嗜熱子囊菌JCM12803來源的雙功能木聚糖/纖維素酶

李曉麗，涂濤，姚斌，謝響明，羅會穎

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嗜熱子囊菌JCM12803來源的雙功能木聚糖/纖維素酶

李曉麗1,2，涂濤2，姚斌2，謝響明1，羅會穎2

1 北京林業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083 2 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 飼料研究所，北京 100081

李曉麗, 涂濤, 姚斌, 等. 嗜熱子囊菌JCM12803來源的雙功能木聚糖/纖維素酶. 生物工程學(xué)報, 2018, 34(12): 1996–2006.Li XL, Tu T, Yao B,et al. A novel bifunctional xylanase/cellulase TcXyn10A from Thermoascus crustaceus JCM12803. Chin J Biotech, 2018, 34(12): 1996–2006.

纖維素和木聚糖的充分利用對于生物燃料的生產(chǎn)是非常重要的。文中利用PCR的方法從嗜熱子囊菌JCM12803中克隆到一個新穎的雙功能木聚糖/纖維素酶基因，并將其在畢赤酵母GS115中實現(xiàn)高效異源表達(dá)。經(jīng)過蛋白純化和酶學(xué)性質(zhì)研究分析，Xyn10A的最適pH值和最適溫度分別為5.0和65?70 ℃，能夠在酸性至堿性 (pH 3.0?11.0) 條件下和60 ℃下保持穩(wěn)定；對櫸木木聚糖、小麥阿拉伯木聚糖、羧甲基纖維素鈉和地衣多糖均有降解活性，比活分別為(1 480±26) U/mg、(2 055±28) U/mg、(7.4±0.2) U/mg和(10.9±0.4) U/mg；同源建模結(jié)構(gòu)以及分子對接試驗表明，雙功能酶Xyn10A只含有單一催化結(jié)構(gòu)域，且木聚糖底物與纖維素底物共用一條催化通道。文中為探索雙功能酶結(jié)構(gòu)與其功能的關(guān)系提供了很好的素材。

嗜熱子囊菌JCM12803，雙功能酶，木聚糖酶，纖維素酶

近年來，可持續(xù)發(fā)展的可再生能源和生物質(zhì)降解受到了人們的廣泛關(guān)注，利用酶促反應(yīng)將生物質(zhì)轉(zhuǎn)換成第二代生物燃料是目前的新興產(chǎn)業(yè)[1]。植物細(xì)胞壁多糖主要是由纖維素和半纖維等組成[2]，將其完全降解需要一系列相關(guān)酶的協(xié)同作用。為了更好地利用植物細(xì)胞壁多糖這塊巨大的可再生生物資源，有關(guān)纖維素降解酶或者木聚糖降解相關(guān)酶之間的協(xié)同作用已有大量的研究報道[3]。例如，當(dāng)?shù)?5家族內(nèi)切葡聚糖酶和纖維二糖水解酶的配比為1∶4的時候，協(xié)同效果最好[4]；木聚糖酶、木糖苷酶和乙酰木糖酯酶協(xié)同水解乙酰木聚糖，效果顯著[5]。盡管如此，與雙功能酶相比，這種不同催化反應(yīng)之間承接與互作的內(nèi)部緊密程度要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于由不同單功能酶組成的酶系[6]。

