Nultin-3聯(lián)合順鉑對口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的抑制作用及機(jī)制研究

施 俊 倪小兵 毛 敏 彭興春

口腔鱗狀細(xì)胞癌(OSCC)是頭頸部腫瘤最常見的類型，約占95%，其發(fā)生發(fā)展是多基因共同作用的結(jié)果，包括原癌基因的激活或抑癌基因的失活[1-2]。大量研究表明，原癌基因鼠雙微體基因2(MDM2)在正?？谇火つそM織中的表達(dá)水平明顯低于口腔鱗癌組織[3]。MDM2基因定位于人染色體12q13-14區(qū)，其編碼蛋白能夠通過負(fù)性調(diào)控下游p53蛋白，從而增加腫瘤的發(fā)生風(fēng)險、促進(jìn)腫瘤的形成和進(jìn)展[4]。本研究探討了MDM2抑制劑Nultin-3聯(lián)合順鉑處理對口腔鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞的抑制作用及相關(guān)機(jī)制，旨在為臨床開發(fā)口腔鱗狀細(xì)胞癌的聯(lián)合化療方案提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人口腔鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞株購于上海中科院細(xì)胞庫，順鉑(凍干型)(山東齊魯制藥有限公司，中國)；DMEM培養(yǎng)液(Gibco，美國)；胎牛血清(FBS)(Hyclone，美國)；胰蛋白酶(Sigma，美國)；DMSO(Sigma，美國)；MTT(北京碧云天公司，中國)；Nultin-3(Selleck chemicals公司，美國)；兔抗人(MDM2、p53、Caspase-3、Caspase-9、GAPDH)抗體(Cell signaling公司，美國)；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗(北京中杉金橋公司，中國)；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(Milliore，美國)和PVDF膜(Milliore，美國)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) Tca8113細(xì)胞用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液(100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素)，置37℃，5%CO2飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞長滿培養(yǎng)皿底壁的80%～90%時，0.25%胰蛋白酶消化，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。取對數(shù)期的細(xì)胞進(jìn)行加藥實驗。

1.2.2 實驗分組 實驗分為四組：對照組、順鉑組、MDM2抑制劑組(Nultin-3組)及Nultin-3聯(lián)合順鉑組(聯(lián)合組)。對照組加不含藥物的等量DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞48 h；順鉑組用含終濃度4 μg/mL順鉑的培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h；Nultin-3組用含終濃度為10 μM Nultin-3的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞48 h；聯(lián)合組為10 μM的Nultin-3與4 μg/mL的順鉑聯(lián)用培養(yǎng)細(xì)胞48 h。

1.2.3 MTT法檢測細(xì)胞增殖抑制率 取對數(shù)生長期的Tca8113細(xì)胞，常規(guī)消化離心，計數(shù)后按照4×103個/孔細(xì)胞接種于96孔板培養(yǎng)板中，每孔100 μL培養(yǎng)液，置37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后加藥處理，每組至少設(shè)置9個平行孔，各組細(xì)胞藥物作用48 h后，加入5 mg/mL MTT，20 μL/孔，室溫孵育4 h后棄上清，滴加二甲基亞砜(DMSO)150 μL/孔，輕微震蕩溶解結(jié)晶后用酶標(biāo)儀于490 nm波長處檢測各孔吸光度(OD)值。重復(fù)實驗3次，計算各組腫瘤細(xì)胞生長的增殖率(%)。

腫瘤細(xì)胞增殖率(%)=(用藥組細(xì)胞OD值/對照組細(xì)胞OD值)×100%

1.2.4 Western blot分析 分別消化并收集各組細(xì)胞后用PBS液洗滌3次，加入預(yù)冷的蛋白裂解液，冰上裂解30 min，然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中，4℃，12 000 rpm離心5 min，取上清即為提取的總蛋白。BCA法檢測蛋白濃度后加2×SDS上樣緩沖液，95℃高溫煮5 min使蛋白變性。各泳道加入100 μg蛋白，10% SDS-PAGE電泳后將電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。用封閉液(5%脫脂奶粉)室溫封閉2 h，加入兔抗人MDM2(1∶1 000)、p53(1∶1 000)、Caspase-3(1∶1 000)、Caspase-9(1∶1 000)及GAPDH抗體(1∶1 000)，4℃孵育過夜。預(yù)冷TBST洗膜5 min×3次，HRP標(biāo)記的二抗置室溫下混搖孵育2 h(1∶2 000)，TBST洗膜5 min×3次，ECL化學(xué)顯色。

1.3 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果

2.1 Nultin-3和順鉑單獨或聯(lián)合作用后Tca8113細(xì)胞增殖率

析因設(shè)計方差分析顯示，Nultin-3和順鉑兩種藥物之間交互作用有統(tǒng)計學(xué)意義(F=6.482，P=0.035)。LSD-t檢驗提示，與對照組相比，Nultin-3組、順鉑組和聯(lián)合組的細(xì)胞增殖率明顯降低(P<0.05)，與Nultin-3組、順鉑組比較，聯(lián)合組細(xì)胞增殖率明顯降低(P<0.05)(圖1)。

圖1 Nultin-3和順鉑單獨或聯(lián)合用藥后Tca8113細(xì)胞增殖率Figure 1 The proliferative rates of Tca8113 cells treated with Nultin-3，cisplatin，Nultin-3 combinatined with cisplatin or control groupsNote：Compared with the control group，* P<0.05；Compared with the Nultin-3 group，# P<0.05；Compared with the Cisplatin group，△P<0.05.

