一種超高靈敏的埃博拉病毒膠體碳側(cè)流免疫層析檢測方法的建立

魏艷秋，段勇成，畢玉海，王萌，李云龍，王選，林瑋，范文輝，王晶，劉文軍，楊利敏

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一種超高靈敏的埃博拉病毒膠體碳側(cè)流免疫層析檢測方法的建立

魏艷秋1*，段勇成2*，畢玉海1，王萌1,3，李云龍1，王選1，林瑋5，范文輝1，王晶4，劉文軍1,3，楊利敏1

1 中國科學(xué)院微生物研究所 病原微生物與免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101 2 廣西大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530004 3 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049 4 中國計(jì)量科學(xué)研究院，北京 100029 5 國為生物科技泰州有限公司，江蘇 泰州 225300

魏艷秋, 段勇成, 畢玉海, 等. 一種超高靈敏的埃博拉病毒膠體碳側(cè)流免疫層析檢測方法的建立. 生物工程學(xué)報(bào), 2018, 34(12): 2025–2034.Wei YQ, Duan YC, Bi YH, et al. A novel carbon nanoparticle probe-based ultrasensitive lateral flow assay for rapid detection of Ebola virus. Chin J Biotech, 2018, 34(12): 2025–2034.

埃博拉出血熱 (Ebola hemorrhagic fever, EHF) 由于其高感染性和高致死率特點(diǎn)，快速鑒別診斷并實(shí)施隔離是最有效的防止疫情擴(kuò)散的措施。文中建立了一種可以快速、高靈敏篩查埃博拉病毒 (Ebola virus，EBOV)感染的現(xiàn)場檢測技術(shù)，用碳納米顆粒標(biāo)記抗EBOV基質(zhì)蛋白VP40兔多克隆抗體，組裝成一種可在15 min內(nèi)檢測埃博拉病毒的膠體碳側(cè)流免疫層析試紙條。將標(biāo)記膠體碳顆粒的兔多抗噴涂于玻璃纖維素膜上制備碳標(biāo)墊；以 1 mg/mL的抗VP40單克隆抗體(McAb，4B7F9) 和羊抗兔IgG，按照2 μL/cm的包被量印跡于硝酸纖維膜上，分別作為檢測線與質(zhì)控線，組裝試紙條。該試紙條能夠特異地檢測EBOV重組VP40蛋白、EBOV病毒樣顆粒(Virus-like particles，VLP) 和滅活EBOV，而與馬爾堡病毒樣顆粒(MARV-VLP)、流感病毒A/PR/8 (IAV/PR/8)、黃熱病毒(YFV-17D)、登革熱病毒2型(DEN2) 無交叉反應(yīng)，顯示良好的特異性，對(duì)1 500份陰性血清進(jìn)行檢測，假陽性率為1.3‰，僅為WHO授權(quán)ReEBOV?膠體金試紙的1/100；該膠體碳試紙條檢測滅活EBOV的最低檢出限為100 ng/mL (相當(dāng)于106copies/mL)，遠(yuǎn)優(yōu)于ReEBOV?膠體金試紙條檢出限(10 μg/mL，相當(dāng)于108copies /mL)。熱穩(wěn)定性評(píng)價(jià)顯示試紙條可在室溫穩(wěn)定保存1年以上。文中建立的EBOV膠體碳免疫層析試紙條能夠快速、超高靈敏、特異地檢測EBOV，為現(xiàn)場快速篩查EBOV感染提供一種新方法。

