基于重組酶和終止子的狀態(tài)調(diào)控開關(guān)設(shè)計(jì)

張嵩元，邱建輝，王宣，董一名，李昱龍，張益豪，歐陽頎

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基于重組酶和終止子的狀態(tài)調(diào)控開關(guān)設(shè)計(jì)

張嵩元1*，邱建輝1*，王宣2，董一名1，李昱龍1，張益豪1，歐陽頎1

1 北京大學(xué) 定量生物學(xué)中心與生命科學(xué)聯(lián)合中心，北京 100871 2 清華大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院與生命科學(xué)聯(lián)合中心，北京 100084

張嵩元, 邱建輝, 王宣, 等. 基于重組酶和終止子的狀態(tài)調(diào)控開關(guān)設(shè)計(jì). 生物工程學(xué)報(bào), 2018, 34(12): 1874–1885.Zhang SY, Qiu JH, Wang X, et al. Design of recombinase and terminator-based genetic switches for cell state control. Chin J Biotech, 2018, 34(12): 1874–1885.

合成生物學(xué)研究常用基因開關(guān)來調(diào)控細(xì)胞的狀態(tài)以實(shí)現(xiàn)相應(yīng)功能。已有的基因開關(guān)往往需要持續(xù)的輸入信號(hào)來維持特定的開關(guān)狀態(tài)，開關(guān)功能的維持需要持續(xù)消耗能量，并且對擾動(dòng)較為敏感。文中利用了位點(diǎn)特異性重組酶的倒位效應(yīng)反轉(zhuǎn)終止子，構(gòu)建了一種轉(zhuǎn)錄層次的狀態(tài)調(diào)控開關(guān)，使得脈沖信號(hào)即可觸發(fā)開關(guān)狀態(tài)改變，并在下一次信號(hào)來臨前穩(wěn)定維持當(dāng)前狀態(tài)。應(yīng)用自下而上的工程化思想，文中先后對重組酶和終止子進(jìn)行了單獨(dú)表征和組合表征，探究了二者之間的相互影響，篩選出了相互兼容的組合，成功實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞的單次、二次狀態(tài)切換。最后，此開關(guān)成功地被用于構(gòu)建生物七段譯碼器，顯示出了其較好的應(yīng)用潛力。

位點(diǎn)特異性重組酶，終止子，調(diào)控開關(guān)，狀態(tài)轉(zhuǎn)換

生命體中發(fā)生的許多生物過程都可以抽象為“開關(guān)” (Switch)[1]。如細(xì)胞分化時(shí)，某些外界信號(hào)觸發(fā)“分化開關(guān)”，使得干細(xì)胞基因選擇性表達(dá)以執(zhí)行特定功能。正常情況下，這種狀態(tài)切換是非常穩(wěn)定的。一旦發(fā)生，即使分化信號(hào)不再存在，細(xì)胞的狀態(tài)也不容易被逆轉(zhuǎn)，除非再次接受一組特定脫分化信號(hào)的刺激。一些構(gòu)象可改變的蛋白也具有“開關(guān)”的性質(zhì)，如光受體蛋白[2]、壓力[3]/電壓[4]/配體[5]門控離子的通道蛋白等。當(dāng)外界信號(hào)(光、小分子物質(zhì)、電位差) 存在時(shí)，蛋白被活化以執(zhí)行功能，當(dāng)外界信號(hào)不復(fù)存在時(shí)蛋白立即變?yōu)槭Щ顮顟B(tài)。

目前在合成生物學(xué)領(lǐng)域，多種自然或人工的“開關(guān)”已經(jīng)投入生物學(xué)應(yīng)用中，如誘導(dǎo)型啟動(dòng) 子[6]、光敏離子通道[7-8]、Toehold Switch[9]等。這些開關(guān)大多需要輸入信號(hào)的維持才可保持在開啟狀態(tài)，這個(gè)過程會(huì)不斷地消耗能量，狀態(tài)維持往往依賴于細(xì)胞內(nèi)蛋白、核酸分子等的濃度維持在某一平衡濃度，外界干擾諸如細(xì)胞分裂，細(xì)胞缺乏營養(yǎng)等很容易打破平衡，雖然這些開關(guān)已經(jīng)用于多種場景，但它們難以像細(xì)胞分化那樣進(jìn)行穩(wěn)定的、自身可持續(xù)的狀態(tài)切換。

上述依賴外界信號(hào)維持狀態(tài)的“開關(guān)”具有一個(gè)共同特點(diǎn)——狀態(tài)切換對應(yīng)著生物大分子結(jié)構(gòu)變化。我們可以想象，當(dāng)生物大分子的序列而不是結(jié)構(gòu)發(fā)生變化時(shí)，尤其是DNA序列發(fā)生變化時(shí)，“開關(guān)”造成的狀態(tài)切換將是穩(wěn)定的且是可自我維持的。