在自然進(jìn)化的過程中，微生物會根據(jù)其生長的需要進(jìn)化出可降解多種底物的非特異性酶，即多功能酶[7]。其中，雙功能酶的研究相對較多。根據(jù)酶蛋白結(jié)構(gòu)域與功能之間的對應(yīng)關(guān)系，雙功能酶大致可分為兩大類：1) 單結(jié)構(gòu)域雙功能酶，這類酶催化不同底物的活性中心共用同一個催化結(jié)構(gòu)域。以來源于熱解纖維素菌的雙功能木聚糖酶/纖維素酶Xyn10C為例[8]，該酶僅含有一個催化結(jié)構(gòu)域，能容納、結(jié)合和催化具有不同組成和空間結(jié)構(gòu)的纖維素和木聚糖底物，但這類酶的酶活性通常都不會太高。2) 雙結(jié)構(gòu)域雙功能酶，這類催化中心分別位于同一多肽鏈上的不同結(jié)構(gòu)域里，這類酶多見于細(xì)菌來源的酶中，兩個不同的催化結(jié)構(gòu)域分別負(fù)責(zé)降解植物細(xì)胞壁多糖的主鏈和側(cè)鏈，從而發(fā)揮協(xié)同降解的作用。如來源于黃化瘤胃球菌17的木聚糖酶/葡聚糖酶，N端為木聚糖酶結(jié)構(gòu)域，C端為葡聚糖酶結(jié)構(gòu)域，中間為Linker部分[9]?；谝陨侠碚?，研究者逐步建立了基于雙功能酶活的融合酶。例如，將葡聚糖酶和木聚糖酶融合表達(dá)，成功獲得了同時具有這兩種酶活性的雙結(jié)構(gòu)域雙功能酶[10]。由此可見，作為復(fù)合酶制劑的補充，大力開發(fā)和利用雙功能酶具有很好的應(yīng)用前景。

根據(jù)碳水化合物活性酶數(shù)據(jù)庫 (http://www. cazy.org) 的分類，絕大多數(shù)的木聚糖酶被歸類到糖苷水解酶 (Glucoside hydrolase, GH) 第10和11家族[11]。人們普遍認(rèn)為，GH11家族木聚糖酶才是真正的木聚糖酶，因為其特異水解木聚糖[12]。而GH10家族木聚糖酶表現(xiàn)出一定的雜泛性，除了降解木聚糖之外，還可催化水解番茄苷[13]、大麥葡聚糖[14]和微晶纖維素[8]等。本研究從嗜熱子囊菌JCM12803中克隆了一個同時具有木聚糖酶和纖維素酶酶活的雙功能酶基因，構(gòu)建了高效表達(dá)的畢赤酵母基因工程菌株，并對其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行系統(tǒng)的研究。利用同源建模和分子對接等生物信息學(xué)技術(shù)，討論了其催化機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和載體

嗜熱子囊菌JCM12803購自日本微生物保藏中心，可用馬鈴薯葡萄糖 (PDB) 培養(yǎng)基活化和培養(yǎng)；大腸桿菌質(zhì)粒pEASY-T3和感受態(tài)Trans1-T1購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，用于基因片段的克隆和測序。質(zhì)粒pPIC9和畢赤酵母GS115由本實驗室保存，用于重組載體的構(gòu)建和表達(dá)。

1.1.2 試劑

底物櫸木木聚糖購自Sigma公司；質(zhì)粒小提中量試劑盒購自天根生化科技有限公司；DNA 純化試劑盒購自O(shè)MEGA公司；限制性內(nèi)切酶RⅠ和Ⅰ購自TaKaRa有限公司；總RNA 提取試劑盒以及T4 DNA連接酶購自Promega (Madison, WI)；FastPfu DNA聚合酶和EasyScript First-Strand cDNA Synthesis Super MIX購自全式金生物技術(shù)有限公司；蛋白Marker購自Genestar生物公司。其他所用化學(xué)試劑如乙醇、甲醇、乙酸等，若無特殊說明，均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 主要培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨1% (/，下同)，酵母提取物0.5%，NaCl 1%，LB固體培養(yǎng)基在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加2%的瓊脂。

YPD培養(yǎng)基：酵母提取物1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%。

BMGY培養(yǎng)基：蛋白胨2%，酵母提取物1%，甘油1% ()，生物素0.000 04%，無氨基酵母氮源 (YNB) 1.34%。

BMMY培養(yǎng)基：蛋白胨2%，酵母提取物1%，生物素0.000 04%，YNB 1.34%，甲醇0.5%。

MD培養(yǎng)基：葡萄糖2%，瓊脂糖2%，YNB 1.34%，生物素0.000 04%。

1.2 雙功能酶基因Tcxyn10a的克隆

嗜熱子囊菌JCM12803的全基因組序列已由上海美吉公司完成測序。經(jīng)過對注釋序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，是一個典型的木聚糖酶基因。利用SignalP 4.1 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) 預(yù)測該基因的信號肽序列[15]，Softberry Server (http:// inux1.softberry.com/berry.phtml) 分析其內(nèi)含子和外顯子，Vector NTI Advance 10.0軟件分析基因編碼蛋白的理論分子量和等電點等信息后，設(shè)計該基因特異引物Tcxyn10a-F：5′-ACAAACCCTCTTCTTGCGGGACGCCAA-3′，Tcxyn10a-R：5′-AATTAGCG CAGTGCATCGAC-3′ (下劃線部分代表酶切位點RⅠ和Ⅰ)。