埃博拉病毒，基質(zhì)蛋白，單克隆抗體，膠體碳，側(cè)流免疫層析，現(xiàn)場快檢

埃博拉病毒是烈性傳染病埃博拉出血熱的病原體，為單股負(fù)鏈RNA病毒，屬于絲狀病毒科埃博拉病毒屬。該病毒于1976年首次被發(fā)現(xiàn)，1995年在剛果民主共和國暴發(fā)后才被人們所認(rèn)知[1]。EBOV分為5個(gè)亞型，分別是蘇丹型 (Sudan Ebola virus，SEBOV)、扎伊爾型 (Zaire Ebola virus, ZEBOV)、塔伊森林型 (Ta Forest Ebola virus，TAFV)、萊斯頓型 (Reston Ebola virus, REBOV) 和本迪布焦型 (Bundibugyo Ebola virus, BEBOV)[1]。不同亞型毒力各不相同，除了REBOV，其他4種亞型對(duì)人都有致病力，ZEBOV和SEBOV的致死率高達(dá)53%–90%[2]。埃博拉病毒感染性極強(qiáng)，傳播途徑包括體液、接觸及氣溶膠，可通過野生動(dòng)物傳播給人，并在人與人之間傳播蔓延。世界衛(wèi)生組織已將其列為對(duì)人類危害最嚴(yán)重的病毒之一，在生物安全等級(jí)上被列為最危險(xiǎn)的第4級(jí)病毒[3]。

EBOV作為一種極其危險(xiǎn)的病原體，快速篩查和確診對(duì)于控制疫情蔓延尤為重要。EBOV感染早期僅出現(xiàn)頭痛、發(fā)熱等癥狀，后期出現(xiàn)高熱，且伴隨嚴(yán)重的頭疼、疲勞、嘔吐、腹瀉、腹痛及出血癥狀。初期癥狀與非洲其他常見病毒感染如馬爾堡病毒、黃熱病、登革熱、流感等不易區(qū)分，僅憑臨床癥狀難以及時(shí)準(zhǔn)確地發(fā)現(xiàn)和診斷。而感染病人確診期越晚則傳播風(fēng)險(xiǎn)越大，疫情越難控制。因此，WHO呼吁加快研究一種快速、靈敏、簡便的診斷方法及產(chǎn)品，以便能夠第一時(shí)間發(fā)現(xiàn)感染病例并實(shí)施隔離就診，控制疫情的發(fā)展及惡化。

EBOV檢測技術(shù)包括病毒分離培養(yǎng)、核酸檢測以及血清學(xué)檢測技術(shù)。病毒分離培養(yǎng)是診斷埃博拉出血熱的金標(biāo)準(zhǔn)，但由于操作復(fù)雜，且必須在生物安全4級(jí)實(shí)驗(yàn)室 (BSL-4) 中開展，因此無法作為常規(guī)診斷技術(shù)。熒光PCR技術(shù)是目前應(yīng)用最廣泛的EBOV核酸檢測技術(shù)，具有良好的靈敏度和特異性[4]，但作為一種實(shí)驗(yàn)室技術(shù)，無法實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場對(duì)可疑病人的快速篩查，而且從樣本采集、運(yùn)輸?shù)綑z測平均需要5 d時(shí)間，從而增加了疫情擴(kuò)散的風(fēng)險(xiǎn)[5]。為了實(shí)現(xiàn)快速檢測EBOV，多個(gè)研究機(jī)構(gòu)開發(fā)了基于恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的EBOV快速診斷方法[6-8]，但受限于核酸抽提及操作步驟繁瑣，且需要一臺(tái)加熱設(shè)備，因此依然未能廣泛推廣應(yīng)用。由于埃博拉出血熱病人體內(nèi)含有高濃度的病毒，因此直接檢測病毒抗原也是個(gè)不錯(cuò)的選擇[9]。膠體金免疫層析技術(shù)是目前應(yīng)用最廣泛的快速檢測 (Point-of-care testing, POCT) 技術(shù)，已被應(yīng)用于各個(gè)快檢領(lǐng)域，該技術(shù)不需要任何設(shè)備，加入樣本后15 min內(nèi)即可判定檢測結(jié)果，但是存在靈敏度偏低的缺陷。美國國家衛(wèi)生研究院(NIH)資助Corgenix公司開發(fā)了基于膠體金免疫層析技術(shù)的EBOV快檢產(chǎn)品 (ReEBOV? Antigen Rapid Test Kit)，該產(chǎn)品最終獲得WHO和美國FDA緊急授權(quán)。但該產(chǎn)品最低檢出限只有108copies/mL，以熒光PCR產(chǎn)品“RealStar Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0” (Altona Diagnostics GmbH) 作對(duì)照，檢出率91.8%，假陽性率15.4%[10]。較高的漏檢率意味著感染風(fēng)險(xiǎn)的增加，過高的假陽性率會(huì)導(dǎo)致結(jié)果的誤判及產(chǎn)品可信度的下降。而且該產(chǎn)品需要冷藏保存，限制了其在非洲的推廣應(yīng)用。國內(nèi)閻錫蘊(yùn)研究團(tuán)隊(duì)建立了基于納米酶技術(shù)的EBOV快檢試紙條，靈敏度與ELISA技術(shù)相當(dāng)，解決了膠體金試紙條靈敏度偏低的問題，而且檢測時(shí)間控制在30 min以內(nèi)，具有很好的應(yīng)用前景[11]。

