豬源轉(zhuǎn)錄因子AP-2δ通過增強(qiáng)rep基因啟動子活性促進(jìn)豬圓環(huán)病毒2型的復(fù)制

王越，宋東峰，林翠，李佳容，王勝男，顧金燕，周繼勇

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豬源轉(zhuǎn)錄因子AP-2δ通過增強(qiáng)基因啟動子活性促進(jìn)豬圓環(huán)病毒2型的復(fù)制

王越1，宋東峰1，林翠2，李佳容1，王勝男1，顧金燕1，周繼勇2

1 南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 免疫研究所，江蘇 南京 210095 2 浙江大學(xué) 農(nóng)業(yè)部動物病毒學(xué)重點(diǎn)實驗室，浙江 杭州 310058

王越, 宋東峰, 林翠, 等. 豬源轉(zhuǎn)錄因子AP-2δ通過增強(qiáng)rep基因啟動子活性促進(jìn)豬圓環(huán)病毒2型的復(fù)制. 生物工程學(xué)報, 2018, 34(12): 1985–1995.Wang Y, Song DF, Lin C, et al. Porcine transcription factor AP-2δ promotes porcine circovirus type 2 replication through enhancing the activity of the rep gene promoter. Chin J Biotech, 2018, 34(12): 1985–1995.

本研究旨在探究豬圓環(huán)病毒2型 (Porcine circovirus type 2, PCV2) 能否借助基因啟動子區(qū)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)調(diào)控自身基因轉(zhuǎn)錄，并尋找參與這一調(diào)控過程的宿主因子。凝膠遷移實驗證實基因啟動子具有核蛋白結(jié)合活性。DNA-pull down聯(lián)合液相-串聯(lián)質(zhì)譜分析鑒定到了可與基因啟動子結(jié)合的豬源轉(zhuǎn)錄因子AP-2δ (Porcine transcription factor AP-2δ, poTFAP2δ)。雙熒光素酶報告基因試驗、實時熒光定量PCR、免疫印跡及間接免疫熒光等試驗證明poTFAP2δ不僅可以特異性地增強(qiáng)基因啟動子活性，而且可以在PCV2感染過程中促進(jìn)和基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯及PCV2病毒滴度。文中揭示了PCV2利用宿主蛋白促進(jìn)自身增殖的分子機(jī)制，為進(jìn)一步從病毒與宿主互作角度闡明PCV2的致病機(jī)制提供新的研究思路，亦為PCV2高效疫苗的研制提供理論基礎(chǔ)。

豬圓環(huán)病毒2型，基因啟動子，轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，豬源轉(zhuǎn)錄因子AP-2δ

豬圓環(huán)病毒2型 (Porcine circovirus type 2，PCV2) 屬于圓環(huán)病毒科，無囊膜，直徑約12?23 nm，具有大約1.7 kb的單鏈環(huán)狀DNA基因組[1]，是豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病 (PCV2-associated disease, PCVAD) 的主要病原體，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2-5]。

PCV2的基因編碼衣殼蛋白Cap，作為PCV2唯一的結(jié)構(gòu)蛋白及主要的免疫原性蛋白，Cap蛋白在病毒入侵及致病性方面發(fā)揮重要作用[6-8]。PCV2的基因編碼兩個病毒復(fù)制相關(guān)蛋白Rep和Rep′，Rep和Rep′能夠與位于基因間區(qū)復(fù)制起點(diǎn) () 內(nèi)的特定序列結(jié)合，啟動PCV2復(fù)制[9-12]。PCV2基因啟動子區(qū)存在一個類干擾素刺激反應(yīng)元件 (Interferon-stimulated response element，ISRE)，這個類ISRE作為一個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn) (Transcription factor binding sites，TFBS)，可以促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄及病毒增殖[13]，本研究旨在探究PCV2基因啟動子是否具有利用類ISRE等TFBSs調(diào)控自身基因轉(zhuǎn)錄的生物學(xué)特性，并鑒定參與這一調(diào)控過程的宿主蛋白。