將嗜熱子囊菌JCM12803轉(zhuǎn)接至誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d后，用SV總RNA純化系統(tǒng)提取總RNA，采用Reverse Tra Ace-α-TM kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒 (TOYOBO) 合成cDNA單鏈。以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，用高保真FastPfu DNA聚合酶、引物Tcxyn10a-F和Tcxyn10a-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得目的基因。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物已去除信號肽序列，將其切膠回收后，連接至克隆載體pEASY-T3上，并熱擊轉(zhuǎn)化至克隆菌株Trans-T1用于測序驗證。

1.3 重組表達(dá)載體的構(gòu)建

提取載體pPIC9的質(zhì)粒，與本研究中提取的基因同時用RⅠ和Ⅰ進(jìn)行雙酶切。將酶切產(chǎn)物進(jìn)行核酸凝膠電泳分析，切膠回收后，用T4 DNA連接酶將它們連接。連接產(chǎn)物采用熱擊法轉(zhuǎn)入大腸桿菌TransI-T1感受態(tài)細(xì)胞。次日，挑取轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR驗證和酶切驗證后，獲得重組表達(dá)載體pPIC9-。

1.4 重組表達(dá)載體在畢赤酵母中的表達(dá)和純化

大量提取重組表達(dá)載體pPIC9-質(zhì)粒，將其進(jìn)行Ⅰ單酶切線性化處理，酶切產(chǎn)物回收后采用電擊法轉(zhuǎn)化到GS115感受態(tài)細(xì)胞中，并涂布于MD板上。30 ℃條件下倒置培養(yǎng)2 d后，分別挑取96個MD板上的單克隆于BMGY培養(yǎng)基中。30 ℃、200 r/min搖床振蕩培養(yǎng)48 h后，4 500 r/min離心5 min，棄上清，換BMMY培養(yǎng)基，在0.5%甲醇的條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)2 d。將獲得的培養(yǎng)液在4 000 r/min 離心10 min，進(jìn)行酶液的收集和小管酶活的測定。

將篩選出的酶活最高的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行搖瓶放大培養(yǎng)和誘導(dǎo)。同樣用BMGY培養(yǎng)基進(jìn)行菌體富集和BMMY培養(yǎng)基誘導(dǎo)產(chǎn)酶液。獲得的發(fā)酵液于12 000 r/min離心10 min，得到粗酶液。粗酶液首先用10 kDa截留量的膜包進(jìn)行濃縮處理，去除培養(yǎng)基殘留和細(xì)胞碎片。隨后，用0.02 mol/L檸檬酸-磷酸-氫二鈉緩沖液 (pH 7.5) 進(jìn)行脫鹽處理，一方面去除培養(yǎng)基中的鹽分，另一方面對酶液進(jìn)行緩沖液置換。最后，選用HiTrap Q XL陰離子層析柱進(jìn)行分離純化，平衡的A液為0.02 mol/L檸檬酸-磷酸-氫二鈉緩沖液 (pH 7.5)，B液在A液的基礎(chǔ)上，添加1 mol/L的NaCl，用于梯度洗脫目的蛋白。經(jīng)過色譜峰的酶活性檢測和十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE，12%聚丙烯酰胺) 檢測目的蛋白的純度和分子量。目的條帶送中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所進(jìn)行液相色譜-電噴霧離子化-質(zhì)譜聯(lián)用 (Liquid chromatography- electrospray ionization-tandem mass spectrometry, LC-ESI-MS) 進(jìn)行鑒定。