為了建立更高靈敏度且更穩(wěn)定的EBOV快檢技術(shù)，本研究選用碳納米顆粒作為標(biāo)記探針，與金顆粒相比，碳顆粒具有更高的靈敏度和穩(wěn)定性，而且更環(huán)保[12]。本研究建立的針對(duì)埃博拉病毒基質(zhì)蛋白VP40的膠體碳免疫層析試紙條技術(shù)靈敏度較Corgenix公司膠體金產(chǎn)品提高100倍，假陽性率僅為其1/100，與多種非洲常見病原無交叉反應(yīng)，而且可在室溫穩(wěn)定保存1年以上，非常適合非洲熱帶環(huán)境對(duì)于埃博拉病毒的現(xiàn)場篩查。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

膠體碳標(biāo)記試劑盒購自北京納晶生物科技有限公司；羊抗兔IgG多克隆抗體 (H+L) 購自北京沫之東生物技術(shù)有限公司；硝酸纖維素膜M135購自美國Millipore公司；玻璃纖維Alstrom 8964購自美國Alstrom公司；吸水濾紙購自美國Whatman公司；PVC底板和卡殼購自上海金標(biāo)生物技術(shù)有限公司；Tris、BSA等常規(guī)試劑均購自AMRESCO公司；XYZ三維劃膜噴金儀HM3030、微電腦自動(dòng)斬切機(jī)ZQ2000、數(shù)據(jù)裁條機(jī)CTD300、壓殼機(jī)YK725、膠體金免疫分析儀均購自上海金標(biāo)生物技術(shù)有限公司；真空包裝機(jī)購自上海星貝包裝機(jī)械有限公司；滅活埃博拉病毒由加拿大國家微生物實(shí)驗(yàn)室邱香國教授贈(zèng)予；流感病毒A/PR/8 (IVA/PR/8)、黃熱病毒(YFV-17D)和登革熱2型病毒(DEN2)由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 病毒樣顆粒的制備

參照已發(fā)表文獻(xiàn)[13-14]，分別將編碼埃博拉病毒 (GenBank登錄號(hào)KM034555.1) 或馬爾堡病毒 (GenBank登錄號(hào)Z12132.1) 糖蛋白 (GP) 和基質(zhì)蛋白 (VP40) 的真核表達(dá)質(zhì)粒 (pCAGGS/EBOVGP、pCAGGS/EBOVVP40、pCAGGS/MARVGP和pCAGGS/MARVVP40) 共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，培養(yǎng)68 h后收集上清，9 500×離心4 h，棄去大部分上清，將留存底部混勻即為粗制EBOV-VLP和MARV-VLP，用免疫印跡 (Western blotting) 確認(rèn)GP和VP40的表達(dá)。

1.3 重組蛋白及抗體的制備

合成非洲2014年流行毒株VP40基因 (GenBank登錄號(hào)KM034555.1)，克隆入原核表達(dá)載體pET28a，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta (DE3)，誘導(dǎo)表達(dá)并通過鎳離子金屬螯合層析純化目的蛋白。將純化的重組VP40免疫兔子3次，采集兔血清并通過Protein G層析柱純化兔多抗。將純化的重組VP40免疫BALB/c小鼠，采用雜交瘤技術(shù)，篩選單克隆抗體并通過Protein G層析柱純化單抗。分別采用免疫印跡 (Western blotting) 和酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn) (ELISA) 鑒定獲得的抗體與重組VP40和滅活EBOV的反應(yīng)特異性。