研究表明，某些病毒的基因啟動子可以與宿主轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，通過調(diào)控病毒基因的啟動子活性而調(diào)節(jié)自身基因的轉(zhuǎn)錄及翻譯。如單純皰疹病毒1型 (Herpes simplex virus type 1，HSV-1)、人乳頭瘤病毒 (Human papillomavirus，HPV) 的啟動子均具有利用宿主轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)啟動子活性的功能。本研究通過分析發(fā)現(xiàn)，PCV2基因啟動子上除了擁有一個已知的類ISRE，還存在其他一些潛在的TFBSs，這些TFBSs是否具有生物學(xué)功能？何種宿主蛋白可與之結(jié)合并調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄？

本研究通過DNA-pull down聯(lián)合液相-串聯(lián)質(zhì)譜分析 (Liquid chromatography-tandem mass spectrometric，LC-MS/MS) 等試驗鑒定出豬源轉(zhuǎn)錄因子AP-2δ (Porcine transcription factor AP-2δ，poTFAP2δ) 可以在體外與基因啟動子結(jié)合。據(jù)報道，TFAP2家族蛋白具有與病毒基因啟動子結(jié)合并調(diào)控啟動子活性的功能，如TFAP2能與EB病毒 (Epstein-Barr virus, EBV) 及人類免疫缺陷病毒 (Human immunodeficiency virus，HIV) 等病毒的啟動子結(jié)合，調(diào)控病毒基因的表達(dá)[14-16]。本研究通過一系列試驗證明，poTFAP2δ不僅能夠顯著增強(qiáng)PCV2基因啟動子活性及/基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，還能在一定程度上促進(jìn)PCV2的病毒滴度。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和病毒

無PCV污染的豬腎細(xì)胞系 (Porcine kidney epithelial cell line，PK15) 由本實驗室保存，在含有8%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。PCV2 HZ0201毒株 (GenBank登錄號：AY188355) 為本實驗室分離保存，病毒毒價為106.4TCID50/0.1 mL。

1.2 主要試劑及載體

雙熒光素酶報告系統(tǒng)質(zhì)粒pGL3-Basic (Basic) 和pRL-TK均購自Promega公司；真核表達(dá)載體pCMV-N-Myc (Myc-Empty Vector, Myc-EV) 由本實驗室保存；RPMI-1640培養(yǎng)基購自Hyclone公司；胎牛血清購自Biological Industries公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒、細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒均購自碧云天公司；限制性內(nèi)切酶購自New England BioLabs公司；蛋白Marker、EMSA化學(xué)發(fā)光試劑盒、尼龍膜均購自Thermo Fisher Scientific公司；0.22 μm無菌濾器購自Millipore公司；DNA膠純化試劑盒購自Axygen公司；質(zhì)粒小提試劑盒購自Tiangen公司；熒光定量PCR試劑 (SYBR Green Master Mix)、一步克隆法試劑盒 (Clonexpress II one step cloning kit)、增強(qiáng)型ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒均購自諾唯贊公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3 000及鏈霉親和素磁珠均購自Invitrogen公司；鼠抗Myc單抗購自Biolegend公司；兔抗β-actin單抗購自杭州華安生物技術(shù)有限公司；鼠抗Rep單抗 (2E11) 及鼠抗Cap單抗 (5E11) 為本實驗室制備并保存；HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG、HRP標(biāo)記羊抗兔IgG、FITC標(biāo)記羊抗鼠IgG均購自KPL公司。

1.3 rep基因啟動子區(qū)潛在TFBSs預(yù)測及分析

PCV2基因啟動子位于基因的上游，從–193 nt至，共193 bp (圖1)。本研究用在線數(shù)據(jù)庫JASPAR (http://jaspar.genereg.net/) 對PCV2基因啟動子進(jìn)行潛在TFBSs的預(yù)測，對預(yù)測分值較高 (score>10) 的位點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)分析。