1.5 酶活力的測定

木聚糖酶酶活的測定采用二硝基水楊酸 (DNS) 法檢測還原糖的生成量[16-17]。配制1% () 終濃度的櫸木木聚糖溶于pH 5.0、0.1 mol/L檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液中作為底物。反應(yīng)體系包括900 μL的底物和100 μL恰當(dāng)稀釋倍數(shù)的酶液，在pH 5.0、65 ℃下反應(yīng)10 min，加入1.5 mL DNS試劑終止反應(yīng)。沸水浴處理5 min后，快速冷卻。通過酶標(biāo)儀讀取在540 nm波長下值，計算還原糖的產(chǎn)生量。

酶活定義：在pH 5.0、65 ℃條件下，每分鐘降解櫸木木聚糖生成1 μmoL木糖所需要的酶量定義為一個酶活單位。蛋白濃度采用Bradford法[18]測定。

1.6 酶學(xué)性質(zhì)分析

純化后的Xyn10A在65 ℃、不同pH (pH 3.0–8.0，0.1 mol/L檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液) 的條件下與底物進(jìn)行酶促反應(yīng) (10 min)，以測定其最適pH值。將Xyn10A在不同pH值的緩沖液(pH 2.2–12.0；其中pH 2.2–8.0是0.1 mol/L檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液，pH 9.0–12.0是0.1 mol/L NaOH-甘氨酸緩沖液) 中置于37 ℃處理1 h，待酶液用適當(dāng)倍數(shù)的pH 5.0緩沖液校正之后，于pH 5.0、65 ℃條件下測定剩余酶活，未作處理的酶活為100%對照，以研究Xyn10A的pH穩(wěn)定性。

在pH 5.0的條件下，取恰當(dāng)稀釋倍數(shù)的Xyn10A在不同溫度 (30–80 ℃) 下與底物進(jìn)行酶促反應(yīng) (10 min)，以測定其最適溫度。將50 μg/mL 的Xyn10A分別在60 ℃和70 ℃下保溫處理不同時間，在間隔時間點取樣后迅速置于冰上，調(diào)整稀釋倍數(shù)后于pH 5.0、65 ℃條件下測定剩余酶活，未作處理的酶活為100%對照，以研究Xyn10A的溫度穩(wěn)定性。

分別配制不同濃度 (0.5–10 mg/mL) 的櫸木木聚糖底物溶于pH 5.0、0.1 mol/L檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液中，與適當(dāng)稀釋倍數(shù)的Xyn10A在65 ℃下進(jìn)行酶促反應(yīng)，一級反應(yīng)時間定為5 min。利用GraphPad Prism 5.01軟件分析得到Xyn10A以櫸木木聚糖為底物時的max和m值。

1.7 金屬離子和化學(xué)試劑對木聚糖酶活性的影響

在木聚糖酶反應(yīng)體系中，分別加入0.005 mol/L的金屬離子或化學(xué)試劑 (Na+、K+、Ca2+、Cu2+、Mn2+、Zn2+、Fe3+、Cu2+、Mg2+、Ni2+、Cr3+、Co2+、SDS、EDTA和β-巰基乙醇)，在pH 5.0、65 ℃條件下測定酶活。以未添加離子的酶液反應(yīng)體系作為100%對照，每個實驗組設(shè)置3個平行。根據(jù)剩余酶活的大小分析不同金屬離子和化學(xué)試劑對酶活的影響。

1.8 底物特異性分析

分別配制1% (/) 的櫸木木聚糖、小麥阿拉伯木聚糖、濾紙、羧甲基纖維素鈉 (CMC)、角豆膠、微晶纖維素、地衣多糖等底物于pH 5.0、0.1 mol/L檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液中，加入適當(dāng)稀釋倍數(shù)的Xyn10A后，于65 ℃下反應(yīng)，檢測各還原糖的生成量。

根據(jù)底物特異性的分析結(jié)果，對櫸木木聚糖、小麥阿拉伯木聚糖和CMC等底物在40 ℃下過夜反應(yīng)。反應(yīng)產(chǎn)物在經(jīng)過高速離心和小分子去除之后，進(jìn)行高效離子色譜 (High Performance Anion Exchange Chromatography, HPAEC) 分析[19]。以未添加酶液的底物作為對照。流動相為1 mol/L NaOH，流速為0.45 mL/min。標(biāo)準(zhǔn)對照品分別為木糖、木二糖、木三糖、木四糖、木五糖和木六糖，以及葡萄糖、纖維二糖、纖維三糖、纖維四糖、纖維五糖和纖維六糖。

