胃癌組織中miR-320a和CYLD的表達及與臨床病理特征及預后的關系

唐淑麗 何匡邦 張純慧 程佳楠 張艷橋

胃癌是發(fā)生于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，預后較差，據(jù)報道，2012年全球新發(fā)胃癌病例約95.1萬例，死亡率約76.03%，其中約50%病例主要發(fā)生在我國，我國胃癌死亡率約占全球胃癌死亡率的45%[1]。近年來我國胃癌整體發(fā)病率呈下降趨勢，但由于胃癌早期診斷率較低，多數(shù)患者未能及時有效診療，胃癌死亡率仍不樂觀[2]。因此，發(fā)現(xiàn)影響胃癌發(fā)生發(fā)展的特異性標志物，進行有針對性的干預和調(diào)控治療，對早期預防和治療胃癌，改善患者預后有重要意義。miR-320a已被證實可通過調(diào)控FoxM1-P27～(KIP1)通路等抑制胃癌細胞增殖[3]。頭帕腫瘤綜合征蛋白(Cylindromatosis，CYLD)是一種腫瘤抑制因子，已證實CYLD表達量下降與肝癌、胰腺癌、甲狀腺乳頭狀癌等多種癌癥的發(fā)生發(fā)展有關[4]。但其在胃癌中的表達作用鮮有報道。因此，本研究分析miR-320a和CYLD在胃癌患者中的表達及與預后的關系，旨在為尋找胃癌治療新靶點提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選擇2013年3月—2014年11月在我院確診為胃癌并擇期進行腫瘤組織切除手術的460例患者作為研究對象，其中男280例，女180例，年齡42～67歲，平均年齡(54.83±6.18)歲，根據(jù)美國癌癥聯(lián)合委員會與國際抗癌聯(lián)盟(AJCC/UICC)第七版胃癌TNM分期標準[5]：Ⅰ期108例，Ⅱ期202例，Ⅲ期150例，低分化115例，中分化155例，高分化190例。納入標準：(1)均符合2010年衛(wèi)生部發(fā)布的《胃癌診斷標準》中胃癌診斷標準[6]；(2)經(jīng)胃鏡檢查和活組織檢查確診為胃癌；(3)經(jīng)我院倫理委員會同意，受試者均知情并自愿簽署同意書。排除標準：(1)合并其他組織癌變患者；(2)胃癌切除術前進行過免疫治療，化療等輔助治療者；(3)患有心、肝、腎等其他系統(tǒng)疾病者；(4)圍手術期死亡或不能接受術后隨訪患者；(5)臨床資料不完整無法評估影響預后相關因素。

1.2 試劑和儀器

TRIzolTMReagent和SYBR?Green實時熒光定PCR試劑盒購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；Quant One Step RT-PCR kit(KR113)購自天根生化科技(北京)有限公司；IHC kit購自Cell Signaling Technology(CST)；兔抗人CYLD抗體購自上海撫生實業(yè)有限公司。miR-320a上游引物5′-GTTGGATCCGGCGTTTCCTTCCGACATG-3′，下游引物5′-GCTGAATTCGTCCACTGCGGCTGTTCC-3′，U6上游引物：5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′，下游引物5′-GGAACGCTTCACGAATTTC-3′，本研究引物均合成于生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 組織樣本采集 分別采集每例患者腫瘤組織，置于冰上，用冷生理鹽水沖洗干凈，分別留取黃豆大小的腫瘤組織兩部分，一部分放入4%甲醛中固定，用于免疫組織化學染色，一部分在冰上研磨后用于提取RNA。另在距離腫瘤邊緣5 cm外采集癌旁非腫瘤胃粘膜組織，同上分兩部分保存。

1.3.2 熒光定量PCR 取研磨后的腫瘤組織和癌旁非腫瘤組織，采用TRIzolTM Reagent提取組織RNA，采用Quant One Step RT-PCR kit反轉(zhuǎn)錄后，以U6為內(nèi)參，實時熒光定量PCR分別檢測miR-320a相對表達量和CYLD mRNA相對表達量。以2-△△Ct法計算組織中miR-320a和CYLD mRNA相對表達量。