1.4 凝膠遷移實驗 (Electrophoretic mobility shift assay, EMSA) 驗證rep基因啟動子的核蛋白結(jié)合活性

根據(jù)基因啟動子潛在TFBSs預(yù)測及分析結(jié)果，本研究設(shè)計了用于EMSA試驗的互補(bǔ)生物素標(biāo)記的單鏈核酸探針p119biotin-s和p119biotin-a (表1) 及未標(biāo)記的競爭探針并委托金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行合成。p119biotin-s和p119biotin-a為5￠端生物素標(biāo)記的長度為119 nt (–133 nt至–15 nt，圖1) 的互補(bǔ)單鏈核苷酸序列，包含EGR、SP、KLF、ZNF、YY、TFAP2、XBP、Crem、Atf、IRF等主要潛在TFBSs，競爭探針為沒有生物素標(biāo)記的同序列單鏈探針。單鏈探針進(jìn)行退火操作后可獲得用于EMSA試驗的雙鏈生物素標(biāo)記探針p119biotin及競爭探針p119。

細(xì)胞核蛋白抽提按細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒操作說明進(jìn)行，將PK15細(xì)胞接種于25 cm2細(xì)胞瓶，常規(guī)培養(yǎng)至細(xì)胞密度約為90%，從3×106個PK15細(xì)胞中抽提細(xì)胞核蛋白用于EMSA試驗。EMSA試驗按照EMSA化學(xué)發(fā)光試劑盒操作說明進(jìn)行，反應(yīng)體系如下：p119biotin (1×104fmol/L)，2 μL，10×結(jié)合緩沖液2 μL，細(xì)胞核蛋白提取物4 μL，p193 (1×103pmol/L)，4 μL。

表1 本研究所用引物及探針序列

1.5 DNA-pull down聯(lián)合LC-MS/MS鑒定結(jié)合蛋白

為了探索能與PCV2基因啟動子結(jié)合的宿主轉(zhuǎn)錄因子，本研究采用DNA-pull down聯(lián)合LC-MS/MS技術(shù)進(jìn)行鑒定。具體步驟如下：將5 μg p119biotin與500 μg PK15細(xì)胞核蛋白提取物室溫孵育30 min，加入鏈霉親和素標(biāo)記的磁珠充分混勻，4 ℃翻轉(zhuǎn)過夜，利用磁力架反復(fù)清洗3次，最后將沉淀進(jìn)行LC-MS/MS蛋白鑒定 (上海博苑生物科技有限公司)。

1.6 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

poTFAP2δ基因根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中的預(yù)測序列 (GenBank登錄號：XM_003356639) 委托生工生物工程 (上海) 股份有限公司進(jìn)行基因合成，并利用一步克隆法構(gòu)建真核表達(dá)載體pCMV-N- Myc-poTFAP2δ (Myc-poTFAP2δ)。PCV2基因啟動子測試載體pGL3-Basic-p193 (p193) 由本實驗室保存。

1.7 雙熒光素酶報告基因試驗

PK15細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞板，常規(guī)培養(yǎng)24 h至細(xì)胞密度約為75%，用Lipofectamine 3000將Basic/pRL-TK、p193/pRL-TK分別與Myc-EV和Myc-poTFAP2δ共轉(zhuǎn)染PK15細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h后依據(jù)雙熒光素酶檢測試劑盒說明書進(jìn)行相對熒光素酶活性檢測，分析poTFAP2δ對基因啟動子活性的影響。

1.8 實時熒光定量PCR (Quantitative real-time PCR, qPCR)