1.9 同源建模及分子對接

為了從分子層面研究Xyn10A具有纖維素酶活性的分子機(jī)制，利用同源建模的方法構(gòu)建了其三維模型。以來源的木聚糖酶 (PDB: 1K6A; 1.14 ?, 序列一致性為82.5%) 為模板[20]，利用Discovery Studio 2017軟件進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)的建模。構(gòu)建好的模型經(jīng)過能量優(yōu)化和評估之后，用于分子對接的受體。小分子配體木七糖和纖維六糖分別取自晶體復(fù)合物結(jié)構(gòu)，PDB注冊號分別為5OFK和5OFL[21]。利用Discovery Studio 2017軟件中柔性對接 (Flexible docking) 模塊，分別對Xyn10A與木七糖、Xyn10A與纖維六糖進(jìn)行分子對接試驗，獲得酶-底物復(fù)合物結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 木聚糖酶基因Tcxyn10a的克隆與序列分析

分別以JCM12803的基因組DNA和cDNA單鏈為模板，利用特異引物Tcxyn10a-F和Tcxyn10a-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得木聚糖酶基因的全長序列和cDNA序列，基因全長序列與基因組測序序列完全一致。該基因全長為1 762 bp，含有10個內(nèi)含子序列。cDNA序列為984 bp，編碼327個氨基酸和一個終止密碼子?；虻南嚓P(guān)信息提交至GenBank數(shù)據(jù)庫中，序列注冊號為MG879231。

經(jīng)過序列分析，該基因的編碼蛋白N端18個氨基酸為信號肽序列 (圖1)。基因所編碼的成熟蛋白預(yù)測理論分子量為33.6 kDa，等電點為5.36，無潛在的-糖基化修飾位點。在氨基酸的組成方面，酸性氨基酸 (天冬氨酸和谷氨酸) 占9.71%，堿性氨基酸 (賴氨酸和精氨酸) 占7.77%，極性氨基酸 (天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸) 占28.8%，疏水氨基酸 (丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和纈氨酸) 占39.16%。將基因序列及其推測的氨基酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行序列比對，該基因與來源的木聚糖酶基因有最高的一致性，為82%。通過結(jié)構(gòu)域分析，木聚糖酶Xyn10A是一個單結(jié)構(gòu)域蛋白，無碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域。

圖1 木聚糖酶TcXyn10A的氨基酸序列

2.2 重組蛋白的表達(dá)和純化

重組表達(dá)載體pPIC9-在畢赤酵母中成功實現(xiàn)高效表達(dá)，搖瓶表達(dá)水平為 (9.2±0.2) U/mL。通過小管初篩，挑選出酶活最高的轉(zhuǎn)化子并進(jìn)行搖瓶水平放大培養(yǎng)。獲得的發(fā)酵液作為粗酶液進(jìn)行后續(xù)純化處理。經(jīng)過蛋白濃縮、脫鹽和陰離子交換色譜柱等純化步驟，獲得單一洗脫峰。經(jīng)SDS-PAGE鑒定達(dá)到了蛋白電泳純 (圖2)，條帶大小與理論分子量一致。LC-ESI-MS鑒定結(jié)果如圖2所示，鑒定得到的4條肽段與木聚糖酶Xyn10A的氨基酸序列高度吻合，進(jìn)一步證明所獲重組蛋白即為木聚糖酶Xyn10A。

圖2 木聚糖酶TcXyn10A的蛋白電泳分析

圖3 重組TcXyn10A的酶學(xué)性質(zhì)