位點(diǎn)特異性重組酶 (Site-specific recombinases，SSRs) 介導(dǎo)的重組反應(yīng)被廣泛用于遺傳工程操作中來改變DNA序列，如著名的Cre/LoxP和Flp/FRT基因敲除系統(tǒng)。SSRs具有一對特異的識(shí)別位點(diǎn) (Recognition site)——attB位點(diǎn)和attP位點(diǎn)。根據(jù)重組位點(diǎn)的序列和排列的方向性，位點(diǎn)特異性重組有3種可能的結(jié)果，即整合(Integration)、切離(Excision) 和倒位(Inversion)，如圖1所示，當(dāng)兩位點(diǎn)反向位于同一DNA上時(shí)，將產(chǎn)生倒位生成attL位點(diǎn)和attR位點(diǎn)[11]。位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)可分為兩類：酪氨酸重組酶(Tyrosine recombinase) 和絲氨酸重組酶(Serine recombinase)，后者中的大絲氨酸重組酶亞家族的識(shí)別位點(diǎn)簡單且高度特異，且反應(yīng)方向控制嚴(yán) 格——只有當(dāng)重組定向性因子(Recombination directionality factor，RDF) 存在時(shí)才能識(shí)別attL與attR序列，逆轉(zhuǎn)上述反應(yīng)重新生成attB、attP位點(diǎn)[12]。

除了傳統(tǒng)的基因敲除，Timothy K. Lu研究團(tuán)隊(duì)利用重組酶整合單鏈DNA進(jìn)入基因組[13]或直接翻轉(zhuǎn)DNA序列[14]成功開發(fā)了多種DNA存儲(chǔ)器，使細(xì)胞以DNA序列為載體“記錄”外界事件。在醫(yī)療領(lǐng)域中，研究者通過在腸道益生菌中構(gòu)建這種存儲(chǔ)器，可以實(shí)現(xiàn)對腸道環(huán)境的檢測[15]。研究者可利用重組酶翻轉(zhuǎn)啟動(dòng)子、終止子、編碼序列等有功能基因元件構(gòu)建新型邏輯線路，使細(xì)胞能夠?qū)ν饨缧畔a(chǎn)生更復(fù)雜的響應(yīng)模式[14,16-17]。在此過程中一系列具有良好正交性的重組酶被篩選出來，如大絲氨酸重組酶亞家族的phiC31、Bxb1、TP901-1和酪氨酸家族的Int系列等[18]。

終止子是合成生物學(xué)中重要的元件，可用于終止轉(zhuǎn)錄、基因線路間的絕緣等。以其是否依賴于ρ因子可以分為兩類：依賴ρ因子的終止子需要額外的ρ因子終止轉(zhuǎn)錄[19]，不依賴ρ因子的終止子可利用自身形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)及polyU序列終止轉(zhuǎn)錄過程[20]。此外，根據(jù)是否在兩個(gè)轉(zhuǎn)錄方向上均具有轉(zhuǎn)錄終止能力可分為雙向(Bidirectional)終止子[21]和單向(Unidirectional) 終止子。2013年Chen等報(bào)道了其表征的來自大腸桿菌的和人工設(shè)計(jì)的共計(jì)582個(gè)終止子的元件庫[22]，我們可以從這個(gè)庫中挑選適合的終止子用于轉(zhuǎn)錄調(diào)控開關(guān)的設(shè)計(jì)。

圖1 當(dāng)兩個(gè)識(shí)別位點(diǎn)排列方式不同時(shí)重組酶表現(xiàn)插入/刪除/翻轉(zhuǎn)效應(yīng)

在本研究中，我們利用位點(diǎn)特異性重組酶的倒位效應(yīng)翻轉(zhuǎn)終止子，構(gòu)建了一種穩(wěn)定的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)調(diào)控開關(guān)。首先我們單獨(dú)表征了終止子和重組酶的性能：通過測試正向反向接入時(shí)的轉(zhuǎn)錄終止能力從終止子庫中篩選出單向強(qiáng)終止子；通過測試重組酶的翻轉(zhuǎn)效率得到最優(yōu)的重組酶-RBS-誘導(dǎo)物濃度組合。然后我們分別將一對、兩對重組酶識(shí)別序列引入終止子兩側(cè)?？紤]識(shí)別序列與終止子的互相影響，我們再次測試了轉(zhuǎn)錄終止能力，篩選并表征了多組兼容的組合。接著，使用相應(yīng)的重組酶作用于這些組合成功地實(shí)現(xiàn)了“開關(guān)”功能，并表征了此系統(tǒng)的性能。最后，通過組合上述開關(guān)制成了“生物七段譯碼器”，實(shí)現(xiàn)了數(shù)字顯示圖像的切換。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

TOP10，購自北京博邁德基因技術(shù)有限公司。

pTAC-pSB4C5 (pSC101 ori，repA，CmR，lacⅠ，pTAC，RiboJ，sfGFP)，由pSB4C5質(zhì)粒(parts.igem. org/Part:pSB4C5)改造而成，IPTG誘導(dǎo)后可表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白。RiboJ作為絕緣子防止RBS上游非翻譯區(qū)對翻譯的影響[23]。啟動(dòng)子和RBS間可連入終止子及重組酶識(shí)別位點(diǎn)，用于表征終止子性能，或作為重組酶的作用靶標(biāo)，以實(shí)現(xiàn)狀態(tài)切換的開關(guān)功能，作為“報(bào)告質(zhì)?！?，保存于本實(shí)驗(yàn)室。

pBAD誘導(dǎo)表達(dá)質(zhì)粒(ColE1 ori，KanR，AraC，pBAD，RBS，Recombinase)，作為“表達(dá)系統(tǒng)”在阿拉伯糖誘導(dǎo)下表達(dá)重組酶，為狀態(tài)切換提供驅(qū)動(dòng)力。RBS序列插入位點(diǎn)兩端含一對BⅠ位點(diǎn)，用于更換RBS以探尋最適重組酶表達(dá)量。保存于本實(shí)驗(yàn)室。

pTAC誘導(dǎo)表達(dá)質(zhì)粒(p15A ori，AmpR，LacI，pTAC，RBS，Recombinase)，在IPTG誘導(dǎo)下表達(dá)重組酶，功能與pBAD誘導(dǎo)表達(dá)載體相同。保存于本實(shí)驗(yàn)室。