將PK15細(xì)胞接種于12孔板，常規(guī)培養(yǎng)24 h至細(xì)胞密度約為75%，用Lipofectamine 3000將Myc-EV和Myc-poTFAP2δ分別轉(zhuǎn)染PK15細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h后，以感染復(fù)數(shù) (Multiplicity of infection, MOI) =1的PCV2 HZ0201毒株感染該細(xì)胞，在感染后24、48、72 h收取細(xì)胞，trizol法抽提病毒RNA，取10 ng進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得病毒cDNA，用qPCR (SYBR法) 檢測、的mRNA水平。qPCR引物如表1所示，兩步法qPCR反應(yīng)程序按SYBR Green Master Mix使用說明書進(jìn)行。

1.9 免疫印跡試驗 (Western blotting, WB)

將Myc-EV和Myc-poTFAP2δ在PK15細(xì)胞上瞬時過表達(dá)后接種PCV2 HZ0201 (MOI=1)，方法如1.8所述，病毒感染24、48、72 h后收集細(xì)胞，裂解蛋白樣品后WB檢測Rep及Cap的蛋白表達(dá)水平。WB所用一抗分別為鼠抗Myc單抗 (1∶1 000)、兔抗β-actin單抗 (1∶1 000)、鼠抗Rep單抗2E11 (1∶500) 和鼠抗Cap單抗5E11 (1∶500)，二抗分別為HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG (1∶7 500) 和HRP標(biāo)記羊抗兔IgG (1∶7 500)。最后加入ECL顯色液用Amersham Imager 600超敏多功能成像儀顯色，用ImageJ軟件進(jìn)行灰度值分析，計算Rep和Cap對β-actin的比率。

1.10 間接免疫熒光試驗 (Indirect immunofluorescent assay, IFA) 測定PCV2病毒滴度

將Myc-EV和Myc-poTFAP2δ在PK15細(xì)胞上瞬時過表達(dá)后接種PCV2 HZ0201 (MOI=1)，方法如1.8所述，在感染后24、48、72 h收取板子，反復(fù)凍融3次后收集病毒樣品，4 ℃、12 000 r/min離心10 min后收取上清，利用IFA測定樣品中病毒的半數(shù)組織培養(yǎng)感染量 (Median tissue culture infectious dose, TCID50)。IFA所用一抗為鼠抗Cap單抗5E11 (1∶500)，二抗為FITC標(biāo)記羊抗鼠IgG (1∶350)。最后，用Reed-Muench方法計算各樣品中PCV2的TCID50。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCV2 rep基因啟動子上存在多個潛在的TFBSs

為了探究PCV2基因啟動子是否具有利用宿主轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)自身啟動子活性的功能，本研究利用JASPAR數(shù)據(jù)庫對基因啟動子進(jìn)行潛在TFBSs的預(yù)測分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該啟動子上存在多處潛在的TFBSs，如圖1所示，評分較高 (score>10) 的有EGR、SP、KLF、ZNF、YY、TFAP、XBP、Crem、Atf、IRF等TFBSs，這些位點(diǎn)集中在基因啟動子的中間位置 (–133 nt至–15 nt, 119 bp)，所以推測這段序列是基因啟動子的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合核心區(qū)域。

2.2 PCV2 rep基因啟動子具有核蛋白結(jié)合活性

根據(jù)潛在TFBSs的預(yù)測結(jié)果，將基因啟動子的關(guān)鍵序列119 bp合成標(biāo)記探針p119biotin及競爭探針p119，利用EMSA驗證基因啟動子的核蛋白結(jié)合活性。結(jié)果如圖2所示，當(dāng)標(biāo)記探針中加入PK15細(xì)胞核蛋白提取物時，p119biotin出現(xiàn)了明顯的遷移條帶，說明PK15細(xì)胞核蛋白提取物中存在與p119biotin結(jié)合的宿主蛋白；但是，當(dāng)加入競爭探針p119時遷移條帶消失，說明這種蛋白與探針的結(jié)合具有高度特異性。