1.4 膠體碳試紙條的制備

1.4.1 膠體碳標(biāo)記抗體

取出碳標(biāo)記試劑盒，8 000 r/min離心10 min后收集膠體碳顆粒，渦旋振蕩混勻后超聲處理3 min，復(fù)溶后的膠體碳溶液為深黑色。將純化的抗EBOV-VP40兔多抗?jié)舛日{(diào)至1.0 mg/mL。將1×膠體碳溶液500 μL與兔多抗5 μL，室溫?cái)嚢?0 min，使抗體與膠體碳充分反應(yīng)。再向標(biāo)記混合液中加入500 μL等量的復(fù)溶液與其充分反應(yīng)，室溫?cái)嚢?0 min封閉。將封閉后的混合液6 000 r/min離心15 min，棄上清，加入500 μL等量的復(fù)溶液復(fù)溶。

1.4.2 膠體碳標(biāo)記墊

將玻璃纖維膜Alstrom 8964置于膠體碳標(biāo)記墊處理液 (0.3% BSA，4%蔗糖，0.2% Tween-20，溶于0.02 mol/L Tris-HCl 緩沖液，pH 8.0) 中，靜置1 min，取出后置37 ℃烘干。用XYZ三維劃膜噴金儀將標(biāo)記兔多抗的膠體碳分別以10 μL/cm、20 μL/cm、30 μL/cm、40 μL/cm的量噴涂到玻璃纖維膜上，37 ℃烘干，組裝試紙條，滴加模擬陽性血清樣品80 μL，室溫反應(yīng)15 min，采用膠體金免疫分析儀讀取T/C線信號(hào)強(qiáng)度，確定膠體碳在玻璃纖維素膜上的最適噴涂量。

1.4.3 樣品墊

平衡條件：55 ℃，30 min；萃取頭解吸條件：250 ℃，3 min；萃取頭吸附條件：55 ℃，40 min；氣相色譜條件：進(jìn)樣口溫度：230 ℃，質(zhì)譜條件為四極桿溫度：150 ℃，離子源溫度：230 ℃，電離電壓：70 eV，方式為：EI，質(zhì)量掃描范圍：20～500 u[13,14]。

將玻璃纖維膜Alstrom 8964置于樣品墊處理液(1% PVP-K30，1% Tritonx-100，0.3% BSA，4%蔗糖于0.02 mol/L Tris-HCl 緩沖液，pH 8.0) 中靜置1 min，取出后置37 ℃烘干，密閉保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.4 檢測線及質(zhì)控線

將純化的單抗4B7F9用Tris-HCl緩沖液(0.02 mol/L，pH 8.0)稀釋為2.0 mg/mL、1.0 mg/mL、0.5 mg/mL三個(gè)不同濃度。以2 μL/cm的包被量，分別印跡于硝酸纖維素膜，作為檢測線。同樣按照2 μL/cm的包被量，將1 mg/mL的羊抗兔IgG印跡于硝酸纖維素膜為質(zhì)控線。烘干，組裝試紙條，滴加模擬陽性血清樣品80 μL，室溫反應(yīng)15 min，采用膠體金免疫分析儀讀取T/C線信號(hào)強(qiáng)度，確定單抗的最適印跡量。

1.4.5 試紙條的組裝與結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

將最適濃度的單抗4B7F9和羊抗兔IgG分別裝入XYZ三維劃膜噴金儀的樣品泵中，將硝酸纖維素膜展平放于噴點(diǎn)儀平臺(tái)上，放上壓條，檢測線與質(zhì)控線相距0.5 cm，位于膜的中間，距膜的邊距分別為1.0 cm，置于37 ℃干燥。依次將樣品墊、標(biāo)記兔多抗的碳?jí)|、印跡有檢測線和質(zhì)控線的硝酸纖維素膜、吸水紙分別固定在粘性的PVC板上，彼此之間疊加2 mm左右，裁剪成4 mm寬的試紙條 (圖1)，裝卡殼，抽真空、密封、干燥保存于鋁箔袋中。

