人源抗ICAM-1單鏈抗體的制備及其生物學(xué)活性鑒定

陳云雨，孫紅，劉剛，胡華波，張國利，劉曉平，岳玉環(huán)

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人源抗ICAM-1單鏈抗體的制備及其生物學(xué)活性鑒定

陳云雨1,2，孫紅2,3，劉剛1，胡華波1，張國利2，劉曉平1，岳玉環(huán)2

1 皖南醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院 新藥篩選與評價中心，安徽 蕪湖 241002 2 軍事醫(yī)學(xué)研究院 軍事獸醫(yī)研究所，吉林 長春 130122 3 黑龍江生物科技職業(yè)學(xué)院 生物制藥系，黑龍江 哈爾濱 150025

陳云雨, 孫紅, 劉剛, 等. 人源抗ICAM-1單鏈抗體的制備及其生物學(xué)活性鑒定. 生物工程學(xué)報(bào), 2018, 34(12): 2016–2024.Chen YY, Sun H, Liu G, et al. Preparation and identification of anti-human ICAM-1 scFv. Chin J Biotech, 2018, 34(12): 2016–2024.

利用噬菌體展示技術(shù)篩選特異性人源抗ICAM-1單鏈抗體（Anti-human ICAM-1 scFv）并進(jìn)行生物學(xué)活性鑒定。應(yīng)用Tomlinson I+J噬菌體抗體庫，以P1抗原肽為包被抗原，經(jīng)過4輪“吸附-洗脫-擴(kuò)增”進(jìn)行親和富集篩選。以PCR反應(yīng)、ELISA抗原交叉反應(yīng)和Dot blotting實(shí)驗(yàn)進(jìn)行陽性克隆的鑒定。scFv經(jīng)原核表達(dá)和分離純化后，以Western blotting實(shí)驗(yàn)、競爭ELISA實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞黏附抑制實(shí)驗(yàn)對其生物學(xué)活性進(jìn)行初步鑒定。Tomlinson I+J噬菌體抗體庫經(jīng)4輪親和富集篩選，利用ELISA方法成功篩出4株陽性克隆。通過PCR鑒定反應(yīng)、ELISA抗原交叉反應(yīng)和Dot blotting實(shí)驗(yàn)，最終獲得了1株既能與P1抗原肽特異結(jié)合又能與人ICAM-1抗原特異結(jié)合的陽性克隆J-A1。對scFv進(jìn)行原核表達(dá)和親和層析后獲得了高純度的目的蛋白。競爭ELISA實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞黏附抑制實(shí)驗(yàn)證實(shí)純化的scFv具有良好的親和活性和抗細(xì)胞黏附活性。文中成功利用噬菌體展示技術(shù)篩選到特異性人源抗ICAM-1 scFv，為進(jìn)一步探索該抗體在炎癥相關(guān)性疾病治療中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

噬菌體展示技術(shù)，細(xì)胞間黏附分子，ICAM-1，單鏈抗體，人源化抗體

細(xì)胞間黏附分子-1 (Intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1) 廣泛表達(dá)于多種細(xì)胞表面，屬于免疫球蛋白超家族成員，是由膜外區(qū)、跨膜區(qū)和胞漿區(qū)組成的跨膜糖蛋白。在細(xì)胞生理狀態(tài)時，ICAM-1處于低水平表達(dá)；當(dāng)細(xì)胞受到致炎因子刺激后，ICAM-1表達(dá)量明顯增加。通過與淋巴細(xì)胞功能性相關(guān)抗原(Lymphocyte functional antigen-1，LFA-1) 結(jié)合，介導(dǎo)粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，促進(jìn)白細(xì)胞游走和趨化于炎癥病灶，加重病理損傷，在炎癥性疾病的發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮重要作用，已經(jīng)成為炎癥相關(guān)性疾病治療的新靶標(biāo)[1-4]。利用重組抗體封閉ICAM-1生物學(xué)功能，減輕并改善病理性炎癥損傷已經(jīng)成為抗炎治療的重要策略。目前，應(yīng)用抗ICAM-1單克隆抗體療法對移植排斥反應(yīng)、自身免疫性疾病、多發(fā)性骨髓瘤、糖尿病腎病、潰瘍性結(jié)腸炎等多種疾病的治療已經(jīng)取得了較好的療效[5-7]。