圖1 PCV2 rep基因啟動子區(qū)潛在TFBSs預(yù)測圖

圖2 EMSA驗證rep基因啟動子的核蛋白結(jié)合活性

2.3 poTFAP2δ可以與PCV2 rep基因啟動子結(jié)合

為了探究何種核蛋白可以與PCV2基因啟動子結(jié)合，本研究以p119biotin為探針進(jìn)行DNA-pull down聯(lián)合LC-MS/MS試驗，將DNA- pull down后能與p119biotin結(jié)合的細(xì)胞核蛋白進(jìn)行LC-MS/MS分析，質(zhì)譜鑒定結(jié)果顯示，與基因啟動子序列結(jié)合的蛋白中有poTFAP2δ，這個發(fā)現(xiàn)與基因啟動子的潛在TFBSs預(yù)測結(jié)果相吻合，所以推測poTFAP2δ可能在基因的轉(zhuǎn)錄啟動方面發(fā)揮重要作用。

2.4 poTFAP2δ對PCV2 rep基因啟動子的活性具有促進(jìn)作用

為了探究poTFAP2δ是否可以特異性增強(qiáng)基因啟動子活性，本研究比較了基因啟動子在poTFAP2δ瞬時過表達(dá)及對照PK15細(xì)胞中的啟動子活性差異。結(jié)果如圖3所示，在poTFAP2δ瞬時過表達(dá)的PK15細(xì)胞中，p193的平均相對熒光素酶活性為16.95，而其在對照PK15細(xì)胞中的平均相對熒光素酶活性僅為7.732，差異顯著，這個結(jié)果充分證明poTFAP2δ對基因啟動子活性具有顯著的促進(jìn)作用。

圖3 poTFAP2δ對PCV2 rep基因啟動子活性的影響

2.5 poTFAP2δ對PCV2 rep、cap基因的轉(zhuǎn)錄及翻譯具有促進(jìn)作用

poTFAP2δ可以促進(jìn)基因的啟動子活性，那么是否也能促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，從而進(jìn)一步促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄及翻譯？為了探究這個問題，試驗將PCV2分別接種poTFAP2δ瞬時過表達(dá)及對照PK15細(xì)胞，感染24、48、72 h后檢測、基因mRNA及蛋白表達(dá)水平的差異。結(jié)果如圖4所示，在poTFAP2δ瞬時過表達(dá)的PK15細(xì)胞中，PCV2mRNA的平均表達(dá)水平在病毒感染后24、48、72 h分別是對照組的2.133、1.587、2.444倍，而PCV2mRNA的平均表達(dá)水平在病毒感染后24、48、72 h分別是對照組的2.196、1.993、1.811倍。不論在病毒感染后24、48 h還是72 h，poTFAP2δ過表達(dá)后病毒基因mRNA水平均顯著上調(diào)，說明在PCV2感染過程中poTFAP2δ可以持續(xù)顯著促進(jìn)及基因的轉(zhuǎn)錄。

poTFAP2δ是否能進(jìn)一步促進(jìn)Rep及Cap蛋白的表達(dá)？結(jié)果如圖5所示，將WB試驗所檢測的Rep、Cap蛋白與β-actin蛋白條帶進(jìn)行灰度值比值分析，發(fā)現(xiàn)在poTFAP2δ瞬時過表達(dá)的PK15細(xì)胞中，PCV2 Rep蛋白的平均相對表達(dá)水平在病毒感染后24、48、72 h分別為0.295、1.858、3.985，而對照組為0.183、1.144、2.361，說明在PCV2感染后24、48、72 h，poTFAP2δ過表達(dá)均能上調(diào)Rep蛋白的表達(dá)量，雖然感染后24、48 h上調(diào)不顯著，但是72 h上調(diào)極顯著；同樣的，在poTFAP2δ瞬時過表達(dá)的PK15細(xì)胞中，PCV2 Cap蛋白的平均相對表達(dá)水平在病毒感染后24、48、72 h分別是0.520、1.390、2.790，而對照組為0.512、0.883、1.997，說明在PCV2感染后24、48、72 h，poTFAP2δ過表達(dá)均能上調(diào)Cap蛋白的表達(dá)量，雖然感染后24 h上調(diào)不顯著，但48 h上調(diào)顯著，72 h上調(diào)極顯著。這兩組試驗結(jié)果說明poTFAP2δ過表達(dá)能在PCV2感染的整個過程中持續(xù)促進(jìn)Rep及Cap蛋白的表達(dá)，且這種促進(jìn)作用隨著感染進(jìn)程的推進(jìn)而增強(qiáng)。依據(jù)以上實驗結(jié)果推測，在PCV2感染過程中，poTFAP2δ不僅可以促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄及翻譯，而且能通過促進(jìn)Rep蛋白的表達(dá)進(jìn)一步促進(jìn)PCV2基因的轉(zhuǎn)錄及翻譯。

