木薯MeCWINV4啟動子的克隆及其活性分析

耿彬彬+劉姣+郭育強+符少萍+胡新文+郭建春

摘要：根據(jù)木薯細胞壁轉(zhuǎn)化酶基因MeCWINV4已知編碼區(qū)序列與木薯基因組數(shù)據(jù)庫中預(yù)測的MeCWINV4基因序列信息設(shè)計引物，從木薯基因組DNA中對該基因的潛在啟動子區(qū)進行PCR擴增，經(jīng)測序比對成功獲得1 639 bp序列，其中包含74 bp編碼區(qū)序列和1 565 bp潛在啟動子區(qū)序列。用PlantCARE和PLACE軟件分析該序列的順式作用元件，發(fā)現(xiàn)該啟動子包含CAAT box和TATA box保守元件、大量光反應(yīng)相關(guān)元件與應(yīng)對高低溫脅迫和激素響應(yīng)相關(guān)元件。將MeCWINV4啟動子片段取代pVKH表達載體中的CaMV 35S 啟動子與 GUS 連接，構(gòu)建成融合表達載體 pVKH-CW4-GUS，通過農(nóng)桿菌真空滲透法在煙草葉片中進行瞬時表達。結(jié)果表明，該啟動子驅(qū)動了GUS基因在煙草葉片中的表達。說明MeCWINV4啟動子具有啟動子活性，可以啟動目的基因的轉(zhuǎn)錄，為進一步研究該基因的調(diào)控機制奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：木薯；MeCWINV4；啟動子；序列分析；瞬時表達

中圖分類號： S533.01；Q785

文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）04-0036-05

木薯（Manihot esculenta Crantz）屬大戟科木薯屬，為多年生植物，廣泛栽培于熱帶和部分亞熱帶地區(qū)，塊根富含淀粉，可供食用或用于生產(chǎn)乙醇，是全球近6億人的主要糧食來源[1]，也是中國推廣的可再生能源作物和重要的工業(yè)淀粉原料[2]。

木薯塊根淀粉是由源器官（葉片）通過光合作用制造的光合產(chǎn)物，以蔗糖的形式經(jīng)韌皮部裝載、長距離運輸和卸載運送到庫器官 （塊根），然后在塊根中由淀粉合成相關(guān)酶催化合成淀粉[3]。但是，木薯塊根中積累的淀粉量遠遠低于理論產(chǎn)量，地下部分儲藏的碳水同化物還不足地上部分合成同化物的1/5，提高同化物從源到庫的運輸效率對增加木薯塊根淀粉的積累至關(guān)重要。而在木薯淀粉合成積累過程中，對光合產(chǎn)物由“源”到“庫”的裝載、運輸和卸載中起主要調(diào)控作用的是蔗糖轉(zhuǎn)化酶。蔗糖轉(zhuǎn)化酶參與了葉片光合作用的調(diào)節(jié)、韌皮部的卸載和庫的建立、貯藏器官中碳水化合物的積累和組成以及細胞對脅迫的響應(yīng)，并在逆境中起一定作用。蔗糖轉(zhuǎn)化酶根據(jù)其亞細胞定位，可以分為細胞質(zhì)轉(zhuǎn)化酶、液泡轉(zhuǎn)化酶以及細胞壁轉(zhuǎn)化酶[4]。其中，細胞壁轉(zhuǎn)化酶主要參與韌皮部質(zhì)外體卸載時蔗糖的分解，以保持源—庫之間蔗糖的濃度梯度，從而促使蔗糖順利卸載[5]。筆者所在課題組研究發(fā)現(xiàn)木薯中存在6個細胞壁轉(zhuǎn)化酶基因，對這些轉(zhuǎn)化酶基因進行克隆并在木薯各器官中的表達模式進行分析，發(fā)現(xiàn)其中的細胞壁轉(zhuǎn)化酶MeCWINV4在葉片中表達微弱，但在塊根韌皮部中表達量相對較高[6]。由此推測，MeCWINV4基因在塊根韌皮部的組織差異性高表達可能提示該基因在木薯淀粉合成過程中同化物從源到庫運輸時的韌皮部卸載起著很重要的作用。