重組酶測試質(zhì)粒(pSC101 ori，CmR，RFP，attB，pTAC，GFP)，用來表征重組酶效率。包含一個(gè)可以被翻轉(zhuǎn)的pTAC啟動(dòng)子，翻轉(zhuǎn)前后分別表達(dá)綠色、紅色熒光蛋白。保存于本實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 主要試劑

LB培養(yǎng)基與M9培養(yǎng)基。質(zhì)粒小提試劑盒(康寧生命科學(xué)(吳江) 有限公司)。膠回收試劑盒(天根生化科技(北京) 有限公司)。2×EasyPCR SuperMix (北京全式金生物技術(shù)有限公司)。T4 DNA連接酶和限制性內(nèi)切酶RⅠ、Ⅰ、Ⅰ、Ⅰ，BⅠ(NEB)。誘導(dǎo)物：IPTG、阿拉伯糖。

1.2 方法

1.2.1 終止子性能的表征

初步選擇：我們根據(jù)已有的對自然及人工終止子的表征數(shù)據(jù)[22]初步選擇一些具有較強(qiáng)轉(zhuǎn)錄終止能力的終止子進(jìn)行進(jìn)一步測試。

質(zhì)粒構(gòu)建：終止子性能表征的基因線路如圖2A所示。利用先合成單鏈寡核苷酸再退火的方法得到一雙鏈DNA片段，其兩端含有Ⅰ位點(diǎn)，中間是一段隨機(jī)序列的雙鏈DNA片段。該序列與普通終止子長度相似(50 bp)，含50%GC，已證明對轉(zhuǎn)錄無影響[14]。利用RⅠ、Ⅰ雙酶切pTAC-pSB4C5質(zhì)粒并膠回收，連入上述短片段。得到的質(zhì)?？梢岳肎olden Gate assembly 法一步快速替換隨機(jī)序列為各種終止子。同時(shí)，由于此處隨機(jī)序列可認(rèn)為不影響轉(zhuǎn)錄，故此質(zhì)?？勺鳛榻K止子表征時(shí)的陽性對照。對于每一個(gè)候選終止子，利用先合成單鏈寡核苷酸再退火的方法，分別得到其正向(Forward，F(xiàn)) 與反向(Reverse，R) 雙鏈DNA片段(規(guī)定正向?yàn)槠湓谏矬w中自然存在方向或能發(fā)揮轉(zhuǎn)錄終止功能的方向)。該片段中，終止子序列兩端設(shè)計(jì)有Ⅰ酶切位點(diǎn)。利用Golden Gate assembly法將片段插入前述質(zhì)粒中。分別在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子后與sfGFP上設(shè)計(jì)引物，菌落PCR后測序檢測是否成功連入。

誘導(dǎo)培養(yǎng)：挑平板菌落于含抗生素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃、250 r/min振蕩培養(yǎng)12 h。取培養(yǎng)物1∶100稀釋于深孔板中，37 ℃、1 500 r/min培養(yǎng)2 h。取少量培養(yǎng)物用含抗生素的 M9培養(yǎng)基1∶100稀釋于另一深孔板中，加入IPTG設(shè)置終濃度為0.01 mmol/L、0.1 mmol/L和1 mmol/L，同上條件培養(yǎng)6 h。取少量培養(yǎng)物用含2 mg/mL卡那霉素或35 μg/mL氯霉素的PBS緩沖液1∶5稀釋于96孔板中，以抑制蛋白質(zhì)生成。空白對照組為不轉(zhuǎn)上述質(zhì)粒并經(jīng)過相同培養(yǎng)步驟的.TOP10。

流式細(xì)胞儀檢測：用流式細(xì)胞儀(BD LSRFortessa?) 的488 nm激發(fā)光檢測細(xì)胞的綠色熒光強(qiáng)度，設(shè)置進(jìn)樣體積(Injection volumn) 為15 μL，流速(Flow rate) 為1 μL/s，每孔樣品最小樣本量為10 000個(gè)細(xì)胞。流式數(shù)據(jù)用FlowJo?軟件分析得到熒光強(qiáng)度平均值。

表征：各組樣品平均值減去通過空白對照組測得的本底熒光，得到凈熒光強(qiáng)度。定義終止子強(qiáng)度(Terminator strength，Ts) 為陽性對照(含不阻止轉(zhuǎn)錄的隨機(jī)序列)的熒光強(qiáng)度([GFP]random) 與實(shí)驗(yàn)組(含終止子) 熒光強(qiáng)度([GFP]ter) 的比值。