與傳統(tǒng)的嵌合抗體相比，單鏈抗體(Single chain fragment variable，scFv) 不僅保持親本抗體的特異性、載體性和靶向性特點(diǎn)，還具有分子量小、免疫原性低、組織穿透力強(qiáng)和易于改造等諸多優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為重組抗體領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[8-9]。郝文波等利用抗ICAM-1單克隆抗體對噬菌體十二肽庫進(jìn)行篩選，證實(shí)保守序列P1短肽(KLYLIAEGSVAA) 同樣具有天然ICAM-1的生物學(xué)功能[10]。本研究將P1短肽作為抗原，利用Tomlinson I+J噬菌體抗體庫，經(jīng)4輪“吸附-洗脫-擴(kuò)增”親和富集篩選人源抗ICAM-1 scFv，經(jīng)分離純化后，對其生物學(xué)活性進(jìn)行初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠抗ICAM-1單克隆抗體(Monoclonal antibody，McAb) 2C5由本實(shí)驗(yàn)室制備；P1抗原肽(KLYLIAEGSVAA)由上海強(qiáng)耀生物科技有限公司合成；Tomlinson I+J噬菌體抗體庫、輔助噬菌體KM13、TG1和HB2151由中國科學(xué)院過程工程研究所劉瑞田教授惠贈；c-Myc(9E10)-HRP購自Santa Cruz公司；脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)、胰酶、四甲基聯(lián)苯胺溶液(3,3?,5,5?-Tetramethylbenzidine，TMB) 和二氨基聯(lián)苯胺溶液(3,3?-Diaminobenzidine，DAB) 購自Sigma-Aldrich；2×Easy?酶、DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量購自TransGen公司；二辛可寧酸(Bicinchoninic acid，BCA) 蛋白濃度測定試劑盒購自Thermo公司；HisTrap親和層析柱購自GE公司；人ICAM-1抗原購自R/D公司；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 抗ICAM-1 scFv的親和富集篩選

將P1抗原肽(1 μg/孔) 包被96孔酶標(biāo)板，使用Tomlinson I+J噬菌體抗體庫(I庫庫容1.47×108；J庫庫容1.35×108；scFv產(chǎn)物含有c-Myc和His標(biāo)簽)，在96孔酶標(biāo)板中實(shí)施4輪“吸附-洗脫-擴(kuò)增”親和富集篩選過程。進(jìn)行第1輪篩選時，以含0.1% Tween-20的磷酸鹽(Phosphate buffered solution，PBS) 緩沖液(PBST) 洗板10次，第2輪及其以后的篩選中分別洗板20次，充分洗去非特異性吸附的噬菌體。洗滌后以胰酶室溫消化30 min，洗脫噬菌體。經(jīng)過“吸附-洗脫-擴(kuò)增”過程將每輪篩選所收集的噬菌體置于下一輪篩選條件中，從而使陽性噬菌體得到富集并計(jì)算每輪篩選的富集倍數(shù)。

1.2.2 陽性克隆的ELISA檢測

將第4輪親和富集篩選的陽性噬菌體感染HB2151后，從所涂布的TYE平板上隨機(jī)挑取單克隆菌落接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(含 100 μg/mL Amp和1%葡萄糖的2×TY培養(yǎng)基)培養(yǎng)過夜。次日從該板上轉(zhuǎn)接2 μL菌液至第二塊96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(含100 μg/mL Amp和0.1%葡萄糖的2×TY培養(yǎng)基)，37 ℃培養(yǎng)至600約為0.9時加入1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)，30 ℃培養(yǎng)過夜。次日離心取上清進(jìn)行陽性克隆菌株的ELISA檢測。

在ELISA檢測中，以P1抗原肽(1 μg/孔) 包被96孔酶標(biāo)板，以包被1 μg牛血清白蛋白(Bull serum albumin，BSA) 作為陰性對照。酶標(biāo)板經(jīng)2%脫脂奶粉(Skim milk) 封閉后，每孔加入50 μL誘導(dǎo)上清，室溫孵育1 h。PBST洗滌3次后，每孔加入1∶500稀釋的c-Myc(9E10)-HRP抗體，室溫孵育1 h。再以PBST洗板3次后，每孔加入TMB底物溶液避光顯色，然后加入2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀測定450值。每份樣品做雙孔測定，取平均值。陽性克隆菌株確定標(biāo)準(zhǔn)：值為陰性對照值3倍以上。