基因的表達調(diào)控，在植物的生長發(fā)育以及應(yīng)答環(huán)境信號過程中起重要作用[7]。啟動子在調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的起始及表達程度中起著關(guān)鍵作用。研究啟動子的功能序列及其調(diào)控元件對解析基因表達調(diào)控的機制具有十分重要的意義[8]。

本研究根據(jù)已知木薯細胞壁轉(zhuǎn)化酶基因MeCWINV4編碼區(qū)序列與木薯基因組數(shù)據(jù)庫預(yù)測信息克隆木薯細胞壁轉(zhuǎn)化酶基因家族中的MeCWINV4啟動子序列，通過生物信息學分析軟件對其上的順式作用元件進行初步分析，構(gòu)建植物表達載體，利用農(nóng)桿菌真空滲透法轉(zhuǎn)化煙草葉片進行瞬時表達，初步鑒定該啟動子的活性。為后續(xù)深入研究木薯細胞壁轉(zhuǎn)化酶基因啟動子對該基因在淀粉積累過程中的調(diào)控作用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料華南8號木薯與三生煙（Nicotiana tabacum var. samsun NN），采自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶生物技術(shù)研究所試驗基地；大腸桿菌（Escherichia coli）菌株DH5α、農(nóng)桿菌菌株GV3101和含有GUS基因的植物表達載體pVKH-35S-GUS由筆者所在課題組保存。各種工具酶、Marker購自TaKaRa公司；回收純化試劑盒、生化試劑均購自生工生物工程（上海）股份有限公司；PCR引物合成和測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 木薯基因組DNA提取 采用SDS法[9]提取華南8號木薯組培苗幼苗基因組DNA，取適量DNA用于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.2 MeCWINV4啟動子的克隆及序列分析 根據(jù)已知木薯細胞壁轉(zhuǎn)化酶基因MeCWINV4編碼區(qū)序列（GenBank ID：JQ792172）與木薯基因組數(shù)據(jù)庫（http：//www.phytozome.net/cassava）中預(yù)測的MeCWINV4基因序列信息設(shè)計引物。引物序列如下：CW4p-F，GAAAAGGCATCGTCACCATT；CW4P-R，TCAAGCTCAAACACTCCAT。以木薯DNA為模板進行PCR擴增。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，58 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35個循環(huán)；72 ℃充分延伸 10 min。擴增反應(yīng)結(jié)束后經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，再用DNA回收試劑盒純化目的片段，然后將回收產(chǎn)物連接到pMD-19 T-vector simple載體上，通過轉(zhuǎn)化、篩選、菌液PCR，獲得陽性單克隆命名為CW4p-19T。CW4p-19T熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取陽性克隆送往生工生物工程（上海）股份有限公司測序驗證。測序結(jié)果用DNAMAN軟件進行比對，比對正確的序列用PlantCARE和PLACE軟件分析該啟動子序列，在線預(yù)測順式作用元件。

1.2.3 植物表達載體pVKH-CW4-GUS的構(gòu)建 將測序正確的菌液擴大培養(yǎng)提取質(zhì)粒，以該質(zhì)粒為模板，添加酶切位點（正向引物中添加SacⅠ酶切位點，反向引物中添加 BamHⅠ 酶切位點）的特異引物（CW4-1F：TAGAGCTCGAAAAGGCATCGTCAC；CW4-1R：TAGGATCCGCTGGTGAGTGCATGT）進行PCR擴增（下劃線為酶切位點）。通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物大小正確后，將目的片段純化回收后與表達載體pVKH均進行Sac Ⅰ和BamHⅠ雙酶切、純化回收，采用T4 DNA連接酶連接，使MeCWINV4啟動子區(qū)段定向替換pVKH載體上的CaMV35S啟動子。將得到的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取陽性單克隆，菌液PCR和雙酶切雙重鑒定后，委托生工生物工程（上海）股份有限公司進一步測序驗證正確后，獲得重組質(zhì)粒命名為pVKH-CW4-GUS。本試驗以空載體pVKH-35S-GUS作為陽性對照。