該值越大表明終止子的轉(zhuǎn)錄終止能力越強(qiáng)。若 反向接入時(shí)該值小于1說明終止子是個(gè)潛在的啟動(dòng)子[24] (Cryptic promoter)。通過計(jì)算每一終止子的正 向與反向Ts的比值來驗(yàn)證終止子是否為單向的(Unidirectional)，該值越大說明終止子正反向接入的作用差異越大，更具有“開關(guān)”的性質(zhì)?；谝陨蟽蓚€(gè)計(jì)算值，我們制定了終止子的篩選標(biāo)準(zhǔn)：正反向的Ts值均大于0.9 (沒有潛在啟動(dòng)子)；正反向Ts比值大 于10 (ON、OFF狀態(tài)差異足夠明顯)；正反向中較 大的Ts大于10(OFF狀態(tài)時(shí)基因表達(dá)受嚴(yán)格抑制)；正反向中較小的Ts不大于1.2 (ON狀態(tài)時(shí)基因表達(dá) 基本不被抑制)。滿足標(biāo)準(zhǔn)的終止子進(jìn)入下一步篩選。

1.2.2 重組酶翻轉(zhuǎn)效率的表征及表達(dá)系統(tǒng)的改進(jìn)

我們從RBS Calculator[25]和iGEM元件庫中得到了一系列RBS序列，先合成單鏈寡核苷酸再退火得到雙鏈DNA。利用Golden Gate assembly法更換RBS序列，構(gòu)建不同表達(dá)強(qiáng)度的pBAD誘導(dǎo)的Bxb1、phiC31重組酶表達(dá)質(zhì)粒和pTAC誘導(dǎo)的TP901-1、Int2重組酶表達(dá)質(zhì)粒。將其與重組酶測試質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入.TOP10中以構(gòu)建重組酶效率測試體系(圖3A)。在雙抗平板上挑取單菌落于LB培養(yǎng)基中37 ℃、1 000 r/min振蕩培養(yǎng)12 h。取2 μL菌液加入含抗生素和不同濃度誘導(dǎo)物(0、10–5、10–4、10–3、10–2、10–1、100、101、102mmol/L)的M9培養(yǎng)基中，深孔板37 ℃、1 000 r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)15 h。取2 μL培養(yǎng)物加入198 μL PBS中，用流式細(xì)胞儀測量誘導(dǎo)結(jié)果，通過統(tǒng)計(jì)細(xì)菌表型可以看到是否發(fā)生翻轉(zhuǎn)，利用FlowJo?軟件分析可得重組酶效率。

1.2.3 終止子兩側(cè)引入一對重組酶識(shí)別位點(diǎn)

終止子的轉(zhuǎn)錄終止能力依賴RNA形成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)?？紤]到重組酶識(shí)別序列會(huì)同樣具有特殊構(gòu)象，這不但會(huì)影響終止子功能，其本身也會(huì)對轉(zhuǎn)錄造成一定影響，我們進(jìn)行了第二輪篩選，以得到互相兼容的識(shí)別位點(diǎn)-終止子組合，基因線路如圖2B所示。

圖3 重組酶翻轉(zhuǎn)效率與表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)化

質(zhì)粒構(gòu)建：以1.2.1中pTAC-pSB4C5的酶切膠回收產(chǎn)物為載體，酶切連接法連入一短片段，得到的質(zhì)?？梢宰鳛椴迦胫亟M酶識(shí)別位點(diǎn)以及終止子的載體。為了方便高通量構(gòu)建，我們在兩個(gè)重組酶識(shí)別序列插入位點(diǎn)兩端各設(shè)計(jì)了一對BⅠ切割位點(diǎn)，終止子兩端設(shè)計(jì)了一對Ⅰ切割位點(diǎn)，這樣就可以用Golden Gate assembly法一步高效替換重組酶識(shí)別序列和終止子，形成不同組合。重組酶識(shí)別位點(diǎn)信息通過單鏈退火的方法得到(序列請見2017.igem.org/Team:Peking)。其余構(gòu)建、檢驗(yàn)步驟同1.2.1。陽性對照組含有某重組酶識(shí)別序列但終止子以隨機(jī)序列替代。誘導(dǎo)培養(yǎng)步驟與1.2.1相同。

酶標(biāo)儀檢測：我們采用酶標(biāo)儀(Thermo Scientific Varioskan?Flash) 粗測樣品的熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長485 nm、510 nm發(fā)射波長) 與值，取二者比值則為單位數(shù)量細(xì)菌的相對熒光強(qiáng)度。與1.2.1中的單細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度具有相同統(tǒng)計(jì)意義。公示表征步驟同1.2.1。篩選得到表現(xiàn)良好的組合做進(jìn)一步篩選。

1.2.4 終止子兩側(cè)引入兩對重組酶識(shí)別位點(diǎn)

產(chǎn)生多種狀態(tài)需要重組酶的多次作用，故需要多對重組酶識(shí)別位點(diǎn)。兩對識(shí)別位點(diǎn)將對終止子的開關(guān)性能產(chǎn)生更大影響，故需要進(jìn)一步表征篩選。含兩對識(shí)別位點(diǎn)的報(bào)告質(zhì)粒如圖2C所示。