1.2.3 PCR鑒定陽性克隆

按照pIT-2載體基因序列，合成兩條引物擴(kuò)增基因片段。P1：5?-CAGGAAACAGCTATGA C-3?；P2：5?-CTATGCGGCCCCATTCA-3?。

PCR反應(yīng)體系如下：引物P1 (10 μmol/L) 和P2 (10 μmol/L) 各0.5 μL，陽性克隆菌液1 μL，2×Easy?10 μL，再用無菌蒸餾水補(bǔ)足體積至20 μL。

PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s、54 ℃ 30 s、72 ℃ 60 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增結(jié)果。

1.2.4 陽性克隆的ELISA抗原交叉反應(yīng)實(shí)驗(yàn)

分別以P1抗原肽(1 μg/孔)、3%牛血清白蛋白(BSA) 和2%脫脂奶粉(Milk) 包被96孔酶標(biāo)板，4 ℃過夜。次日，每孔分別加入PCR鑒定含有完整基因片段的陽性克隆誘導(dǎo)的上清進(jìn)行ELISA抗原交叉反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)步驟如1.2.2所述。

1.2.5 Dot blotting實(shí)驗(yàn)鑒定陽性克隆

將硝酸纖維素膜置于平皿中，以1 μL人ICAM-1抗原(1.0 mg/mL) 在硝酸纖維素膜中央點(diǎn)樣。經(jīng)2%脫脂奶粉封閉后，加入500 μL 經(jīng)抗原交叉反應(yīng)實(shí)驗(yàn)鑒定的陽性克隆誘導(dǎo)的上清，以牛血清白蛋白(BSA) 為陰性對照，37 ℃孵育 2 h。PBST洗滌3次后，每孔加入1∶500稀釋的c-Myc(9E10)-HRP抗體，37 ℃孵育1 h。再以PBST洗滌3次，以DAB溶液顯色。

1.2.6 抗ICAM-1 scFv的分離純化與Western blotting鑒定

將J-A1工程菌接種于500 mL 2×TY培養(yǎng)基(含100 μg/mL Amp+0.1%葡萄糖) 中進(jìn)行scFv的誘導(dǎo)表達(dá)(1.0 mmol/L IPTG，30 ℃誘導(dǎo)16 h)。離心收集上清，以40%飽和硫酸銨沉淀目的蛋白，用20 mL平衡液(25 mmol/L Tris，0.5 mol/L NaCl，pH 7.5) 稀釋后，制備粗提液。將HisTrap親和層析柱以平衡液進(jìn)行平衡后。以0.5 mL/min上樣，再以平衡液洗脫流穿峰至基線。最后以洗脫液(25 mmol/L Tris，0.5 mol/L NaCl，200 mmol/L 咪唑，pH 7.5) 進(jìn)行梯度洗脫并收集目的蛋白峰。純化的目的蛋白以10% SDS-PAGE進(jìn)行分析，將其透析過夜后，以BCA蛋白濃度測定試劑盒進(jìn)行定量。

將含人ICAM-1抗原的SDS-PAGE膠進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，進(jìn)行Western blotting檢測。一抗為1∶200稀釋的純化scFv，二抗為1∶500稀釋的c-Myc(9E10)- HRP抗體，用增強(qiáng)型HRP (Horseradish peroxidase) 底物化學(xué)發(fā)光液顯影成像。

1.2.7 抗ICAM-1 scFv的生物學(xué)活性鑒定

1) 競爭ELISA實(shí)驗(yàn)

將P1抗原肽(1 μg/孔) 包被96孔酶標(biāo)板，以牛血清白蛋白(BSA) 封閉酶標(biāo)板。將0.1 mg/mL McAb 2C5與倍比稀釋的scFv混合后，100 μL/孔依次加入酶標(biāo)板，37 ℃孵育1 h。PBST洗板3次后，加入HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG，37 ℃孵育 1 h。以TMB底物溶液避光顯色，2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀檢測450值。