1.2.4 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草瞬時表達 采用反復(fù)凍融法[10]將空載體pVKH-35S-GUS和pVKH-CW4-GUS重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細胞中，在YEP（1% Yeast Extract、1% Tryptone、0.5% NaCl）+Kana（100 μg/mL）+Rif（50 μg/mL）固體培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)2 d，挑取單克隆進行菌液PCR鑒定，篩選出陽性菌株，在50 mL YEP液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)。待D600 nm=0.8～1.0時，5 000 r/min離心 5 min 收集菌體，用含10 mmol/L MgCl2、200 μmol/L AS（乙酰丁香酮）和10 mmol/L MES（pH值=5.6）的無菌水重懸至D600 nm約為1.0，室溫靜置2 h后備用。用打孔器將煙草葉片打出大小一致的圓形葉盤，浸泡在菌懸液中，然后在真空泵中抽濾30 min，壓強不超過0.085 MPa，取出后平鋪到含有浸濕濾紙的培養(yǎng)皿中，置于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d。

1.2.5 GUS活性的組織化學染色分析 將侵染后的煙草葉片置于GUS染液[2 mmol/L X-Gluc，5 mmol/L K3Fe（CN）6，100 mmol/L Na3PO4 緩沖液（pH值=7.0），5 mmol/L K4Fe（CN）6，0.2% Triton X-100，10 mmol/L EDTA]中，確保浸沒葉片，37 ℃ 避光保溫3 d，用70%乙醇進行脫色后拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 MeCWINV4啟動子的克隆

經(jīng)瓊脂糖電泳檢測后提取的DNA質(zhì)量較好，可用于后續(xù)PCR試驗（圖1）。根據(jù)設(shè)計的引物從DNA中擴增得到1段長約1 800 bp的DNA片段，測序分析該片段為1 639 bp的序列（圖2）。CW4p-19T測序后經(jīng)Blast比對發(fā)現(xiàn)，該片段含有的MeCWINV4基因是從ATG起始的74 bp編碼區(qū)序列和ATG上游1 565 bp潛在啟動子序列，且該74 bp編碼區(qū)片段與筆者所在的課題組之前克隆的MeCWINV4基因（Accesion NO.JQ792172）相對應(yīng)的全長編碼區(qū)序列同源性達100%，表明所克隆到的序列為MeCWINV4的啟動子序列，序列數(shù)據(jù)提交給GenBank，登錄號為KP164867。

2.2 MeCWINV4 啟動子序列的生物信息學分析

將克隆到的MeCWINV4啟動子序列用PlantCARE和PLACE在線軟件進行元件預(yù)測分析，分析結(jié)果見圖3、表1，結(jié)果顯示，MeCWINV4啟動子不僅含有CAAT box和TATA box保守元件，還存在多種與光反應(yīng)和非生物脅迫相關(guān)的順

式作用元件。（1）光響應(yīng)元件。Box4、Box I、G-Box、GA-motif、GT1 motif、Sp1。（2）脅迫應(yīng)答元件。高溫響應(yīng)元件HSE，低溫響應(yīng)元件LTR，干旱誘導(dǎo)相關(guān)元件MBS，脅迫防御元件TC-rich repeats。（3）激素應(yīng)答元件。脫落酸響應(yīng)元件ABRE，水楊酸響應(yīng)元件SARE，赤霉素響應(yīng)元件GARE-motif，生長素響應(yīng)元件TGA-element等。

2.3 MeCWINV4啟動子融合表達載體的構(gòu)建

2.4 MeCWINV4啟動子活性分析

重組載體pVKH-CW4-GUS和空載體pVKH-35S-GUS分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌后，進行瞬時表達分析。結(jié)果顯示，pVKH-CW4-GUS和pVKH-35S-GUS在煙草葉片中都能驅(qū)動GUS基因的表達，煙草葉片被染成藍色，而陰性對照不能被染色（圖6）。