2.3 酶學(xué)性質(zhì)的測定

重組Xyn10A的最適pH為5.0，在pH 4.0– 6.5之間保持60%以上的酶活 (圖3A)，是一個酸性木聚糖酶。Xyn10A的pH穩(wěn)定范圍非常寬泛，在pH 3.0–11.0的條件下處理1 h后，殘存酶活均能保持80%以上的酶活性 (圖3B)，說明其在弱酸至強(qiáng)堿性環(huán)境中均表現(xiàn)出很強(qiáng)的穩(wěn)定性。Xyn10A的最適溫度為65–70 ℃ (圖3C)，在50–75 ℃下都能保持較高酶活，屬于中高溫酶；在60 ℃保持穩(wěn)定，熱處理1 h后仍保持80%的酶活，在70 ℃下處理5 min，保持50%左右的酶活 (圖3D)。

以櫸木木聚糖為底物，在pH 5.0、65 ℃的條件下，重組木聚糖酶Xyn10A的比活為 (1 480±26) U/mg。動力學(xué)參數(shù)m和max分別為 (2.6± 0.19) mg/mL和 (1 943±63) μmol/(min·mg)。

不同金屬離子和化學(xué)試劑對Xyn10A酶活的影響如表1所示。絕大多數(shù)的離子對其酶活無明顯影響，Ni2+、K+和EDTA對其具有明顯的促進(jìn)作用，而Cu2+和SDS對其有明顯的抑制作用。

2.4 底物特異性分析

重組木聚糖酶Xyn10A底物特異性非常廣泛。通過對不同底物降解試驗，當(dāng)酶促反應(yīng)為10 min時，Xyn10A對小麥阿拉伯木聚糖、CMC和地衣多糖有明顯的降解活性，比活分別為(2 055±28) U/mg、(7.4±0.2) U/mg和 (10.9±0.4) U/mg。相對于櫸木木聚糖酶活，Xyn10A對小麥阿拉伯木聚糖、CMC和地衣多糖的酶活分別為138.8%、0.5%和0.7%。而Xyn10A對濾紙和微晶纖維素?zé)o降解活性。

以小麥阿拉伯木聚糖、櫸木木聚糖和CMC為底物反應(yīng)10 h后，利用HPAEC分析水解終產(chǎn)物。Xyn10A對小麥阿拉伯木聚糖和櫸木木聚糖的主要產(chǎn)物是木糖和木二糖 (圖4)。其中，Xyn10A以小麥阿拉伯木聚糖為底物時生成木糖和木二糖的量分別為695 μmol和1.98 mmol，以櫸木木聚糖為底物時生成木糖和木二糖的量分別為558 μmol和1.34 mmol，木二糖的產(chǎn)量是木糖的2.4倍。除此之外，小麥阿拉伯木聚糖和櫸木木聚糖的水解終產(chǎn)物中還檢測到其他的糖組分。Xyn10A對CMC的主要產(chǎn)物是葡萄糖、纖維二糖、纖維三糖和纖維四糖 (圖5)，產(chǎn)量分別為0.21、3.4、1.73和0.76 μmol，呈典型的內(nèi)切纖維素酶酶活。

表1 5 mmol/L金屬離子和化學(xué)試劑對TcXyn10A酶活的影響

圖4 TcXyn10A對小麥阿拉伯木聚糖和櫸木木聚糖的水解產(chǎn)物分析

2.5 結(jié)構(gòu)分析

以1K6A為模板，對Xyn10A進(jìn)行了同源建模。通過模型評估分析與優(yōu)化之后，對Xyn10A的結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行分析。如圖6所示，Xyn10A呈現(xiàn)典型的糖苷水解酶第10家族木聚糖酶 (β/α) 8桶狀結(jié)構(gòu)，可見Xyn10A的雙功能酶活性由該單一結(jié)構(gòu)域?qū)崿F(xiàn)。與其他GH10家族木聚糖酶相似，8個β折疊片相互連成氫鍵網(wǎng)，排列成內(nèi)桶；8個α-螺旋則在其間沿著相同的方向排列在β旋折疊桶的外側(cè)，成為外桶。無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu) (loop區(qū)) 連接β接折疊片和α疊螺旋，不同長度的loop區(qū)，其構(gòu)象不同。兩個嚴(yán)格保守的催化殘基 (Glu156和Glu262) 處于對立的位置，側(cè)鏈間的距離為5.5 ?。