1.3.3 免疫組織化學染色 取經(jīng)甲醛固定后的腫瘤組織和癌旁非腫瘤組織，制作石蠟切片，采用IHC kit進行免疫組織化學染色，一抗為兔抗人CYLD抗體，以PBS代替一抗作為陰性對照，分別檢測CYLD蛋白表達量，以組織中出現(xiàn)黃棕色顆粒為CYLD陽性表達。400倍視野下，隨機觀察5個區(qū)域，并進行細胞計數(shù)，結(jié)合陽性細胞比例評分和染色強度評分評估CYLD蛋白在腫瘤組織和非腫瘤組織中的表達水平，其中陽性細胞比例評分為0～3分：無陽性細胞記0分，陽性細胞比例小于10%記1分，小于50%記2分，大于50%記3分；染色強度評分為0～3分：細胞無染色記0分，染色為淡黃色表示弱陽性記1分，染色為黃棕色表示陽性記2分，染色為棕色表示強陽性記3分。兩項評分之積為切片免疫活性分數(shù)，以總分≥4分為陽性表達(+)，<4分為陰性表達(-)。

1.4 隨訪

入組患者均獲隨訪3年，隨訪期間定期復查CT、MRI等，統(tǒng)計患者總生存率(即從手術開始至死亡的時間)，計算中位生存期。

1.5 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 miR-320a、CYLD mRNA和CYLD蛋白表達水平

腫瘤組織中miR-320a的相對表達量(0.37±0.09)低于癌旁非腫瘤組織(0.86±0.15)，腫瘤組織中CYLD mRNA的相對表達量(0.91±0.23)也低于癌旁非腫瘤組織(1.56±0.42)，差異均有統(tǒng)計學意義(t=60.078，29.113，P<0.001)；CYLD蛋白在腫瘤組織胞質(zhì)中少量表達，胞核中幾乎不表達，陽性表達率43.48%，而在癌旁非腫瘤組織胞質(zhì)和胞核中均有不同程度表達，陽性表達率73.91%，CYLD在腫瘤組織中陽性表達率低于癌旁非腫瘤組織，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=8.788，P=0.003)(表1-表2、圖1-圖2)。

表1 腫瘤組織與癌旁非腫瘤組織間miR-320a和CYLD mRNA相對表達量比較

表2 腫瘤組織與癌旁非腫瘤組織間CYLD蛋白表達水平比較

圖1 miR-320a和CYLD mRNA在胃癌及癌旁非腫瘤組織中的相對表達量Figure 1 The relative expression of miR-320a and CYLD at level of mRNA in gastric cancer and non-tumor tissues.Note：*P<0.05，when compared to the non-tumor tissues.

圖2 CYLD蛋白在胃癌及癌旁非腫瘤組織中的表達Figure 2 The expression of CYLD protein in gastric cancer and non-tumor tissuesNote：A.The expression of CYLD protein in tumor tissues；B.The expression of CYLD protein in non-tumor tissues.

2.2 miR-320a 和CYLD表達水平與胃癌患者臨床病理特征的關系

miR-320a在腫瘤組織中的表達量以所有患者相對表達量的中位數(shù)為界分為高表達和低表達，miR-320a表達量與患者性別、年齡、TNM分期和腫瘤分化程度無關(χ2=1.142，0.131，0.794，2.346，P>0.05)，而腫瘤直徑>1 cm患者中miR-320a高表達與腫瘤直徑≤1 cm患者比較，差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=25.859，P=0.000)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中miR-320a高表達與淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移患者比較，差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=13.742，P=0.000)；CYLD陽性表達與患者性別、年齡、腫瘤直徑、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移無關(χ2=0.156，1.558，0.044，1.113，P>0.05)，而TNM分期Ⅰ～Ⅱ患者CYLD陽性表達率與Ⅱ～Ⅲ期患者比較，差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=37.725，P<0.001)，腫瘤中低分化患者CYLD陽性表達率與腫瘤高分化患者比較，差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=59.323，P<0.001)(表3)。

表3miR-320a和CYLD表達水平與胃癌患者臨床病理特征的關系

Table3Relationship between miR-320a and CYLD expression and clinicopathological characteristics in patients with gastric cancer