圖1 膠體碳側(cè)流層析試紙條結(jié)構(gòu)示意圖

1.5 試紙條性能評(píng)價(jià)

特異性：分別將重組VP40蛋白、EBOV-VLP和滅活EBOV加入到陰性血清中，模擬臨床陽性血清，將MARV-VLP、IAV/PR/8、YFV-17D和DENV2加入到陰性血清中，模擬其他病原臨床血清，利用組裝好的試紙條分別檢測模擬臨床陽性血清和其他病原模擬血清，各取樣品80 μL，滴加到加樣孔，室溫反應(yīng)15 min，觀察試紙條的T、C線顏色變化，確定膠體碳側(cè)流層析試紙條的特異性。為評(píng)價(jià)檢測假陽性率，用試紙條檢測1 500份國內(nèi)采集陰性血清。

靈敏度：將已用熒光PCR標(biāo)定的純化滅活EBOV用陰性血清進(jìn)行10倍梯度稀釋，制備不同濃度模擬臨床血清樣品，具體按照100 μg/mL、10 μg/mL、1 μg/mL、100 ng/mL、10 ng/mL梯度稀釋 (對(duì)應(yīng)熒光PCR標(biāo)定值：109copies/mL、 108copies/mL、107copies/mL、106copies/mL、 105copies/mL)，分別采用膠體金試紙條 (ReEBOV?) 和膠體碳試紙條進(jìn)行平行檢測，室溫反應(yīng)15 min，觀察兩種試紙條的T、C線顏色變化，確定膠體金與膠體碳試紙條的最低檢出限。

穩(wěn)定性：將制備的膠體碳試紙條分別放置25 ℃和37 ℃，每隔1個(gè)月隨機(jī)取3支試紙條評(píng)價(jià)其最低檢出限，共檢測12個(gè)月。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組抗原及抗體的制備

將轉(zhuǎn)化pET28a-EBOV-VP40的菌種誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE分析，誘導(dǎo)后有重組蛋白表達(dá)，分子量約為35 kDa，與預(yù)期大小一致。誘導(dǎo)表達(dá)的目的蛋白包涵體經(jīng)親和層析純化后得到高純度重組蛋白 (圖2A)。重組蛋白免疫制備了兔多抗和鼠單抗，經(jīng)Protein G親和層析獲得高純度抗體 (圖2B)。將Western blotting鑒定、制備的多抗和單抗能夠特異識(shí)別重組VP40蛋白和滅活EBOV (圖2C、D)。經(jīng)ELISA鑒定，制備的單抗能與滅活病毒反應(yīng) (圖3)，經(jīng)篩選確認(rèn)4B7F9單抗株作為診斷用抗體。

圖2 分析鑒定重組EBOV-VP40蛋白及抗體

2.2 膠體碳標(biāo)記墊的制備

應(yīng)用XYZ三維劃膜噴金儀將標(biāo)記兔多抗的膠體碳，分別以10、20、30、40 μL/cm的量噴涂到處理好的玻璃纖維膜上并組裝試紙條，確定膠體碳在玻璃纖維素膜上的最適噴涂量為30 μL/cm (圖4)。

2.3 檢測線及質(zhì)控線的制備

將純化的單抗4B7F9，按3個(gè)不同濃度分別印跡于硝酸纖維素膜，作為檢測線；將1 mg/mL的羊抗兔IgG，印跡于硝酸纖維素膜為質(zhì)控線，組裝試紙條。滴加陽性血清樣品80 μL，室溫反應(yīng)15 min，確定單抗的最適印跡量為1.0 mg/mL (圖5)。

圖3 ELISA鑒定不同EBOV單抗株與滅活EBOV相互反應(yīng)

2.4 試紙條的組裝與結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

取80 μL血清樣品垂直滴加至組裝好的檢測卡加樣處，室溫反應(yīng)15 min，觀察結(jié)果。當(dāng)待檢樣品中含有滅活埃博拉病毒時(shí)，則在試紙條的檢測線 (T) 和質(zhì)控線 (C) 處分別出現(xiàn)一條黑色線；當(dāng)待檢樣品中不含有抗原時(shí)，則只在試紙條的質(zhì)控線 (C) 處出現(xiàn)一條黑線 (圖6)。

