、德國(guó)、比利時(shí)、西班牙等地呈現(xiàn)流行態(tài)勢(shì)。近年來(lái)，PED在北美洲和亞洲出現(xiàn)暴發(fā)，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。2013年，美國(guó)暴發(fā)PED疫情，隨后迅速傳播至其他州以及毗鄰的加拿大和墨西哥。1976年，中國(guó)首次報(bào)道了PED的流行，近年來(lái)，流行性腹瀉疫情呈上升趨勢(shì)[3-5]。豬流行性腹瀉平均每年造成了美國(guó)和中國(guó)超過(guò)8百萬(wàn)頭仔豬的死亡，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[6-8]。

PEDV屬于尼多病毒目冠狀病毒科冠狀病毒屬的α冠狀病毒，是一種單股正鏈不分節(jié)段的RNA病毒。PEDV基因組大小約為28 kb，5端有一個(gè)帽子結(jié)構(gòu)（cap），3端有一個(gè)poly（A）尾，由7個(gè)ORFs組成，主要的結(jié)構(gòu)蛋白為纖突糖蛋白（S）、小囊膜蛋白（E）、膜蛋白（M）和核衣殼蛋白（N）[9，10]。S蛋白由S1（1-735 aa）和S2（736-1356 aa）兩部分組成，S1主要介導(dǎo)病毒與宿主細(xì)胞受體的結(jié)合，S2可通過(guò)誘導(dǎo)構(gòu)象改變促使病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞[11，12]。研究表明，PEDV S基因突變更能表現(xiàn)PEDV的變異情況，不同地區(qū)不同時(shí)間分離毒株的核酸差異主要集中在S基因，因此PEDV S基因常用于研究不同毒株之間的親緣關(guān)系、遺傳變異、流行特征以及毒力預(yù)測(cè)等[13，14]。

本研究從湖北省自發(fā)仔豬腹瀉疫病的豬群中采集糞便樣品，進(jìn)行了病毒的分離培養(yǎng)、通過(guò)RT-PCR核酸片段檢測(cè)以及間接免疫熒光（IFA）試驗(yàn)，證實(shí)所分離毒株為PEDV，同時(shí)測(cè)定了病毒的TCID50，并對(duì)其S1基因進(jìn)行了序列測(cè)定以及遺傳進(jìn)化分析，為下一步生物學(xué)特性及疫苗開(kāi)發(fā)等研究奠定了基礎(chǔ)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?病料來(lái)源 ?豬流行性腹瀉典型臨床病例采集自湖北省不同地區(qū)豬場(chǎng)，采樣豬場(chǎng)中出現(xiàn)仔豬嚴(yán)重腹瀉、嘔吐、脫水以及死亡等疑似病例，采集樣品為發(fā)病豬的糞便或小腸內(nèi)容物等。

1.1.2 ?工具酶及主要試劑 ?各種限制性?xún)?nèi)切酶（Restriction endonuclease，RE）、高保真酶PrimerSTARTM、dNTPs、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA Marker等工具酶購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司;雙抗（青霉素-鏈霉素）溶液、RPMI-1640培養(yǎng)基、Dulbeccos Modified Eagle Medium（DMEM）培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)GIBCOTM公司;DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司;膠回收試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;Vero傳代細(xì)胞系和抗PEDV S蛋白單克隆抗體（MAb）由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 ?方法

1.2.1 ?病毒的分離與培養(yǎng) ?糞便樣品經(jīng)PBS重懸離心后取上清液，提取上清液中RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒制備cDNA，并使用PEDV檢測(cè)引物（表1）對(duì)獲得的cDNA進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)為陽(yáng)性的上清液樣品通過(guò)0.45 μm濾器除菌后，接種于Vero傳代細(xì)胞系，于37 ℃的CO2培養(yǎng)箱（5%）中恒溫恒濕培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞病變（CPE）。收獲細(xì)胞病變明顯樣品，反復(fù)凍融3次后，繼續(xù)接種Vero傳代細(xì)胞系，連續(xù)體外傳代培養(yǎng)。

1.2.2 ?病毒的間接免疫熒光（IFA）鑒定 ?將HB201602

分離病毒株感染Vero單層細(xì)胞，感染24 h后棄掉維持液，使用4 ℃預(yù)冷的90%乙醇固定20 min（維持4 ℃低溫），棄去固定液，自然干燥，PBS洗滌3次，每次5 min，自然干燥。以抗PEDV S蛋白MAb（1∶1 000）作為1抗，以抗鼠IgG-FITC（1∶2 000）作為二抗，在熒光倒置顯微鏡下觀察檢測(cè)結(jié)果，對(duì)分離毒株進(jìn)行IFA鑒定。

1.2.3 ?S1基因測(cè)序及進(jìn)化分析 ?以HB201602分離毒株RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒制備cDNA，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增PEDV S1基因（表1）。將RT-PCR擴(kuò)增得到的DNA產(chǎn)物利用膠回收試劑盒進(jìn)行純化，產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行序列的測(cè)定。在NCBI GenBank中下載國(guó)內(nèi)外PEDV代表性毒株的S1基因序列，采用MEGA軟件對(duì)包括HB201602分離毒株在內(nèi)的23株P(guān)EDV S1基因進(jìn)行進(jìn)化分析。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?臨床樣品RT-PCR檢測(cè)

將采集的8份臨床疑似樣品經(jīng)處理后通過(guò)RT-PCR方法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，8份臨床樣品均擴(kuò)增出大小約為660 bp的目的片段，與預(yù)期目的條帶大小一致（圖1）。