ParameternmiR-320a expressionHighLowχ2PCYLD+-χ2PSex1.1420.2850.1560.693Female180801009189Male280140140135145Age(years)0.1310.7171.5580.212≥54250128122126124<542101129811991TNM staging0.7940.37337.725<0.001Ⅰ～Ⅱ310148162183127Ⅲ150797142108Tumor diameter25.859<0.0010.0440.834>1cm11031794961≤1cm350198152162188Degree of tumor differentiation2.3460.12659.3230.000Milled-low differentiation27012714388182High differentiation1901048613258Lymph node metastasis13.7420.0001.1130.292Yes1706210868102No290159131132158

2.3 miR-320a和CYLD表達水平與患者預后的關系

460例患者術后隨訪3年，367例患者死于胃癌，3年總死亡率79.78%，剩余93例患者幸存。miR-320a低表達患者中位生存期(20.36±0.56)(95%CI：19.252～21.462)與miR-320a高表達患者中位生存期(28.29±0.58)(95%CI：27.158～29.412)比較，差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=87.967，P<0.001)；CYLD陰性表達患者中位生存期(17.70±0.56)(95%CI：16.599～18.796)與CYLD陽性表達患者中位生存期(26.74±0.64)(95%CI：25.474～27.997)比較，差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=109.887，P<0.001)；miR-320a和CYLD共表達患者中位生存期(29.01±0.77)(95%CI：26.831～28.946)與非共表達患者中位生存期(17.13±0.61)(95%CI：17.214～19.568)比較，差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=117.680，P<0.001)(表4，圖3-圖5)。

圖3 miR-320a高表達與低表達患者間生存曲線比較Figure 3 Survival curves of patients with a high or low expression of miR-320a by Kaplan-Meier analysis

圖4 CYLD陽性表達與陰性表達患者間生存曲線比較Figure 4 Survival curves of patients with a positive or negative expression of CYLD by Kaplan-Meier analysis

圖5 miR-320a和CYLD共表達與非共表達患者患者間生存曲線比較Figure 5 Survival curves of patients with or without co-expressed miR-320a and CYLD

2.4 miR-320a和CYLD mRNA表達相關性分析

腫瘤組織miR-320a與CYLD mRNA表達水平呈正相關(r=0.607，P<0.001)(圖6)。

圖6 miR-320a與CYLD mRNA表達水平相關性分析Figure 6 Correlating analysis between the expression miR-320a and CYLD at level of mRNA

2.5 影響胃癌患者預后的COX多因素回歸分析

以性別、年齡、TNM分期、腫瘤直徑、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、miR-320a表達水平及CYLD表達水平為自變量，進行COX多因素回歸分析，結(jié)果證實，miR-320a低表達、CYLD陰性表達、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤分化程度是影響胃癌患者預后的獨立危險因素(表5)。

表5 影響胃癌患者術后3年總生存率相關因素的COX回歸分析

3 討論

越來越多的研究證實，miRNA在腫瘤生物學中發(fā)揮著調(diào)控基因表達的重要作用[7]。在胃癌中已發(fā)現(xiàn)多種miRNAs與患者病情發(fā)生發(fā)展密切相關，如miRNA-223在胃癌組織中表達量降低，miRNA-223與Sp1基因的3′-UTR結(jié)合，抑制Sp1基因表達，從而調(diào)節(jié)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，調(diào)節(jié)癌細胞增殖和侵襲。EMT在各種癌細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲過程中發(fā)揮重要作用，近年來研究表明，波形蛋白是EMT的典型標志物，波形蛋白在發(fā)展性胃癌組織中表達量明顯增加，與腫瘤進展及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關[8]。Lv等研究表明，miR320a通過調(diào)節(jié)STAT3信號途徑，抑制肺腺癌細胞轉(zhuǎn)移和增殖[9]。另有研究證實，miR-320a在多種癌癥中有多種靶向基因，如在腺樣囊性癌和膀胱癌，miR-320a通過靶向ITGB3抑制癌細胞轉(zhuǎn)移和侵襲[10-11]。說明miR-320a可通過多種途徑調(diào)控腫瘤的發(fā)生及發(fā)展過程。本研究結(jié)果顯示，胃癌組織中miR-320a相對表達量明顯低于非腫瘤組織，與前人研究結(jié)果一致，進一步分析發(fā)現(xiàn)，miR-320a表達量在腫瘤不同大小，淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移患者中表現(xiàn)出明顯差異，且miR-320a低表達患者3年死亡率明顯高于miR-320a高表達患者，說明miR-320a低表達與胃癌細胞增殖和遷移有關，影響患者預后。Ying等對胃癌組織進行miRNAs微陣列芯片分析顯示miR-320a表達量顯著降低，對其作用靶基因分析表明，波形蛋白和泛素化蛋白酶14是miR-320a的靶基因，過表達miR-320a能夠抑制波形蛋白和泛素化蛋白酶14對胃癌細胞惡化的促進作用，提示miR-320a具有抑制胃癌細胞增殖，遷移和侵襲作用[12]。