質(zhì)粒構(gòu)建：將pTAC-pSB4C5的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子刪除，更換為組成型表達(dá)的J23119啟動(dòng)子。合成一段雙鏈DNA片段連入該質(zhì)粒。該片段含兩對嵌套的重組酶位點(diǎn)與一個(gè)終止子。外側(cè)的重組酶位點(diǎn)固定為一表征較好的高效重組酶，內(nèi)側(cè)位點(diǎn)及終止子按1.2.2設(shè)計(jì)并可以更換。誘導(dǎo)培養(yǎng)、酶標(biāo)儀檢測、公式表征步驟同1.2.2。

1.2.5 重組酶翻轉(zhuǎn)終止子性能表征

兩次翻轉(zhuǎn)：將報(bào)告質(zhì)粒與對應(yīng)的兩個(gè)重組酶表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入.TOP10中，三抗平板上培養(yǎng)。其他步驟同一次翻轉(zhuǎn)。

1.2.6 演示：七段譯碼器三狀態(tài)轉(zhuǎn)換

由1.2.3和1.2.5的實(shí)驗(yàn)，我們得到了基于重組酶翻轉(zhuǎn)作用和終止子的基因“開關(guān)”。當(dāng)終止子兩側(cè)引入兩對識(shí)別位點(diǎn)時(shí)，意味著可以通過控制兩種重組酶表達(dá)，對終止子進(jìn)行兩次翻轉(zhuǎn)。算上初始狀態(tài)，該開關(guān)可以產(chǎn)生3個(gè)狀態(tài)(即“開-關(guān)-開”或“關(guān)-開-關(guān)”)。

電子器件中常見的七段譯碼器示數(shù)變化“1-2-3”可作為上述過程的形象演示。如圖5A所示，利用1.1.1–1.2.5的材料與方法我們可以在96孔板上實(shí)現(xiàn)“生物基的七段譯碼器”?？紤]每個(gè)顯示管的明暗變化順序，7個(gè)顯示管有5種狀態(tài)轉(zhuǎn)換模式(000、111、011、010、101，0、1分別代表暗、亮)，因此要使用5種報(bào)告質(zhì)粒與重組酶表達(dá)質(zhì)粒的組合。每次手動(dòng)狀態(tài)切換時(shí)，將上一狀態(tài)的菌液1∶100稀釋于含相應(yīng)抗生素和誘導(dǎo)物(依次10 mmol/L阿拉伯糖、0.1 mmol/L IPTG) 的M9培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)12 h得到后一狀態(tài)。誘導(dǎo)結(jié)束后依據(jù)1.2.2中方法得到單位數(shù)量細(xì)菌的熒光強(qiáng)度，并在藍(lán)光板上對其拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 終止子性能的表征

共選取24個(gè)已報(bào)道的強(qiáng)力終止子納入我們的系統(tǒng)中進(jìn)行表征(序列請見2017.igen.org/Team:Peking)。

比較4個(gè)IPTG濃度梯度下的Ts，我們發(fā)現(xiàn)隨誘導(dǎo)物濃度加大，對于具有較強(qiáng)轉(zhuǎn)錄終止能力的終止子方向，其Ts總體呈現(xiàn)先迅速上升后略微下降的趨勢。若某一方向轉(zhuǎn)錄終止能力弱，變化趨勢則不明顯(圖2D嵌入圖以強(qiáng)力終止子435的Ts隨誘導(dǎo)物濃度變化的趨勢為例)。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)高濃度誘導(dǎo)物會(huì)對細(xì)胞產(chǎn)生一定代謝負(fù)擔(dān)和毒性，故選擇0.1 mmol/L IPTG為最終誘導(dǎo)濃度。24個(gè)終止子依據(jù)其正反向Ts可分為單向終止子與雙向終止子(圖2D)。我們最終得到了6個(gè)符合前述4條標(biāo)準(zhǔn)的終止子(435、322、309、221、836、855)，其中435表現(xiàn)最佳，正向Ts高于1 000，反向Ts接近1，是典型的單向強(qiáng)終止子。

2.2 重組酶翻轉(zhuǎn)效率的表征及表達(dá)系統(tǒng)改進(jìn)

我們所應(yīng)用的RBS來源于RBS calculator[25]和iGEM網(wǎng)站(序列請見2017.igem.org/Team:Peking，純數(shù)字代號(hào)的來自RBS calculator，“B00XX”來自iGEM Parts，“字母+數(shù)字”由B0034突變獲得)。圖3B顯示測試質(zhì)粒被重組酶翻轉(zhuǎn)前后流式細(xì)胞儀的測試結(jié)果，橫軸為紅色熒光強(qiáng)度，縱軸為綠色熒光強(qiáng)度。翻轉(zhuǎn)前細(xì)胞位于對角線以上，主要表達(dá)GFP，翻轉(zhuǎn)后細(xì)胞位于對角線下，主要表達(dá)RFP。我們把誘導(dǎo)表達(dá)重組酶后對角線下的細(xì)胞比例定義為重組酶效率。重組酶和phiC31利用各個(gè)RBS在不同阿拉伯糖誘導(dǎo)濃度下的效率如圖3C所示。我們發(fā)現(xiàn)在不加誘導(dǎo)物時(shí)均有一定程度泄露表 達(dá)，低濃度誘導(dǎo)物時(shí)重組酶效率變化不大，但在10 mmol/L時(shí)效率有一個(gè)階躍式上升，最高可達(dá)90%左右。IPTG誘導(dǎo)也有類似的結(jié)果。因此選擇10 mmol/L阿拉伯糖和0.1 mmol/L IPTG作為最 適誘導(dǎo)濃度。進(jìn)而測試了各重組酶在最適誘導(dǎo)濃度下應(yīng)用不同RBS時(shí)的效率(圖3D)，最終選擇878、1 668、A6分別作為Bxb1、TP901-1、phiC31的RBS，因?yàn)槠湫孤遁^低，最適誘導(dǎo)濃度時(shí)效率較高。