2.6 poTFAP2δ對PCV2病毒增殖具有一定的促進(jìn)作用

為了確認(rèn)poTFAP2δ是否可以增加PCV2病毒滴度，本研究利用IFA對PCV2在poTFAP2δ瞬時過表達(dá)及對照PK15細(xì)胞上的TCID50進(jìn)行測定，結(jié)果如圖6所示。在對照PK15細(xì)胞上，PCV2感染后24、48、72 h的平均滴度為103.250/0.1 mL、103.667/0.1 mL、104.333/0.1 mL，而在poTFAP2δ瞬時過表達(dá)PK15細(xì)胞中則為103.417/0.1 mL、104.000/0.1 mL、104.917/0.1 mL。瞬時過表達(dá)組與對照組PCV2在感染后24、48、72 h的病毒滴度比值分別為1.469、2.153和3.837。雖然檢驗分析顯示，poTFAP2δ瞬時過表達(dá)組與對照組的差異并不顯著，但是滴度比值顯示，poTFAP2δ對PCV2的滴度還是具有一定的促進(jìn)作用，說明poTFAP2δ可以在一定程度上促進(jìn)PCV2的增殖。

圖4 poTFAP2δ對rep及cap基因mRNA表達(dá)水平的影響

圖5 poTFAP2δ對Rep及Cap蛋白表達(dá)水平的影響

圖6 poTFAP2δ對PCV2病毒滴度的影響

3 討論

作為嚴(yán)格的細(xì)胞內(nèi)寄生微生物，病毒利用宿主蛋白調(diào)控自身增殖是許多病毒的普遍生存法則。在自然界中，病毒利用宿主轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控自身基因啟動子活性，從而調(diào)節(jié)病毒基因轉(zhuǎn)錄及翻譯的情況并不罕見，如HIV-1基因組5￠末端的長末端重復(fù)序列 (Long terminal repeat, LTR)，作為啟動子，LTR可以借助NF-κB、SP及TATA盒等TFBSs與宿主轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合調(diào)控自身的基因轉(zhuǎn)錄[17-18]；HSV-1的LAT啟動子，可以與宿主細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子結(jié)合，調(diào)控病毒啟動子活性[19]；HPV的E6/E7基因啟動子P97，可以與細(xì)胞因子YY1結(jié)合而下調(diào)自身基因轉(zhuǎn)錄活性[20]；恒河猴皰疹病毒 (Rhesus rhadinovirus, RRV) 的復(fù)制和反式激活子 (Replication and transactivator, Rta) 的啟動子，可以與宿主Sp蛋白結(jié)合，啟動Rta的轉(zhuǎn)錄翻譯，實現(xiàn)RRV的潛伏感染[21]。