2.2 Western blot法檢測各組凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平

Nultin-3和順鉑兩種藥物對凋亡相關(guān)蛋白Caspase-9和Caspase-3表達(dá)水平影響的交互作用有統(tǒng)計學(xué)意義(F=6.458，P=0.034；F=5.826，P=0.041)，LSD-t檢驗顯示與對照組比較，Nultin-3組、順鉑組和聯(lián)合組的凋亡相關(guān)蛋白Caspase-9和Caspase-3的表達(dá)水平均明顯升高(P<0.05)，其中聯(lián)合組表達(dá)水平最高，聯(lián)合組Caspase-9和Caspase-3的表達(dá)水平高于Nultin-3組和順鉑組(P<0.05)(圖2)。

圖2 Western blot法檢測各組凋亡相關(guān)蛋白Caspase-9及Caspase-3相對表達(dá)量Figure 2 The relative expression of Caspase-9 and Caspase-3 in Tca8113 cells treated with Nultin-3，cisplatin，Nultin-3 combinatined with cisplatin or control groupsNote：Compared with the control group，*P<0.05；Compared with the Nultin-3 group，# P<0.05；Compared with the Cisplatin group，ΔP<0.05.

2.3 Nultin-3和順鉑單獨或聯(lián)合用藥后對MDM2-p53通路的影響

Nultin-3和順鉑兩種藥物對MDM2蛋白、p53蛋白表達(dá)量影響的交互作用有統(tǒng)計學(xué)意義(F=6.077，P=0.039；F=7.823，P=0.021)，與對照組相比，Nultin-3組、順鉑組的MDM2蛋白表達(dá)量均降低(P<0.05)，聯(lián)合組較單獨用藥組進(jìn)一步降低，相反，Nultin-3組、順鉑組的p53蛋白表達(dá)量較對照組明顯升高，聯(lián)合組蛋白表達(dá)量較單獨用藥組進(jìn)一步升高(圖3)。

圖3 各組細(xì)胞藥物處理后MDM2-p53信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平Figure 3 The expression of MDM2-p53 signaling pathway related proteins in Tca8113 cells treated with Nultin-3，cisplatin，Nultin-3 combinatined with cisplatin or control groupsNote：Compared with the control group，*P<0.05；Compared with the Nultin-3 group，# P<0.05；Compared with the Cisplatin group，ΔP<0.05.

3 討論

口腔鱗癌為頭頸部常見腫瘤，預(yù)后相對較差，死亡率居高不下，5年生存率維持在60%左右[5]。目前治療這類疾病臨床上最常采用的治療方法包括手術(shù)、放療和化療。其中，鉑類藥物(如順鉑)化療已成為當(dāng)前口腔鱗癌綜合治療的重要組成部分，化療的成功與否直接關(guān)系著患者的生存質(zhì)量[6]?？谇击[癌在化療初期對順鉑的應(yīng)答性很高，但隨著化療的進(jìn)行，出現(xiàn)了腫瘤細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥的現(xiàn)象，繼而影響了化療效果[7-8]。因此，深入研究口腔鱗癌化療抵抗的主要分子機(jī)制，進(jìn)一步探尋更為有效的臨床治療手段是本課題的主旨。

MDM2是與雙微體相關(guān)的DNA擴(kuò)增基因，該基因可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長發(fā)育，增強(qiáng)細(xì)胞的生存活力，從而使細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化、增殖和惡變的能力增強(qiáng)[9]。Agarwal等研究表明在口腔正常黏膜組織中MDM2蛋白的表達(dá)水平低于口腔鱗癌組織[10]。MDM2的過表達(dá)不僅能促進(jìn)腫瘤的快速生長，還與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移、化療敏感性差和預(yù)后不良有關(guān)[11-12]。MDM2抑制劑Nultin-3是一種順式咪唑啉類小分子，可以競爭性結(jié)合MDM2，阻斷其對下游信號的調(diào)控作用。研究表明，Nultin-3能特異性的作用于腫瘤細(xì)胞，但不能誘導(dǎo)正常的非腫瘤細(xì)胞及腫瘤組織的凋亡[13]；同時，Nultin-3與抗有絲分裂藥、基因毒性藥物以及放療有協(xié)同作用[14]。本研究通過體外單獨使用MDM2抑制劑Nultin-3，順鉑或聯(lián)合使用兩藥處理口腔鱗癌Tca8113細(xì)胞后，實驗結(jié)果顯示，Nultin-3及順鉑單獨使用均能抑制Tca8113細(xì)胞的生長，兩藥聯(lián)合使用后較單藥組抑制增殖效果更為明顯，表明聯(lián)合組對腫瘤細(xì)胞的抑制作用進(jìn)一步增強(qiáng)。通過析因設(shè)計方差分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Nultin-3與順鉑聯(lián)合用藥后具有協(xié)同增效作用。由此可見，MDM2抑制劑在口腔鱗癌治療中抑制鱗癌細(xì)胞生長并逆轉(zhuǎn)鉑類化療藥物耐藥性方面表現(xiàn)出潛在的應(yīng)用前景。