2.3 終止子兩側(cè)引入一對重組酶識(shí)別位點(diǎn)

單獨(dú)的重組酶位點(diǎn)也會(huì)對轉(zhuǎn)錄造成一定影響，可被視為“終止子”。測試的重組酶位點(diǎn)中，Int2有最強(qiáng)的“終止子”效應(yīng)(Ts=23.0)，甚至強(qiáng)于221F (Ts=16.6)。其他較為微弱：phiC31 (Ts=2.00)、TP901-1 (Ts=1.42)。

共測試了14個(gè)重組酶位點(diǎn)+終止子組合的Ts值(圖2E)。編號(hào)phiC31 435代表終止子ECK120034435兩側(cè)有重組酶phiC31的識(shí)別序列，其他以此類推。在所有組合中，int2 221擁有最強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄終止效應(yīng)(Ts=35.3)。滿足標(biāo)準(zhǔn)的其他組合依次為phiC31 435 (28.3)、Bxb1 435 (21.1)、TP901-1 221 (17.7)、TP901-1 435 (17.3)、int2 855 (17.2)。

值得注意的是，重組酶識(shí)別序列與終止子的Ts并非為線性疊加關(guān)系。例如，int2與435F在識(shí)別序列與終止子中各自具有最大的Ts值，但是二者組合的Ts值在所有組合中最弱(Ts=5.37)。TP901-1與221F在識(shí)別序列與終止子中各自具有最小的Ts值，但是二者組合在一起效果則很強(qiáng)。此外，二者的組合可能在序列內(nèi)部形成啟動(dòng)子，比如TP901-1 221R。

考慮到int2與TP901-1的重組酶表達(dá)質(zhì)粒的啟動(dòng)子為pTAC，較pBAD泄露較大。我們選擇Bxb1 435與phiC31 435進(jìn)行1.2.5中的一次翻轉(zhuǎn)測試。

2.4 終止子兩側(cè)引入兩對重組酶識(shí)別位點(diǎn)

我們選取了翻轉(zhuǎn)效果較穩(wěn)定的重組酶Bxb1、 phiC31、TP901-1的識(shí)別位點(diǎn)，與終止轉(zhuǎn)錄效果最好的單向強(qiáng)終止子435組合在一起進(jìn)行性能表征，結(jié)果如圖2F所示。最終，我們選取了性能最好的組合結(jié)構(gòu)“Bxb1 attB-TP901-1 attB-435- TP901-1 attP-Bxb1 attP”和“Bxb1 attB-phiC31 attB-435-phiC31 attP-Bxb1 attP”進(jìn)行1.2.5中的兩次翻轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)。之后將其分別簡稱為Bxb1 TP901-1 435和Bxb1 phiC31 435。

2.5 重組酶翻轉(zhuǎn)終止子性能表征

將報(bào)告質(zhì)粒Bxb1 435和phiC31 435與相應(yīng)的pBAD誘導(dǎo)表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)進(jìn)行了重組酶一次翻轉(zhuǎn)終止子的實(shí)驗(yàn)(圖4A)。計(jì)算結(jié)果(圖4C)顯示有些翻轉(zhuǎn)效率 (Inversion efficiency)超過100%，有些則不足50%，與2.2.3中理想值偏差較大。經(jīng)過分析，可能存在如下原因：第一，attB-F-attP經(jīng)過翻轉(zhuǎn)得到attL-R-attR，而不是我們計(jì)算inversion efficiency所使用的attB-R-attP的理想狀態(tài)；第二，重組酶作用于pTAC-pSB4C5質(zhì)粒翻轉(zhuǎn)終止子的效率與2.2.2中重組酶作用于重組酶測試質(zhì)粒翻轉(zhuǎn)啟動(dòng)子的效率存在不同，可能是終止子影響識(shí)別位點(diǎn)的空間結(jié)構(gòu)，造成翻轉(zhuǎn)效率的變化。

兩次翻轉(zhuǎn)使用報(bào)告質(zhì)粒Bxb1 TP901-1 435和Bxb1 phiC31 435及其對應(yīng)的重組酶表達(dá)質(zhì)粒(圖4B)，得到的結(jié)果如圖4D所示。

2.6 演示：七段譯碼器三狀態(tài)轉(zhuǎn)換

依照1.2.6我們得到了圖5B所示的結(jié)果。每個(gè)加樣孔中的數(shù)字代表單位的熒光強(qiáng)度。單憑肉眼可以觀察到較為明顯的狀態(tài)變化，數(shù)字圖案清晰可辨，視覺上成功實(shí)現(xiàn)了生物七段譯碼器。數(shù)據(jù)上若以50作為定義開關(guān)狀態(tài)轉(zhuǎn)換的閾值，亦可判定實(shí)驗(yàn)的成功。