PCV2作為最小的動物病毒之一，基因組僅為1.7 kb，表達(dá)的蛋白非常有限，為了更好地生存，它是否也存在利用宿主蛋白調(diào)控自身增殖的復(fù)制機(jī)制？前期研究發(fā)現(xiàn)，PCV2基因啟動子區(qū)存在一個類ISRE，與PCV2基因啟動子的活性、病毒的復(fù)制增殖及干擾素促進(jìn)PCV2增殖的功能均相關(guān)，但具體機(jī)制還未得到闡釋。PCV2基因啟動子是否能像HIV-1 LTR等病毒啟動子一樣存在一系列TFBSs，通過與宿主轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合調(diào)控病毒基因轉(zhuǎn)錄，從而突破自身編碼蛋白有限的困境？

本研究通過在線數(shù)據(jù)庫對PCV2基因啟動子區(qū)進(jìn)行潛在TFBSs的預(yù)測，結(jié)果顯示，這個啟動子上除了有類ISRE，還存在諸如EGR、SP、KLF、TFAP2等一系列TFBSs，這些位點(diǎn)均集中在啟動子中部的119 bp (–133 nt至–15 nt)，特別是位于–133 nt至–120 nt的位點(diǎn)“GGCGGGGGTGGAGG”、位于–86 nt至–69 nt的位點(diǎn)“TGGCTGCGGGGGC GGTGT”和位于–46 nt至–33 nt的位點(diǎn)“TTGGA TACGTCATA”，這三個位點(diǎn)均含有一些分值較高的潛在TFBSs，推測可能是啟動子與宿主轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的核心區(qū)域。

EMSA證明了基因啟動子確實能與宿主核蛋白結(jié)合，DNA-pull down聯(lián)合LC-MS/MS將這些結(jié)合蛋白鑒定為包含有轉(zhuǎn)錄因子的一系列宿主核蛋白 (數(shù)據(jù)未展示)，其中包括poTFAP2δ。TFAP2家族是序列特異性的DNA結(jié)合蛋白，在動物發(fā)育、分化和腫瘤發(fā)生過程中調(diào)控基因表達(dá)，發(fā)揮重要作用[22]。哺乳動物普遍存在5個TFAP2基因 (TFAP2α/β/γ/δ/ε)，分別編碼TFAP2α/β/γ/δ/ε蛋白。TFAP2家族常表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，基因缺失小鼠實驗表明TFAP2家族對發(fā)育極其關(guān)鍵，常為致死性缺失[23-30]。TFAP2δ與TFAP2家族其他成員的相似度最低，對于TFAP2家族蛋白功能極其重要的8個保守殘基，TFAP2δ僅有3個[31-33]。據(jù)報道，TFAP2家族蛋白具有與病毒基因啟動子結(jié)合并調(diào)控啟動子活性的功能，如TFAP2α/β/γ能與EBV的LMP1基因啟動子結(jié)合，促進(jìn)LMP1蛋白的表達(dá)，穩(wěn)定EBV的潛伏感染[14-15]；TFAP2還可以與HIV-1的LTR結(jié)合，調(diào)控HIV-1基因的表達(dá)[16]。巧合的是，在預(yù)測的基因啟動子潛在TFBSs結(jié)果中也存在TFAP2位點(diǎn)，那么poTFAP2δ是否可以與基因啟動子結(jié)合而調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄？通過啟動子活性試驗、qPCR、WB及IFA等一系列試驗，表明poTFAP2δ不僅可以促進(jìn)基因啟動子的活性，而且可以在PCV2感染過程中持續(xù)促進(jìn)及基因的轉(zhuǎn)錄及翻譯，最后對PCV2的病毒滴度也有一定的促進(jìn)作用。