3 結(jié)論與討論

高等植物中，蔗糖是光合同化物運輸?shù)闹饕问絒11]，木薯韌皮部篩管內(nèi)的糖類80%為蔗糖，木薯源器官（葉片）光合作用合成的同化物經(jīng)過韌皮部裝載-運輸-卸載到庫器官（塊根）形成淀粉。蔗糖轉(zhuǎn)化酶中細胞壁轉(zhuǎn)化酶是植物源庫器官蔗糖代謝的關(guān)鍵酶，不可逆地將蔗糖分解成葡萄糖和果糖，參與韌皮部質(zhì)外體卸載時蔗糖的分解，保持源—庫之間蔗糖的濃度梯度，調(diào)節(jié)蔗糖從葉中運出的速率來進行源庫關(guān)系的建立及調(diào)控[12-14]。同時有研究發(fā)現(xiàn)，當植物受到生物和非生物脅迫時，細胞壁轉(zhuǎn)化酶基因被激活或增強表達，參與一系列防御反應(yīng)。擬南芥根部被病原菌侵染后，根內(nèi)細胞壁轉(zhuǎn)化酶基因表達量升高，更多的蔗糖運輸?shù)角秩静课?，為根細胞抵御病原菌侵染提供碳水化合物[15]。Sonnewald等研究發(fā)現(xiàn)，當病原菌侵染胡椒葉片后，細胞壁轉(zhuǎn)化酶基因表達及活性提高，己糖信號形成，誘導(dǎo)病程相關(guān)蛋白（PR）基因表達，增強葉片對病原菌的防御力[16]。同時發(fā)現(xiàn)，傷害脅迫[17]、誘導(dǎo)子[18]、病原菌侵染[19]和己糖[20]誘導(dǎo)細胞壁轉(zhuǎn)化酶基因的表達，乙烯則抑制其表達[21]。

基因在生物生長發(fā)育過程中根據(jù)生物自身和環(huán)境定時、定位、定量地特意表達，很大程度上是通過DNA順式作用元

件與反式作用因子或環(huán)境中光、熱、脅迫等因素的互作來實現(xiàn)的。其中，啟動子的作用尤為關(guān)鍵[22]。轉(zhuǎn)化酶基因能夠被多種脅迫信號誘導(dǎo)表達，可能是由于這些基因的啟動子序列中存在與逆境誘導(dǎo)相關(guān)、參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的順式作用元件[23]。牛俊奇等發(fā)現(xiàn)，甘蔗酸性轉(zhuǎn)化酶基因SoSAI1上游 417 bp 啟動子中含有參與干旱誘導(dǎo)的MYB結(jié)合位點，15%PEG脅迫能誘導(dǎo)甘蔗苗期根和葉片中SoSAIⅠ的表達[23]；成善漢等研究發(fā)現(xiàn)，通過低溫處理，誘導(dǎo)了馬鈴薯啟動子CIP調(diào)控轉(zhuǎn)化酶抑制子St-VIF基因表達的上調(diào)，從而抑制轉(zhuǎn)化酶的活性[24]。在煙草[25]、擬南芥[26]、大豆[27]等植物中也得到了同樣的驗證。

本試驗克隆獲得的木薯細胞壁轉(zhuǎn)化酶MeCWINV4基因的1 639 bp啟動子除含有CAAT box和TATA box等真核生物啟動子基本元件外，還存在大量光反應(yīng)元件如Box4、Box I、G-Box、GA-motif、GT1 motif、Sp1，說明MeCWINV4基因的表達受到光的調(diào)控，能更高效地在木薯淀粉積累過程中發(fā)揮作用。同時該啟動子上也存在多個脅迫應(yīng)答元件（高溫響應(yīng)元件HSE、低溫響應(yīng)元件LTR、干旱誘導(dǎo)相關(guān)元件MBS、脅迫防御元件TC-rich repeats）和激素應(yīng)答元件（脫落酸響應(yīng)元件ABRE，水楊酸響應(yīng)元件SARE，赤霉素響應(yīng)元件GARE-motif，生長素響應(yīng)元件TGA-element），暗示該基因的表達可能受到多種逆境脅迫和激素的調(diào)控。MeCWINV4啟動子上這些順式作用元件的預(yù)測結(jié)果可以為后續(xù)的酵母單雜交試驗提供理論依據(jù)，也為了解該基因的調(diào)控模式、信號傳遞途徑、生物適應(yīng)環(huán)境機制提供理論基礎(chǔ)。

煙草瞬時表達試驗證明了所克隆的MeCWINV4啟動子能夠啟動GUS報告基因的表達，具有啟動子活性。瞬時表達雖然不受基因沉默和基因位置效應(yīng)的影響且轉(zhuǎn)化率高，但為了進一步研究MeCWINV4啟動子的組織表達特性和調(diào)控基因表達模式，還須通過進一步穩(wěn)定表達試驗進行元件缺失分析和不同誘導(dǎo)條件下該基因及其該啟動子活性變化，更深入地分析該基因啟動子活性，目前相關(guān)工作正在進行中。

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