圖4 重組酶翻轉(zhuǎn)終止子的效率

圖5 生物七段譯碼器

3 結(jié)論

本研究通過組合重組酶識(shí)別位點(diǎn)和終止子構(gòu)建了一種穩(wěn)定可維持的轉(zhuǎn)錄調(diào)控開關(guān)。該開關(guān)可以作為一個(gè)組件，模塊化地應(yīng)用于基因線路構(gòu)建中，使細(xì)胞可以感受短暫的脈沖信號(hào)從而改變自身狀態(tài)。通過細(xì)致的表征，我們發(fā)現(xiàn)了重組酶識(shí)別位點(diǎn)和終止子之間的相互影響是開關(guān)設(shè)計(jì)的一個(gè)瓶頸，從而揭示了此類開關(guān)的重要設(shè)計(jì)原則——尋找相互影響較小的終止子和識(shí)別位點(diǎn)，為大規(guī)模設(shè)計(jì)此類開關(guān)提供了一種思路。

我們通過依次表達(dá)兩個(gè)重組酶作用于終止子兩側(cè)的兩對識(shí)別位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了兩次狀態(tài)切換。已有研究表明當(dāng)重組定向性因子(Recombination directionality factor，RDF)存在時(shí)，重組酶可識(shí)別attL與attR序列發(fā)生重組反應(yīng)，重新生成attB、attP位點(diǎn)。因此，本開關(guān)的一種優(yōu)化方式是引入RDF，使得只需要一種重組酶、一對識(shí)別位點(diǎn)便可實(shí)現(xiàn)兩次狀態(tài)轉(zhuǎn)換。這將避免多對識(shí)別位點(diǎn)對終止子的影響，提高本開關(guān)的性能。

如果要使這種狀態(tài)轉(zhuǎn)換自動(dòng)化，創(chuàng)造更復(fù)雜的基因線路，可以在此系統(tǒng)中引入“計(jì)時(shí)器”。例如利用基于三因子負(fù)反饋的生物振蕩器[26]節(jié)律表達(dá)重組酶及其RDF，作用于經(jīng)過設(shè)計(jì)的含此類開關(guān)的基因線路，理論上可以實(shí)現(xiàn)循環(huán)的狀態(tài)轉(zhuǎn)換過程。

此外，本研究具有較大的應(yīng)用價(jià)值。工業(yè)上，可以利用此類狀態(tài)開關(guān)可設(shè)計(jì)的次序性，讓一種工程菌在發(fā)酵罐中依次合成不同產(chǎn)物，例如含有多種單體的高分子化合物的生物合成。醫(yī)療上，可以設(shè)計(jì)一種含此種開關(guān)的益生菌，使之在患者體內(nèi)在合適的時(shí)間按一定次序給藥?；A(chǔ)研究中，此類開關(guān)能夠?yàn)橥ㄟ^“建物致知”的策略為研究細(xì)胞周期與生物節(jié)律提供新的思路和方法。

[1] Bittner M. A window on the dynamics of biological switches. Nat Biotechnol, 2005, 23(2): 183–184.

[2] Pathak GP, Strickland D, Vrana JD, et al. Benchmarking of optical dimerizer systems. ACS Synth Biol, 2014, 3(11): 832–838.

[3] Martinac B, Buechner M, Delcour AH, et al. Pressure-sensitive ion channel in. Proc Natl Acad Sci USA, 1987, 84(8): 2297–2301.

[4] Payandeh J, Scheuer T, Zheng N, et al. The crystal structure of a voltage-gated sodium channel. Nature, 2011, 475(7356): 353–358.

[5] Jensen AA, Spalding A. Allosteric modulation of G-protein coupled receptors. Eur J Pharm Sci, 2004, 21(4): 407–420.

[6] Xu YQ, Ma CQ, Tao F, et al. Bacterial promoter recognition and application. Chin J Biotech, 2010, 26(10): 1393–1403 (in Chinese). 徐友強(qiáng), 馬翠卿, 陶飛, 等. 細(xì)菌啟動(dòng)子識(shí)別及應(yīng)用研究進(jìn)展. 生物工程學(xué)報(bào), 2010, 26(10): 1393–1403.

[7] Boyden ES, Zhang F, Bamberg E, et al. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neurosci, 2005, 8(9): 1263–1268.

[8] Levskaya A, Chevalier AA, Tabor JJ, et al. Synthetic biology: engineeringto see light. Nature, 2005, 438(7067): 441–442.

[9] Green AA, Silver PA, Collins JJ, et al. Toehold switches:--designed regulators of gene expression. Cell, 2014, 159(4): 925–939.

[10] Hasty J, Pradines J, Dolnik M, et al. Noise-based switches and amplifiers for gene expression. Proc Natl Acad Sci USA, 2000, 97(5): 2075–2080.

[11] Grindley NDF, Whiteson KL, Rice PA. Mechanisms of site-specific recombination. Annu Rev Biochem, 2006, 75: 567–605.

[12] Lewis JA, Hatfull GF. Control of directionality in integrase-mediated recombination: examination of recombination directionality factors (RDFs) including Xis and Cox proteins. Nucleic Acids Res, 2001, 29(11): 2205–2216.

