煙草新型體細(xì)胞胚結(jié)構(gòu)類(lèi)蛙卵體的誘導(dǎo)發(fā)生

吳建新，徐克東，王 偉，李成偉,4*，吳建宇

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450002； 2.周口師范學(xué)院 植物遺傳與分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 周口 466001； 3.河南省作物分子育種與生物反應(yīng)器重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 周口 466001；4.河南科技學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

植物體細(xì)胞胚發(fā)生(Somatic embryogenesis, SE)是植物體細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)或自發(fā)，重新編程其發(fā)生發(fā)育，轉(zhuǎn)化為胚性細(xì)胞，并進(jìn)一步分化為體細(xì)胞胚的無(wú)性繁殖過(guò)程。植物體細(xì)胞胚屬于非合子胚，多起源于單細(xì)胞，異于無(wú)融合生殖胚，并區(qū)別于植物組培器官發(fā)生過(guò)程中芽與根的分化[1]。體細(xì)胞胚結(jié)構(gòu)具有發(fā)育兩極性[2]、高度敏感性、生理隔離性(可自然脫毒)、相對(duì)穩(wěn)定的遺傳性(再生植株變異率低)、高效再生性、發(fā)育重演性、適于懸浮培養(yǎng)，以及轉(zhuǎn)化無(wú)嵌合等優(yōu)點(diǎn)[3-6]。在基礎(chǔ)研究方面，體細(xì)胞胚是研究合子胚發(fā)育的理想試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，具有合子胚無(wú)法比擬的可排除非胚性母體組織影響的優(yōu)勢(shì)[7-8]。在植物體細(xì)胞胚的應(yīng)用研究方面，體細(xì)胞胚是高效遺傳轉(zhuǎn)化體系、無(wú)性變異株系獲得[7]、體細(xì)胞雜交種資源創(chuàng)制、人工種子制備、種質(zhì)資源保存等研究的關(guān)鍵。植物高頻再生體系是高效遺傳轉(zhuǎn)化體系構(gòu)建的重要前提，高效率的體細(xì)胞胚發(fā)生體系作為植物高頻再生體系的重要途徑之一，對(duì)于高效植物轉(zhuǎn)化體系的構(gòu)建也至關(guān)重要。同時(shí)，高效率的體細(xì)胞胚發(fā)生體系也是植物干細(xì)胞生物反應(yīng)器構(gòu)建的重要研究基礎(chǔ)[3,5]。

自Steward等[9]、Reinert等[10]建立胡蘿卜體細(xì)胞胚發(fā)生體系以來(lái)，研究者已在多種被子植物、裸子植物和蕨類(lèi)植物的組織、懸浮細(xì)胞系和原生質(zhì)體培養(yǎng)過(guò)程中成功誘導(dǎo)出了大量體細(xì)胞胚結(jié)構(gòu)。植物體細(xì)胞胚發(fā)生的常規(guī)結(jié)構(gòu)主要包括以下3種。(1)典型SE結(jié)構(gòu)。如雙子葉：原胚-球形胚-心形胚-魚(yú)雷胚-子葉胚；單子葉：原胚-球形胚-梨形或盾形胚；裸子植物：早期胚-晚期胚-子葉胚[2]；蕨類(lèi)植物：線(xiàn)性原胚-早期胚葉-晚期胚葉[11]，或直接與間接綠球體(Green globular body,GGB)[12]；(2)蘭科類(lèi)原球莖(Protocorm-like body,PLB)結(jié)構(gòu)；(3)薔薇屬PLB結(jié)構(gòu)[13-14]。為了更好地開(kāi)展植物體細(xì)胞胚發(fā)生方面的研究，尤其是為了組建高效的植物干細(xì)胞生物反應(yīng)器，筆者在國(guó)際上首次命名、報(bào)道了3種新型的植物體細(xì)胞胚結(jié)構(gòu)，分別為類(lèi)蛙卵體(Frog egg-like body,FELB)[3,5]、類(lèi)塊根體(Rhizoid tubers,RTB)[4]、類(lèi)珠芽體(Bulbil-like body,BLB)[6]等。煙草是茄科的代表植物，也是植物學(xué)等相關(guān)研究的經(jīng)典模式材料。在基因工程研究方面，研究者利用轉(zhuǎn)基因的方法，將外源基因?qū)霟煵葜校ㄟ^(guò)種植大面積的轉(zhuǎn)基因煙草，生產(chǎn)所需的疫苗或蛋白質(zhì)類(lèi)藥物，如Ebola Zaire疫苗[15-16]的開(kāi)發(fā)。然而，轉(zhuǎn)基因煙草干細(xì)胞系的發(fā)酵培養(yǎng)與大面積種植轉(zhuǎn)基因煙草相比，更利于疫苗、抗菌肽、植物源功能蛋白質(zhì)等基因工程產(chǎn)品的規(guī)?；a(chǎn)、富集、純化與開(kāi)發(fā)。因此，在煙草中，成功構(gòu)建一種利于其干細(xì)胞挖掘與分離的體細(xì)胞胚發(fā)生結(jié)構(gòu)顯得尤為重要，該技術(shù)體系也將為其他植物尤其是我國(guó)傳統(tǒng)名貴中草藥的植物源活性物質(zhì)干細(xì)胞生物反應(yīng)器[17-18]的構(gòu)建提供研究策略與思路。

1 材料和方法

1.1 植物材料的培養(yǎng)