3 討論

纖維素和木聚糖是植物細(xì)胞壁中主要的非淀粉多糖，二者的充分利用對于人類的可持續(xù)發(fā)展有著極為重要的現(xiàn)實意義，相關(guān)的研究報道也從未間斷[22-24]。但有意思的是，盡管有許多纖維素酶中發(fā)現(xiàn)了木聚糖酶活性，只有很少部分的木聚糖酶被檢測到纖維素酶活性[25]。本研究中，我們從嗜熱子囊菌JCM12803中克隆得到了一個GH10家族雙功能木聚糖酶Xyn10A。底物特異性分析結(jié)果顯示，Xyn10A不僅對櫸木木聚糖和小麥阿拉伯木聚糖有較高的酶活，而且也可降解CMC和地衣多糖底物，是一個典型的擁有纖維素酶活性的木聚糖酶。將Xyn10A與同類雙功能酶進(jìn)行比較 (表2)，Xyn10A的木聚糖酶活性要高于牦牛瘤胃、德米奎納菌sp.和熱解纖維素菌來源的雙功能酶，但Xyn10A的纖維素酶活要低于牦牛瘤胃來源的雙功能酶。經(jīng)過序列和同源建模結(jié)構(gòu)分析，Xyn10A只含有單一催化結(jié)構(gòu)域，兩個嚴(yán)格保守的催化殘基Glu156和Glu262分別位于催化口袋內(nèi)部的兩個loop區(qū)上，是典型的GH10家族木聚糖酶[26]。雙功能酶Xyn10A的獲得，一方面加深了我們對單結(jié)構(gòu)域雙功能木聚糖酶/纖維素酶的認(rèn)識，另一方面也為雙功能酶結(jié)構(gòu)與其功能關(guān)系的研究提供了很好的素材。

圖5 TcXyn10A對CMC的水解產(chǎn)物分析

圖6 TcXyn10A的同源建模模型

表2 TcXyn10A與同類雙功能酶酶活比較

本課題組對植物細(xì)胞壁多糖的高效酶學(xué)降解和利用進(jìn)行了較長時間的研究[29]。最近，我們還獲得了嗜熱厭氧細(xì)菌來源的第10家族木聚糖酶Xyn10C及其分別與木七糖和纖維六糖的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)[21]。為了探究Xyn10A降解木聚糖和纖維素的催化機(jī)制，在Xyn10A同源建模的基礎(chǔ)上，采用分子對接的方法分別獲得了Xyn10A與木七糖和纖維六糖的復(fù)合物結(jié)構(gòu)模型。如圖7A所示，木七糖位于Xyn10A狹窄的催化通道中，處于–3到+4位的構(gòu)象位置。–1位和+1位木糖單元連接的糖苷氧原子和Glu156的OE2原子間形成氫鍵 (3.0?)，而Glu262的側(cè)鏈與–1位木糖單元的C1原子 (異頭碳) 間隔3.5?的距離。根據(jù)糖苷水解酶的催化機(jī)制分析，催化殘基Glu156為質(zhì)子供體，Glu262為親核試劑[30]。在這種情況下，位于–1位的木糖單元將會扭曲成3,O船型構(gòu)象[31]。Trp112、Trp292和Trp300分別對–2位和–1位木糖單元提供了疏水作用力。–1位木糖單元的O2原子與Asn155的ND2原子，O3原子與Lys75的NZ原子、His108的NE2原子，O5原子與His234的NE2原子間形成氫鍵，進(jìn)一步增強(qiáng)了TcXyn10A與–1位木糖單元之間的結(jié)合力。除此之外，–2位木糖單元的O2原子與Trp292的NE1原子、Glu71的OE1原子，O3原子與Asn72的ND2原子，O5原子與Lys75的NZ原子形成氫鍵網(wǎng)絡(luò)。在木聚糖酶與木寡糖復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)中，–2位和–1位木糖單元與木聚糖酶之間的氫鍵相互作用數(shù)目最多。例如，來源于嗜熱土脂肪芽胞桿菌的木聚糖酶與木五糖的晶體復(fù)合物 (PDB ID: 1R87) 中，–2位和–1位木糖單元與酶之間形成的氫鍵數(shù)目分別為6個和9個[32]。從這一方面講，雙功能酶Xyn10A與其他已報道的木聚糖酶一致。雙功能酶Xyn10A與纖維六糖的結(jié)合模式如圖7B所示。纖維六糖與木聚糖底物共用催化通道，處于–2到+4位的構(gòu)象位置。位于–1位的葡萄糖單元與同樣位置的木糖單元構(gòu)象類似，糖苷氧原子和Glu156的OE2原子間形成氫鍵 (3.1 ?)，而Glu262的側(cè)鏈與異頭碳的間隔距離3.1 ?，這意味著雙功能酶Xyn10A對木聚糖和纖維素底物的降解，是通過共用一對催化殘基 (Glu156和Glu262) 來進(jìn)行酸堿催化的。與木糖相比，葡萄糖要多出C6和O6兩個原子。而相同的疏水作用力 (Trp112、Trp292和Trp300) 同樣在–2位和–1位 葡萄糖單元的位置呈現(xiàn)，氫鍵作用網(wǎng)絡(luò)也與木七糖相似。兩個結(jié)合模型中，木七糖與纖維六糖的整體構(gòu)象差異非常小 (圖7C)，這說明雙功能酶Xyn10A的催化口袋完全可以結(jié)合纖維寡糖，進(jìn)而將其降解。