2) 人血管內(nèi)皮細(xì)胞-單核細(xì)胞黏附抑制實(shí)驗(yàn)[11-12]

將以LPS刺激后的人血管內(nèi)皮細(xì)胞ECV304用Hank’s液洗滌2次后，前兩組加入抗ICAM-1 scFv (2 μg、5 μg)，后兩組加入McAb (2 μg、5 μg)，每組設(shè)置8孔，以加入PBS孔作為對照組，37 ℃培養(yǎng)60 min。每孔加入單核細(xì)胞懸液100 μL (約1×105/孔)，37 ℃孵育60 min，用預(yù)溫培養(yǎng)基輕輕洗去未黏附單核細(xì)胞。充分洗滌后，每孔加入 100 μL 0.25% Rose Bengal溶液，室溫靜止5 min。棄除染料后，以PBS洗滌2次，每孔再加入PBS-乙醇(/=1∶1) 200 μL，室溫靜置30 min，酶標(biāo)儀檢測570值。

黏附率(%)=(ECV304細(xì)胞黏附單核細(xì)胞值–ECV304細(xì)胞值)/總單核細(xì)胞值×100%。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 抗ICAM-1 scFv的親和富集篩選

Tomlinson I+J噬菌體抗體庫經(jīng)4輪“吸附-洗脫-擴(kuò)增”親和富集篩選后，噬菌體抗體收獲率由第1輪的2.00×10–8增加到第4輪的4.00×10–5，富集倍數(shù)增加2000倍左右 (表1)。親和富集篩選過程中噬菌體抗體收獲率的逐漸升高是特異性噬菌體抗體富集的表現(xiàn)，是評價親和富集篩選效果的一個核心指標(biāo)[13-15]。

將第4輪親和富集篩選的陽性噬菌體感染HB2151后，從所涂布的TYE平板中隨機(jī)挑取400個單克隆菌落接種于96孔板中進(jìn)行培養(yǎng)并誘導(dǎo)表達(dá)scFv，利用ELISA實(shí)驗(yàn)進(jìn)行初步篩選，最后得到4株陽性克隆，分別命名為J-A1、J-H12、I-B7和I-B10。

表1 親和富集篩選對抗ICAM-1 scFv的富集效應(yīng)

2.2 陽性克隆的鑒定

以PCR法對上述4株陽性克隆進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在約930 bp處均擴(kuò)增出特異條帶，與預(yù)期大小一致，說明其含有完整的基因(圖1A)。將4株陽性克隆用ELISA實(shí)驗(yàn)進(jìn)行抗原交叉反應(yīng)檢測，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，J-A1菌株特異性較好，其他3株與牛血清白蛋白(BSA) 或脫脂奶粉(Milk) 均有較高的交叉反應(yīng)(圖1B)。Dot blotting實(shí)驗(yàn)表明，J-A1菌株可以與人ICAM-1抗原發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)(圖1C)。

圖1 陽性克隆的鑒定

2.3 J-A1序列測定與分析

J-A1序列分析表明，抗基因全長720 bp，其中重鏈可變區(qū)基因位于Linker的上游，長348 bp，編碼116個氨基酸；輕鏈可變區(qū)基因位于Linker的下游，長327 bp，編碼109個氨基酸。兩者由含15個氨基酸的柔性短肽連接(加粗序列)，構(gòu)成了完整的抗基因序列(圖2)。Blast分析表明，該基因序列符合數(shù)據(jù)庫中單鏈抗體所具有的特點(diǎn)，重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)具有完整的骨架區(qū)和互補(bǔ)決定區(qū)(劃線序列) 結(jié)構(gòu)。

圖2 抗ICAM-1 scFv基因序列分析

2.4 抗ICAM-1 scFv的分離純化與Western blotting鑒定

J-A1工程菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)后，離心收集上清，經(jīng)HisTrap親和層析柱分離純化后，收集目的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色后呈單一蛋白條帶，表明純化的scFv具有較高的純度。蛋白樣品分子量為30 kDa，與scFv理論分子量基本一致(圖3A)。scFv經(jīng)透析和BCA法定量后，其濃度為0.65 mg/mL。Western blotting實(shí)驗(yàn)表明，以純化的scFv作為一抗，在相對分子量55 kDa左右出現(xiàn)特異性條帶，其與ICAM-1抗原分子量大小一致，證實(shí)了純化的scFv可與人ICAM-1抗原發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)(圖3B)。