PCV2自身不編碼復(fù)制酶，主要依靠細(xì)胞有絲分裂S期表達(dá)的酶及蛋白進(jìn)行滾環(huán)復(fù)制，PCV2的復(fù)制起始依賴于Rep及Rep′蛋白與PCV2復(fù)制子的結(jié)合，所以基因的轉(zhuǎn)錄翻譯在PCV2復(fù)制增殖中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。我們基于本研究的結(jié)果推測，poTFAP2δ可以特異性地與基因啟動子區(qū)某位點(diǎn)結(jié)合啟動或促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄，翻譯所得的大量Rep及Rep′蛋白啟動病毒復(fù)制，產(chǎn)生更多的PCV2基因組及基因轉(zhuǎn)錄所需的模板，導(dǎo)致Cap蛋白的大量表達(dá)，保證了PCV2病毒包裝所需衣殼蛋白及基因組的供給，于是病毒滴度增加。從試驗結(jié)果可見，poTFAP2δ對PCV2 Rep、Cap蛋白及病毒滴度的促進(jìn)均具有時間依賴性，隨著PCV2感染進(jìn)程的推進(jìn)，這種促進(jìn)作用越來越強(qiáng)，說明以上推測的poTFAP2δ對PCV2復(fù)制增殖的促進(jìn)是一個不斷累加的循環(huán)過程。至于poTFAP2δ是否與預(yù)測的TFAP2位點(diǎn)“TGGCTGCGGGGGCGGTGT” (–86 nt至–69 nt) 結(jié)合，還需要大量的后續(xù)試驗驗證。

本研究首次證明了PCV2基因啟動子具有通過利用宿主轉(zhuǎn)錄因子poTFAP2δ促進(jìn)病毒基因轉(zhuǎn)錄、翻譯及病毒滴度的生物學(xué)功能，從病毒利用宿主因子的角度闡釋了PCV2的復(fù)制機(jī)制。該研究結(jié)果為進(jìn)一步從病毒與宿主互作角度闡明PCV2的致病機(jī)制提供新的研究思路，亦為PCV2高效疫苗的研制提供了理論基礎(chǔ)。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

Porcine transcription factor AP-2δ promotes porcine circovirus type 2 replication through enhancing the activity of thegene promoter

Yue Wang1, Dongfeng Song1, Cui Lin2, Jiarong Li1, Shengnan Wang1, Jinyan Gu1, and Jiyong Zhou2

1 Institute of Immunology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, Jiangsu, China 2 Key Laboratory of Animal Virology of Ministry of Agriculture, Zhejiang University, Hangzhou 310058, Zhejiang, China

Several putative transcription factor binding sites (TFBSs) exist in the PCV2gene promoter. To explore if porcine circovirus type 2 (PCV2) could regulate the viral replication by using these TFBSs, we conducted electrophoretic mobility shift assay (EMSA), DNA-pull down and liquid chromatography-tandem mass spectrometric (LC-MS/MS) assays. EMSA confirmed the binding activity of thegene promoter with nuclear proteins of host cells. DNA-pull down and LC-MS/MS identified the porcine transcription factor AP-2δ (poTFAP2δ) could bind the PCV2gene promoter.Dual-luciferase reporter assay, quantitative real-time PCR, Western blotting and indirect immunofluorescent assay demonstrated that poTFAP2δ could not only promote the activity of thegene promoter, but also enhance the transcription/translation activity of the/gene and the virus titer of PCV2 during the entire life cycle of PCV2 infection. This study revealed the molecular mechanism of PCV2 using host proteins to enhance the viral replication, provided a new perspective for studying the pathogenic mechanism of PCV2 from virus and host interactions, and provided a theoretical basis for developing highly effective PCV2 vaccines.

porcine circovirus type 2,gene promoter, transcription factor binding sites, porcine transcription factor AP-2δ

February 22, 2018;

May 9, 2018

National Key Technology R & D Program of China (No. 2015BAD12B01), National Natural Science Foundation of China (No. 31402198), the Fundamental Research Funds for the Central Universities (Nos. KJQN201524, KYZ201730), the Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions.

s:Jinyan Gu. Tel: +86-25-84396068; Fax: +86-25-84395166; E-mail: gjy@njau.edu.cn

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2018-06-06

10.13345/j.cjb.180069

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20180605.1654.001.html