雙功能酶Xyn10A對櫸木木聚糖和小麥阿拉伯木聚糖有較高的活性，分別為 (1 480±26) U/mg和 (2 055±28) U/mg；而對CMC和地衣多糖的降解活性相對較低，比活分別為 (7.4±0.2) U/mg和 (10.9±0.4) U/mg，提升空間較大。Ichinose等[33]對鏈霉菌E-86來源的木聚糖酶底物特異性進(jìn)行了改造，通過將底物–2位和–1位糖單元處的Gln88和Arg275突變成Ala，消除了空間位阻，使得葡萄糖的C6和O6原子能夠完全結(jié)合，對纖維素底物的親和力提高。這些成功案例的結(jié)果，結(jié)合Xyn10A與木七糖和纖維六糖結(jié)合模式的分析，對于雙功能酶的結(jié)構(gòu)與其功能的關(guān)系的研究有一定的參考價值。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

A novel bifunctional xylanase/cellulaseXyn10A fromJCM12803

Xiaoli Li1,2, Tao Tu2, Bin Yao2, Xiangming Xie1, and Huiying Luo2

1 College of Biological Sciences and Biotechnology, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China 2 Feed Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China

Efficient utilization of cellulose and xylan is of importance in the bioethanol industry. In this study, a novel bifunctional xylanase/cellulase gene,, was cloned fromJCM12803, and the gene product was successfully overexpressed inGS115. The recombinant protein was then purified and characterized. The pH and temperature optima ofXyn10A were determined to be 5.0 and 65?70 °C, respectively. The enzyme retained stable under acid to alkaline conditions (pH 3.0?11.0) or after 1-h treatment at 60 °C. The specific activities ofXyn10A towards beechwood xylan, wheat arabinoxylan, sodium carboxymethyl cellulose and lichenan were (1 480±26) U/mg, (2 055±28) U/mg, (7.4±0.2) U/mg and (10.9±0.4) U/mg, respectively. Homologous modeling and molecular docking analyses indicated that the bifunctionalXyn10A has a single catalytic domain, in which the substrate xylan and cellulose shared the same binding cleft. This study provides a valuable material for the study of structure and function relationship of bifunctional enzymes.

JCM12803, bifunctional enzyme, xylanase, cellulase

February 22, 2018;

May 18, 2018

The Collaborative Innovation Project of Chinese Academy of Agricultural Sciences (No. CAAS-463 XTCX2016011-04-5).

Tao Tu. Tel: +86-10-82106065; E-mail: tutao@caas.cn

Huiying Luo. Tel: +86-10-82106065; E-mail: luohuiying@caas.cn

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院協(xié)同創(chuàng)新項目 (No. CAAS-463 XTCX2016011-04-5) 資助。

2018-06-25

10.13345/j.cjb.180067

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20180622.1455.006.html