2.5 抗ICAM-1 scFv生物學(xué)活性鑒定

競爭ELISA實(shí)驗(yàn)表明，伴隨scFv的倍比稀釋，450值逐漸升高，說明scFv和McAb與P1抗原肽的結(jié)合作用是相互排斥的，scFv能與McAb競爭結(jié)合P1抗原肽(圖4)。

圖3 抗ICAM-1 scFv的分離純化與鑒定

利用Rose Bengal對黏附細(xì)胞進(jìn)行染色，計(jì)算細(xì)胞黏附率。2 μg和5 μg scFv組的黏附率分別為30.39%與26.47%；同劑量McAb組的黏附率分別為27.45%與25.49%，PBS對照組為40.19% (圖5)。細(xì)胞黏附抑制實(shí)驗(yàn)表明，scFv和McAb都能抑制單核細(xì)胞與人血管內(nèi)皮細(xì)胞間的黏附，黏附抑制作用與其濃度呈正相關(guān)，與PBS對照組相比，差異顯著。這表明所制備的抗ICAM-1 scFv具有較好的抗細(xì)胞黏附活性。

圖4 競爭ELISA實(shí)驗(yàn)

圖5 細(xì)胞黏附抑制實(shí)驗(yàn)

3 討論

黏附分子介導(dǎo)的細(xì)胞黏附是機(jī)體生理和病理過程的基本現(xiàn)象和共同過程。由細(xì)胞間黏附分子-1 (ICAM-1) 和淋巴細(xì)胞功能性相關(guān)抗原(LFA-1)相互作用介導(dǎo)的炎癥級聯(lián)反應(yīng)過程在炎癥性疾病的發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮重要作用[2,5]。應(yīng)用新型抗黏附分子抗體特異性阻斷上述作用已經(jīng)成為炎癥相關(guān)性疾病治療的新熱點(diǎn)，并成功應(yīng)用于燒傷、移植排斥反應(yīng)、缺血再灌注損傷、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等多種疾病的臨床治療[5,16]。美國FDA已經(jīng)批準(zhǔn)Enlimomab、Efalizumab等抗黏附分子抗體進(jìn)入Ⅱ期臨床研究[17-19]。

噬菌體展示技術(shù)是一種可以不經(jīng)免疫動物和細(xì)胞融合等過程，通過抗體片段的克隆選擇，可以快速制備出幾乎所有抗原的人源化抗體的技術(shù)[20-23]。因此，為快速制備人源抗ICAM-1 scFv，本研究利用Tomlinson I+J噬菌體抗體庫，采用固相篩選法，以P1抗原肽為包被抗原，經(jīng)過4輪親和富集篩選使特異性噬菌體抗體得到了2 000倍的富集。通過ELISA方法對第4輪親和富集后的部分單克隆菌落進(jìn)行抗體活性的初步鑒定，成功篩出4株陽性克隆。通過PCR鑒定反應(yīng)、ELISA抗原交叉反應(yīng)和Dot blotting實(shí)驗(yàn)，最終獲得了1株既能與P1抗原肽特異結(jié)合又能與人ICAM-1抗原特異結(jié)合的陽性克隆J-A1。J-A1工程菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，成功進(jìn)行了scFv的可溶性表達(dá)，繼而采用HisTrap親和層析柱進(jìn)行分離純化。采用Western blotting實(shí)驗(yàn)、競爭ELISA實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞黏附抑制實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了scFv生物學(xué)活性的初步鑒定。上述實(shí)驗(yàn)表明，純化的scFv具有與人ICAM-1抗原特異性結(jié)合的特性且結(jié)合強(qiáng)度與scFv濃度呈正相關(guān)；scFv能夠明顯抑制人血管內(nèi)皮細(xì)胞和單核細(xì)胞間的黏附，其抗黏附作用隨scFv濃度的增高而增強(qiáng)，但單鏈抗體的黏附抑制作用稍弱于單克隆抗體。