圖6 EBOV膠體碳側(cè)流層析試紙條檢測結(jié)果判定

2.5 膠體碳試紙條性能評(píng)價(jià)

特異性：用組裝好的試紙條分別檢測含重組EBOV-VP40蛋白、EBOV-VLP或EBOV滅活病毒的模擬陽性臨床血清和分別含MARV-VLP、IAV/PR/8、YFV-17D和DEN2的對(duì)照模擬臨床血清樣本，取血清樣品80 μL，滴加到加樣孔，室溫反應(yīng)15 min，滴加模擬陽性臨床血清的試紙條反應(yīng)均為陽性，其余對(duì)照樣本均為陰性，表明該膠體碳免疫層析試紙條具有良好的特異性，與其他非洲常見病原無交叉反應(yīng) (圖7)。為了評(píng)價(jià)試紙條的假陽性率，分別對(duì)1 500份國內(nèi)采集的陰性血清進(jìn)行了檢測，共出現(xiàn)兩例弱陽性反應(yīng)，將該兩例血清樣本經(jīng)熒光定量RT-PCR進(jìn)一步鑒定確認(rèn)為陰性樣本，因此可判斷其假陽性率為1.3‰，明顯低于ReEBOVTM試紙條15.4%的假陽性率[10]。

圖7 EBOV膠體碳側(cè)流層析試紙條特異性評(píng)價(jià)

靈敏度：將已用熒光PCR技術(shù)定量的滅活EBOV用陰性血清梯度稀釋后，分別用商品化ReEBOVTM膠體金試紙條或膠體碳試紙條進(jìn)行平行檢測，ReEBOV?膠體金試紙條最低檢出限為10 μg/mL (108copies/mL) (圖8A)，膠體碳試紙條最低檢出限為100 ng/mL (106copies/mL) (圖8B)，膠體碳試紙條靈敏度是ReEBOVTM膠體金試紙條的100倍。

穩(wěn)定性：分別將膠體碳試紙條放置25 ℃和37 ℃兩個(gè)溫度條件，定期檢測其最低檢出限，結(jié)果顯示，25 ℃放置12個(gè)月試紙條的最低檢出限未發(fā)生明顯變化，37 ℃第3個(gè)月最低檢出限出現(xiàn)上升 (圖9)，提示試紙條可在37 ℃穩(wěn)定保存2個(gè)月，室溫穩(wěn)定保存1年以上，證明該試紙條具有良好的穩(wěn)定性。

圖9 EBOV側(cè)流層析試紙條穩(wěn)定性評(píng)價(jià)(試紙條分別放置25 ℃和37 ℃并定期檢測其最低檢出限，虛線以上代表無法檢出，即試紙條已失效)

3 討論

埃博拉出血熱是一種可引起人和非人靈長類動(dòng)物高死亡率的烈性傳染病，2014–2016年在西非的大規(guī)模暴發(fā)疫情引起全世界的關(guān)注。目前，該疾病沒有特效治療藥物，很多實(shí)驗(yàn)室的疫苗或藥物還處于臨床前研究階段，不過我國已率先研制了基于腺病毒載體的埃博拉疫苗，有效提升了我國針對(duì)埃博拉疫情的防控能力[15-16]。近期的埃博拉疫情導(dǎo)致超過28 000人感染，超過40%的死亡率，盡管疫情告一段落，但是部分幸存者體內(nèi)依然存在病毒，而我國與非洲經(jīng)貿(mào)往來日漸頻繁，因此我國存在輸入性風(fēng)險(xiǎn)。及早發(fā)現(xiàn)感染病例并進(jìn)行隔離是控制疫病流行最有效的措施。盡管熒光PCR技術(shù)具有良好的靈敏度和特異性，但僅限于在高等級(jí)專業(yè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，在非洲各地建立PCR實(shí)驗(yàn)室存在困難，而且從樣本采集、運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室檢測出結(jié)果平均需要5 d時(shí)間，容易貽誤病情[17]，并導(dǎo)致疫情擴(kuò)散。美國Corgenix公司開發(fā)的EBOV膠體金試紙條產(chǎn)品可實(shí)現(xiàn)EBOV的現(xiàn)場快速檢測，但其靈敏度偏低 (檢出率91.8%)，而且特異性較差 (假陽性率15.4%)，由于EBOV感染急性期血液中病毒含量為106–109copies/mL，而ReEBOVTM膠體金試紙條的最低檢出限為108copies/mL[18]，從而導(dǎo)致一些血液中病毒含量較低的感染病例被漏檢，而且該產(chǎn)品需要冷鏈運(yùn)輸、保存，對(duì)于供電緊張、醫(yī)療設(shè)施匱乏的非洲地區(qū)，其推廣應(yīng)用受到了限制。針對(duì)非洲這一特殊環(huán)境，建立一種快速、簡便、高靈敏和熱穩(wěn)定的EBOV快速診斷技術(shù)迫在眉睫。