2.2 ?病毒的分離與效價(jià)測(cè)定

RT-PCR檢測(cè)確定的陽(yáng)性臨床樣品經(jīng)過(guò)處理后，在Vero細(xì)胞中連續(xù)體外培養(yǎng)傳代，進(jìn)行病毒分離。其中編號(hào)為201602的樣品在連續(xù)傳代后仍然可以感染Vero細(xì)胞引起明顯的細(xì)胞病變（CPE），將該分離的毒株命名為HB201602，并測(cè)定了病毒效價(jià)，其效價(jià)為1.0×105.6 TCID50/0.1 mL。

2.3 ?間接免疫熒光（IFA）鑒定

利用抗PEDV S蛋白的特異性單克隆抗體MAb（4C7株），對(duì)PEDV分離株HB201602感染細(xì)胞進(jìn)行間接免疫熒光檢測(cè)。結(jié)果表明，分離毒株HB201602感染Vero細(xì)胞后，能被抗PEDV S蛋白的特異性單克隆抗體所識(shí)別，在熒光顯微鏡下可觀察到特異性的綠色熒光，證實(shí)所分離毒株為PEDV病毒，且能在Vero細(xì)胞中復(fù)制增殖（圖2）。

2.4 ?HB201602分離株S1基因序列測(cè)定及其進(jìn)化分析

以PEDV臨床分離毒株HB201602提取的RNA為模板，RT-PCR擴(kuò)增S基因部分片段，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，并將位于850 bp處的DNA產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進(jìn)行純化，克隆至T載體上，送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。并與NCBI GenBank中下載的國(guó)內(nèi)外PEDV參考毒株S1基因進(jìn)行序列比較分析，利用MEGA軟件對(duì)包括HB201602分離毒株在內(nèi)的33株P(guān)EDV S1基因進(jìn)行進(jìn)化分析（圖3）。

2.5 ?S1蛋白表面抗原突變分析

以PEDV臨床分離毒株HB201602提取的RNA為模板，RT-PCR擴(kuò)增S1基因部分片段，并對(duì)其基因序列進(jìn)行測(cè)定。以NCBI中32株P(guān)EDV毒株S1基因?yàn)檠芯繉?duì)象，進(jìn)一步分析了S1基因的遺傳變異規(guī)律（圖4）。

3 ?討論

自2010年中國(guó)暴發(fā)豬流行性腹瀉疫情以來(lái)，PEDV已迅速席卷了中國(guó)各地，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[15]。本研究從湖北省規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)臨床腹瀉病料中成功檢測(cè)并分離獲得了一株豬流行性腹瀉病毒，分離毒株感染Vero細(xì)胞可引起明顯的細(xì)胞病變，病毒效價(jià)經(jīng)測(cè)定達(dá)1.0×105.6 TCID50/0.1 mL。間接免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，分離毒株HB201602感染Vero細(xì)胞后，能被抗PEDV S蛋白的特異性單克隆抗體所識(shí)別，在熒光顯微鏡下可觀察到特異性的綠色熒光，進(jìn)一步證實(shí)所分離毒株為PEDV病毒。

冠狀病毒的S蛋白主要識(shí)別宿主細(xì)胞受體，與之結(jié)合并誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體，S蛋白的變異會(huì)導(dǎo)致致病性、免疫原性以及組織趨性的變化[16，17]。此外，S蛋白是協(xié)助病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞的重要結(jié)構(gòu)蛋白，由S1和S2亞基組成，S1較S2更易發(fā)生突變[18，19]。因此，對(duì)HB201602的S1基因進(jìn)行了序列測(cè)定，并從NCBI上選取了32株P(guān)EDV菌株，根據(jù)S1基因構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，發(fā)育樹(shù)將PEDV分為G1和G2型，其中G1細(xì)分為G1-a亞型（經(jīng)典毒株及其來(lái)源的疫苗毒株）、G1-b亞型（S-INDEL毒株），G2細(xì)分為G2-a亞型（變異毒株）、G2-b亞型（重組毒株）。通過(guò)分析PEDV毒株的分離時(shí)間，發(fā)現(xiàn)2011年后分離的毒株大多以G2型變異毒株為主。臨床分離毒株HB201602與AJ1102、YN15、YN30、YN4-9、XY2013、

BJ-2011-1、GD-1、CH-HXIDZ-1-2012等同屬于G2-a亞型（變異毒株）簇，親緣關(guān)系上與AJ1102和LC最為接近，而經(jīng)典毒株CV777位于G1-a分支上，提示HB201602為PEDV變異毒株。S1基因遺傳變異分析顯示，DR13-attenuated、PEDV-attenuated-vaccine等G1-b亞型毒株與其他簇毒株相比，在357-396位氨基酸處，存在9個(gè)特異的氨基酸突變（K357I359T359V361V366T367E368K381K396）。CV777、LZC等G1-a亞型經(jīng)典毒株與其他簇毒株相比，在524-552位氨基酸處，存在4個(gè)特異的氨基酸突變（L524S526V530T552）。這些氨基酸的突變可能導(dǎo)致S蛋白的構(gòu)象和功能變化，進(jìn)一步導(dǎo)致疫苗匹配度降低，造成免疫失敗，增加了PDEV預(yù)防和控制的難度。PDEV S蛋白的突變是否會(huì)引起免疫逃避，進(jìn)而衍生更強(qiáng)毒力毒株的出現(xiàn)目前還不清楚，但對(duì)現(xiàn)階段中國(guó)流行毒株S1基因的變異分析，將有助于了解PEDV的遺傳變異趨勢(shì)，為新型疫苗的研發(fā)提供理論依據(jù)。

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