BLAST進(jìn)行J-A1序列分析表明，J-A1含有完整的單鏈抗體恒定區(qū)和可變區(qū)，與已報(bào)道的抗ICAM-1 scFv氨基酸序列相比[24]，J-A1的互補(bǔ)決定區(qū)(Complementary-determining region，CDR)序列與其差異較大，尤其是重鏈可變區(qū)中的CDR3區(qū)和輕鏈可變區(qū)中的CDR1區(qū)。由于抗原-抗體的特異性結(jié)合與抗體輕鏈和重鏈的CDR區(qū)環(huán)狀結(jié)構(gòu)的氨基酸序列密切相關(guān)[25]，故此CDR區(qū)氨基酸序列差異可能是導(dǎo)致scFv親和力差異的關(guān)鍵，進(jìn)一步優(yōu)化CDR區(qū)氨基酸序列可能是提高抗ICAM-1 scFv生物學(xué)活性的重要策略。

與本室曾采用的以大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)制備抗ICAM-1 scFv相比[24,26]，利用噬菌體展示技術(shù)制備scFv更加簡便易行并具有更高的產(chǎn)量和生物學(xué)活性。在后續(xù)的研究中，我們將繼續(xù)深入研究以提高抗ICAM-1 scFv的穩(wěn)定性和親和性，使其具有更佳的生物學(xué)活性，探索抗ICAM-1 scFv在炎癥相關(guān)性疾病治療中的應(yīng)用前景。

致 謝 衷心感謝中國科學(xué)院過程工程研究所生化工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室生物藥物工程研究部主任劉瑞田教授在噬菌體展示技術(shù)方面給予的悉心指導(dǎo)和無私幫助！

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

Preparation and identification of anti-human ICAM-1 scFv

Yunyu Chen1,2, Hong Sun2,3, Gang Liu1, Huabo Hu1, Guoli Zhang2, Xiaoping Liu1, and Yuhuan Yue2

1,,,241002,,2,,130122,,3,,150025,,

To screen the specific anti-human intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) single chain fragment variable (scFv) using phage display library technology and to identify its biological activity. P1 peptide was used as antigen, and the phage antibodies against human ICAM-1 antigen were panned by four binding-eluting-amplifying cycles using Tomlinson I+J phage display library. After four rounds of selective enrichment screening, the positive clones were determined by PCR, enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)-based antigenic cross reaction and Dot blotting. Then the binding specificity and biological activity of purified scFv were identified by Western blotting, competitive ELISA and cell adhesion inhibition assay respectively. Furthermore, four positive clones were first panned through P1 peptide coated-ELISA assay, and then J-A1 was obtained and identified by PCR, ELISA-based antigenic cross reaction and Dot blotting, which could show a specific binding between P1 peptide and human ICAM-1 protein antigen. Subsequently, the purified scFv showed a satisfactory specificity and anti-adhesive activity in competitive ELISA and the cell adhesion inhibition assay. The specific anti-human ICAM-1 scFv was prepared successfully from Tomlinson I+J phage display library, which pave the way for further application of anti-human ICAM-1 scFv for inflammation diseases therapeutics.

phage display technology, intercellular adhesion molecule, ICAM-1, scFv, humanized antibody

March 12, 2018;

May 2, 2018

National Natural Science Foundation of China (Nos. 81703546, 81272485), Anhui Provincial Natural Science Foundation (No. 1808085QH265), Jilin Province Science and Technology Development Program (No. 20160520045JH), The Doctoral Starting-up Fund of Wannan Medical College (No. RCQD201617), National Key Research and Development Program of China (No. 2016YFD0501002).

Yuhuan Yue. Tel: +86-431-86985962; E-mail: yhyue2013@163.com

Xiaoping Liu. Tel: +86-553-3932601; E-mail: liuxiaoping@wnmc.edu.cn

國家自然科學(xué)基金 (Nos. 81703546，81272485)，安徽省自然科學(xué)基金 (No. 1808085QH265)，吉林省科技發(fā)展計(jì)劃 (No. 20160520045JH)，皖南醫(yī)學(xué)院博士科研啟動基金 (No. RCQD201617)，國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃“寵物病毒性傳染病血液生物制品研究與產(chǎn)品創(chuàng)制” (No. 2016YFD0501002) 資助。

2018-06-19

10.13345/j.cjb.180083

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20180516.1027.003.html