采用碳納米顆粒作為標(biāo)記探針代替金顆粒建立的膠體碳側(cè)流層析試紙條，不需要儀器設(shè)備，僅需幾分鐘即可肉眼判斷結(jié)果，適合現(xiàn)場快速檢測，而且其穩(wěn)定性明顯優(yōu)于膠體金產(chǎn)品，更適合在非洲這種特殊環(huán)境使用。本研究采用抗體夾心法建立的膠體碳免疫層析檢測試紙條能夠特異地與EBOV重組VP40、VLP和滅活病毒反應(yīng)，而與馬爾堡、流感、黃熱、登革熱這些熱帶地區(qū)常見病原無交叉反應(yīng)，表明其具有良好的特異性。為評(píng)價(jià)其靈敏度，將其與WHO和美國FDA授權(quán)的ReEBOV?膠體金試紙條產(chǎn)品平行檢測了梯度稀釋的滅活EBOV，結(jié)果顯示其靈敏度是對(duì)照膠體金產(chǎn)品的100倍。本研究確認(rèn)了ReEBOVTM膠體金試紙條的最低檢出限是108copies/mL，該結(jié)果與WHO的評(píng)價(jià)報(bào)告結(jié)果一致[10]，膠體碳試紙條的最低檢出限是106copies/mL。EBOV感染急性期病人血液中病毒含量為106–109copies/mL，因此膠體碳試紙條有望在EBOV初期發(fā)熱癥狀出現(xiàn)后即迅速對(duì)疑似感染者進(jìn)行鑒別診斷并隔離以防止疫情擴(kuò)散。研究表明，如果能將EBOV感染者的診斷期由目前的5 d縮短為1 d，則其感染他人的幾率將由80%降為0[5]，也就是說將大幅降低埃博拉病毒的感染性從而控制疫情擴(kuò)散。另外，考慮到非洲地區(qū)環(huán)境炎熱，醫(yī)療技術(shù)水平薄弱，產(chǎn)品的熱穩(wěn)定性和易操作性至關(guān)重要。本研究的膠體碳試紙條可在37 ℃穩(wěn)定保存2個(gè)月，25 ℃穩(wěn)定保存1年，非常適合非洲缺乏冷鏈運(yùn)輸?shù)沫h(huán)境條件，而且操作簡便，無需培訓(xùn)，可用于家庭或診所發(fā)現(xiàn)疑似癥狀后的快速篩查。該試紙條產(chǎn)品有望作為熒光PCR產(chǎn)品的一個(gè)補(bǔ)充，彌補(bǔ)PCR產(chǎn)品無法進(jìn)行現(xiàn)場篩查的缺陷，將埃博拉病毒檢測由高等級(jí)實(shí)驗(yàn)室前移到社區(qū)、家庭，人們甚至可以進(jìn)行發(fā)熱后的自我篩查，由于檢測時(shí)間的提前，埃博拉病毒的高傳染性將被有效遏制。