當(dāng)前藥物抗腫瘤的主要機(jī)制是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，其中線粒體凋亡是細(xì)胞凋亡的主要途徑之一[15]。半胱氨酸蛋白酶(Caspase)家族是線粒體凋亡途徑中最重要的蛋白酶，線粒體通過釋放細(xì)胞色素C進(jìn)入胞質(zhì)，激活凋亡途徑中的必須始動子pro-Caspase-9形成Caspase-9，進(jìn)而激活Caspase-3，形成活性片段Cleaved caspase-3，后者是線粒體凋亡途徑的核心效應(yīng)器，一旦被激活細(xì)胞將進(jìn)入不可逆的凋亡階段，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[16-17]。本實驗通過Western blot法檢測結(jié)果顯示，Nultin-3和順鉑單獨作用Tca8113細(xì)胞后，促凋亡蛋白Caspase-9和Caspase-3相對表達(dá)量均上調(diào)，兩藥聯(lián)合作用后上調(diào)兩種凋亡蛋白表達(dá)的作用更明顯。從而推測Nultin-3和順鉑可能是通過線粒體途徑調(diào)控Caspase家族蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡從而發(fā)揮協(xié)同抗口腔鱗癌細(xì)胞作用。

MDM2具有調(diào)節(jié)抑癌基因p53的作用。MDM2蛋白通過抑制p53的轉(zhuǎn)錄活化功能和抗腫瘤活性，促進(jìn)腫瘤的形成[18]。MDM2基因明顯擴(kuò)增和表達(dá)時，其表達(dá)產(chǎn)物可與p53蛋白結(jié)合，使p53功能受到抑制或完全失活[19]。研究表明，Nultin-3能拮抗MDM2解除MDM2對p53的抑制，從而增強(qiáng)p53介導(dǎo)的凋亡作用，改善順鉑抵抗的腫瘤的治療效果。這說明MDM2具有p53依賴性的致瘤作用[20-21]。在p53突變型套細(xì)胞淋巴瘤中使用Nultin-3能夠增強(qiáng)硼替佐米的線粒體凋亡作用[22]。因此，在腫瘤細(xì)胞中，特異性針對MDM2的泛素連接酶活性的小分子抑制劑能夠激活p53信號通路、誘導(dǎo)p53依賴性的細(xì)胞凋亡。本研究通過Western blot檢測各組MDM2及p53蛋白的相對表達(dá)量，結(jié)果顯示，與對照組相比，Nultin-3組和順鉑組的MDM2蛋白表達(dá)量均顯著降低，聯(lián)合組較單獨用藥組進(jìn)一步降低；相反，Nultin-3組和順鉑組的p53蛋白表達(dá)量較對照組明顯升高，聯(lián)合組蛋白表達(dá)量較單獨用藥組進(jìn)一步升高。由此可見，藥物處理口腔鱗癌細(xì)胞后，MDM2與p53蛋白的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。MDM2是泛素-蛋白酶的重要組成部分，屬于E3泛素連接酶。MDM2一方面可以通過泛素化p53，然后由蛋白酶體降解p53；另一方面MDM2還能夠直接結(jié)合并抑制p53的轉(zhuǎn)錄活性[23]。Nultin-3聯(lián)合順鉑調(diào)控下游p53蛋白表達(dá)的更深入機(jī)制將是我們下一步研究的方向。

綜上所述，本研究證實Nultin-3和順鉑聯(lián)合應(yīng)用對口腔鱗癌Tca8113細(xì)胞的生長抑制和凋亡效應(yīng)均明顯優(yōu)于單藥治療組。因此，本研究認(rèn)為Nultin-3可以作為一種鉑類化療藥的輔助藥物，能夠和順鉑共同抑制口腔鱗癌細(xì)胞，降低化療藥物的毒副作用，從而增強(qiáng)其抗腫瘤效果。Nultin-3可以考慮作為一種輔助用藥，與化療藥物順鉑協(xié)同作用，在產(chǎn)生同等治療效果的前提下，以減少順鉑的用量，從而減輕順鉑的毒副作用；同時為臨床開發(fā)新的口腔鱗癌治療方案提供堅實的理論及實驗基礎(chǔ)。