CYLD是一種去泛素化酶，可通過去泛素化影響TGF-β，NF-kB等多條信號通路，調(diào)控癌細胞凋亡，發(fā)揮抑癌作用。Kinoshita等研究表明，CYLD在肝癌組織中顯著低表達，通過負調(diào)節(jié)NF-kB，促進TGF-β，加重患者病情，且CYLD低表達的肝癌患者總生存率明顯低于CYLD高表達患者，提示CYLD與肝癌發(fā)展有臨床相關性[13]。姜維民等研究表明，CYLD在胰腺癌組織中表達下調(diào)，與患者腫瘤分期和分化程度有關[14]。本研究結(jié)果顯示，CYLD mRNA在胃癌組織中表達量明顯降低，CYLD蛋白在非腫瘤組織胞質(zhì)和胞核中都有表達，但在胃癌組織中表達明顯減少，只在胞質(zhì)中觀察到少量表達，進一步分析表明，CYLD表達與患者TNM分期，腫瘤分化程度相關，與姜維民等在胰腺癌中的研究結(jié)果相似，KM生存函數(shù)分析表明，CYLD陰性表達患者3年死亡率明顯高于CYLD陽性表達患者，說明CYLD與患者預后有關。CYLD參與腫瘤發(fā)展的分子機制研究表明，CYLD可通過阻斷JNK/AP1信號通路，調(diào)控表皮腫瘤的發(fā)生及發(fā)展[15]。其在胃癌中的作用機制有待進一步深入探究。Li等研究表明，在甲狀腺乳頭狀癌中，抑制miR-181b表達能夠上調(diào)CYLD蛋白水平，起到抑制癌細胞生長，促進癌細胞凋亡作用[16]。Sun等研究表明，miR-130b在胃癌組織中顯著上調(diào)，CYLD是miR-130b的潛在靶基因，高表達的miR-130b可通過調(diào)節(jié)CYLD蛋白水平發(fā)揮增強癌細胞增殖，抑制癌細胞凋亡作用[17]。Yan等[18]研究表明，在胃癌中，CYLD是miR-425-5p的直接靶點，miR-425-5p表達上調(diào)與CYLD表達水平呈負相關關系。本研究相關性分析發(fā)現(xiàn)，miRNA320a表達水平與CYLD mRNA表達水平呈正相關關系，且兩者共表達患者3年死亡率顯著低于非共表達患者，因此可推測胃癌中miRNA-320a可能正調(diào)控CYLD表達，通過過表達miRNA-320a可能促進CYLD mRNA表達，抑制胃癌患者病情發(fā)展。多因素回歸分析表明，miR-320a低表達、CYLD陰性表達、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤分化程度是影響胃癌患者預后的獨立危險因素，提示miR-320a和CYLD不僅與胃癌患者臨床病理特征相關，也影響患者預后，可作為早期診斷，治療及預測患者預后的標志物。

綜上所述，胃癌組織中miR-320a和CYLD低表達與患者病情發(fā)展有關，檢測miR-320a和CYLD表達量有助于早期診斷及預測患者預后，同時基于miR-320a和CYLD在腫瘤中發(fā)揮重要作用，二者可能成為腫瘤治療的新靶點。但miR-320a和CYLD在胃癌中的作用機制，miR-320a和CYLD在胃癌中是否存在相互作用，有待進一步研究證實。