為滿足非洲地區(qū)及進(jìn)出口岸對(duì)于EBOV快速篩查的需求，本研究首次將該膠體碳免疫層析技術(shù)用于EBOV的快速檢測，研制的膠體碳試紙條靈敏度是已上市并獲WHO和美國FDA授權(quán)的膠體金試紙條產(chǎn)品的100倍，假陽性率是其1/100，而且無需冷鏈，室溫即可以穩(wěn)定保存。檢測過程不需任何儀器設(shè)備，只需15 min即可快速獲得檢測結(jié)果。本試紙條可用于發(fā)熱病人的篩查，針對(duì)陽性結(jié)果可通過熒光PCR技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步的確認(rèn)。由于國內(nèi)缺乏EBOV臨床血清樣本，本研究只采用模擬樣本和臨床陰性血清對(duì)其進(jìn)行了評(píng)價(jià)，后續(xù)工作仍需采用大量EBOV臨床樣本對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的評(píng)價(jià)。本研究建立的EBOV膠體碳免疫層析方法為我國EBOV的防控提供了技術(shù)支撐。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

A novel carbon nanoparticle probe-based ultrasensitive lateral flow assay for rapid detection of Ebola virus

Yanqiu Wei1*, Yongcheng Duan2*, Yuhai Bi1, Meng Wang1,3, Yunlong Li1, Xuan Wang1, Wei Lin5, Wenhui Fan1, Jing Wang4, Wenjun Liu1,3, and Limin Yang1

1 CAS Key Laboratory of Pathogenic Microbiology and Immunology, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China 2 College of Animal Science and Technology, Guangxi University, Nanning 530004, Guangxi, China 3 University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China 4 National Institute of Metrology, Beijing 100029, China 5 Goodwe Biotechnology Taizhou Co., Ltd., Taizhou 225300, Jiangsu, China

Ebola virus (EBOV) is an extremely contagious pathogen first discovered in Africa associated with severe hemorrhagic disease in humans and nonhuman primates, which has resulted in at least 28 500 suspected cases and 11 300 confirmed deaths in 2014–2016 Ebola epidemic in West Africa. Rapid and sensitive detection of EBOV is the key to increasing the probability of survival and reducing infection rates in pandemic regions. Here, we report an ultrasensitive and instrument-free EBOV detection assay based on colloidal carbon immunochromatography. Carbon nanoparticle-labeled rabbit anti-EBOV-VP40 IgG were concentrated in the conjugate pad, monoclonal antibody (McAb, 4B7F9) against EBOV-VP40 and goat anti-rabbit IgG were immobilized on the nitrocellulose membrane with 2 μL/cm at a concentration of 1 mg/mL as test and control lines, respectively. Then the sample application pad, conjugate release pad, nitrocellulose membrane and absorbent pad were assembled into a lateral flow test strip. The test strip shows strong specificity against related viruses that share similar clinical symptoms and geographic range with EBOV, including marburg virus, influenza virus, yellow fever virus and dengue virus. In addition, 1 500 negative serums were tested with false-positive rate of 1.3‰ which significantly lower than that of ReEBOV? colloidal gold test kit recommended by World Health Organization (WHO). The sensitivity of this strip was analyzed using inactivated EBOV with detection limit of 100 ng/mL (106copies/mL) which clearly higher than that of ReEBOV? dipstick (108copies/mL). Furthermore, the strip showed excellent thermal stability characteristics in room temperature and could be as a point-of-care (POC), ultra-sensitive and specific promising candidate for EBOV serological screening in rural Africa or entry/exit ports.

Ebola virus, matrix protein, monoclonal antibodies, colloidal carbon, lateral flow immunochromatography, POC

March 9, 2018;

May 11, 2018

the National Key Program for Infectious Disease of China (No. 2016ZX10004222), the Key Research Program of the Chinese Academy of Sciences (No. ZDRW-ZS-2016-4-4).

Limin Yang. Tel/Fax: +86-10-64807503; E-mail: lmyang@im.ac.cn

*These authors contributed equally to this study.

國家科技重大專項(xiàng) (No. 2016ZX10004222)，中國科學(xué)院重點(diǎn)部署項(xiàng)目 (No. ZDRW-ZS-2016-4-4) 資助。

2018-06-23

10.13345/j.cjb.180074

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20180622.1157.001.html