[13] Farzadfard F, Lu TK. Genomically encoded analog memory with preciseDNA writing in living cell populations. Science, 2014, 346(6211): 1256272.

[14] Siuti P, Yazbek J, Lu TK. Synthetic circuits integrating logic and memory in living cells. Nat Biotechnol, 2013, 31(5): 448–452.

[15] Mimee M, Tucker AC, Voigt CA, et al. Programming a Human commensal bacterium,, to sense and respond to stimuli in the murine gut microbiota. Cell Syst, 2015, 1(1): 62–71.

[16] Bonnet J, Yin P, Ortiz ME, et al. Amplifying genetic logic gates. Science, 2013, 340(6132): 599–603.

[17] Roquet N, Soleimany AP, Ferris AC, et al. Synthetic recombinase-based state machines in living cells. Science, 2016, 353(6297): aad8559.

[18] Yang L, Nielsen AAK, Fernandezrodriguez J, et al. Permanent genetic memory with >1-byte capacity. Nat Methods, 2014, 11(12): 1261–1266.

[19] Epshtein V, Dutta D, Wade J, et al. An allosteric mechanism of Rho-dependent transcription termination. Nature, 2010, 463(7278): 245–249.

[20] Adhya S, Gottesman M. Control of transcription termination. Annu Rev Biochem, 1978, 47: 967–996.

[21] Postle K, Good RF. A bidirectional rho-independent transcription terminator between the.gene and an opposing gene. Cell, 1985, 41(2): 577–585.

[22] Chen YJ, Liu P, Nielsen AAK, et al. Characterization of 582 natural and synthetic terminators and quantification of their design constraints. Nature Methods, 2013, 10(7): 659–664.

[23] Lou CB, Stanton B, Chen YJ, et al. Ribozyme-based insulator parts buffer synthetic circuits from genetic context. Nat Biotechnol, 2012, 30(11): 1137–1142.

[24] Brophy JA, Voigt CA. Antisense transcription as a tool to tune gene expression. Mol Syst Biol, 2016, 12(1): 854.

[25] Salis HM, Mirsky EA, Voigt CA. Automated design of synthetic ribosome binding sites to control protein expression. Nat Biotechnol, 2009, 27(10): 946–950.

[26] Elowitz MB, Leibler S. A synthetic oscillatory network of transcriptional regulators. Nature, 2000, 403(6767): 335–338.

團(tuán)隊(duì)簡介：

2017年北京大學(xué)iGEM團(tuán)隊(duì)由來自生命科學(xué)學(xué)院、信息科學(xué)技術(shù)學(xué)院、醫(yī)學(xué)部共13名在校本科生組成。北大iGEM團(tuán)隊(duì)提出了一套在細(xì)菌內(nèi)搭建遺傳時(shí)序邏輯線路，使其能夠自動(dòng)按順序執(zhí)行對應(yīng)功能的設(shè)計(jì)框架，充分借鑒了數(shù)字理論中時(shí)序邏輯概念，在生物系統(tǒng)中構(gòu)建時(shí)鐘 (Clock)、分頻器 (Frequency Divider)、解釋器 (Interpreter) 三個(gè)基本模塊?；谥亟M酶和終止子元件所實(shí)現(xiàn)的細(xì)胞狀態(tài)調(diào)控便是其核心內(nèi)容之一。北大iGEM團(tuán)隊(duì)在2017年iGEM大賽中獲得了最佳信息處理項(xiàng)目獎(jiǎng)提名 (Nominated Best Information Processing Project)，并獲得金牌。

(本文責(zé)編 郝麗芳)

Design of recombinase and terminator-based genetic switches for cell state control

Songyuan Zhang1*, Jianhui Qiu1*, Xuan Wang2, Yiming Dong1, Yulong Li1, Yihao Zhang1, and Qi Ouyang1

1 Center for Quantitative Biology and Center for Life Sciences, Peking University, Beijing 100871, China 2 Center for Life Sciences, Tsinghua-Peking Center for Life Sciences, Tsinghua University, Beijing 100084, China

Various genetic switches have been developed to let engineered cells perform designed functions. However, a sustained input is often needed to maintain the on/off state, which is energy-consuming and sensitive to perturbation. Therefore, we developed a set of transcriptional switches for cell states control that were constructed by the inversion effect of site-specific recombinases on terminators. Such a switch could respond to a pulse signal and maintain the new state by itself until the next input. With a bottom-up design principle, we first characterized the terminators and recombinases. Then the mutual interference was studied to select compatible pairs, which were used to achieve one-time and two-time state transitions. Finally, we constructed a biological seven-segment display as a demonstration to prove such switch’s immense potential for application.

site-specific recombinase, terminator, genetic switch, state transition

June 30, 2018;

October 22, 2018

Talent Training Program, Educational and Teaching Reform Project of Central College.

Yihao Zhang. Tel/Fax: +86-10-62744020; E-mail: yihaozhang@pku.edu.cn

Qi Ouyang. Tel/Fax: +86-10-62744020; E-mail: qi@pku.edu.cn

10.13345/j.cjb.180270

*These authors contributed equally to this study.

中央高校教育教學(xué)改革拔尖人才培養(yǎng)項(xiàng)目資助。