選取種皮完整、顆粒飽滿(mǎn)的煙草(Nicotianatabacumvar W38)種子，于超凈工作臺(tái)中經(jīng)75%乙醇表面消毒30 s至1 min，無(wú)菌水沖洗3次，2.5%次氯酸鈉溶液消毒8～10 min，無(wú)菌水沖洗3～5次。將煙草種子播于1/2MS+10 g/L蔗糖(pH值5.8～6.06)的培養(yǎng)基上，16 h光照[150 μmol/(m2·s)]/8 h黑暗，(25±1)℃，培養(yǎng)20 d后可得到長(zhǎng)勢(shì)良好的煙草無(wú)菌苗。

1.2 FELB誘導(dǎo)發(fā)生

在MS培養(yǎng)基中添加不同質(zhì)量濃度的生長(zhǎng)素類(lèi)物質(zhì)NAA與2,4-D(0、5、10、15 mg/L)，其中含50 g/L蔗糖、7.8 g/L瓊脂粉，pH值5.80～6.06。培養(yǎng)基在0.15 kPa，121 ℃條件下濕熱滅菌20 min。取煙草無(wú)菌苗的根、莖和葉于無(wú)菌水中，將根、莖切成1 cm左右的莖段，葉片切至1 cm×1 cm左右的葉盤(pán)，置于無(wú)菌的濾紙上吸干多余水分。將葉片(近軸面向上)，莖段與根段(不考慮極性方向)平鋪于培養(yǎng)皿中誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，再將培養(yǎng)皿分別于光照[150 μmol/(m2·s)]、黑暗條件下，(25±1)℃進(jìn)行FELB誘導(dǎo)培養(yǎng)。

1.3 FELB胚體萌發(fā)再生誘導(dǎo)

在MS培養(yǎng)基中添加不同質(zhì)量濃度的BAP(0、0.5、1.0、1.5 mg/L)，其中含30 g/L蔗糖、7.8 g/L瓊脂粉，pH值5.80～6.06。培養(yǎng)基在0.15 kPa、121 ℃條件下濕熱滅菌18～20 min。將與母體分離的FELB個(gè)體(離體處理)或未與母體分離的FELB(原位處理)分別進(jìn)行胚體萌發(fā)再生誘導(dǎo)。并于16 h光照[120 μmol/(m2·s)]/8 h黑暗，(23±1)℃條件下進(jìn)行胚體萌發(fā)培養(yǎng)。

1.4 叢生芽生根誘導(dǎo)

以1/2MS為基本培養(yǎng)基，加入10 g/L蔗糖、0.5 mg/L NAA、1 mg/L GA3，調(diào)節(jié)pH值5.80～6.06，并添加7.8 g/L瓊脂粉。培養(yǎng)基在0.15 kPa、121 ℃條件下濕熱滅菌18～20 min。待叢生芽生長(zhǎng)至1～2 cm后，將其分株切下，置于生根培養(yǎng)基中，于16 h光照[150 μmol/(m2·s)]/8 h黑暗，(25±1)℃條件下進(jìn)行生根培養(yǎng)。

1.5 FELB起源的組織學(xué)分析

將愈傷組織與不同發(fā)育時(shí)期的FELB結(jié)構(gòu)于4%的多聚甲醛固定液[溶解于100 mmol/L的PBS(Phosphate buffer solution)，pH值7.2]中固定48～72 h。然后，分別采用50、100 g/L的蔗糖溶液脫水24～36 h。采用OCT(Optimum cutting temperature compound)包埋劑包埋。最后，采用冷凍切片機(jī)(CM1850，徠卡顯微系統(tǒng)有限公司，德國(guó))將材料切成8～10 μm的切片，置于載玻片上，采用光學(xué)顯微鏡(Olympus BX 41)進(jìn)行閱片鏡檢。

1.6 FELB結(jié)構(gòu)的胚性組化分析

通過(guò)雙染色法(伊文斯藍(lán)和醋酸洋紅)[3-5,19]，對(duì)所誘導(dǎo)的外植體(含有母體組織、特殊愈傷組織與FELB)進(jìn)行雙染色胚性鑒定。利用單反相機(jī)(Canon 600 D)進(jìn)行拍照。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

煙草的特殊愈傷組織、FELB結(jié)構(gòu)的誘導(dǎo)發(fā)生概率與FELB胚體萌發(fā)發(fā)生概率數(shù)據(jù)均采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析與差異顯著性檢測(cè)(ANOVA分析；99%和95%置信區(qū)間)[3-4,20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 FELB結(jié)構(gòu)的誘導(dǎo)

黑暗條件下，煙草的不同外植體(根、莖、葉)在含有10 mg/L 2,4-D的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)7 d后，外植體邊緣均出現(xiàn)了少量黏稠、透明的特殊愈傷組織(圖1B、C)，其中，葉片外植體的特殊愈傷誘導(dǎo)率可達(dá)100.00%，明顯高于根與莖段外植體的誘導(dǎo)效果(表1)。這與龍葵[3]、蔊菜[5]的FELB誘導(dǎo)過(guò)程中出現(xiàn)的特殊愈傷組織相同。14 d后在特殊愈傷組織中形成了淺色的類(lèi)蛙卵狀體細(xì)胞胚結(jié)構(gòu)[3](圖1G)。在3種外植體中，葉片的誘導(dǎo)效果最佳，F(xiàn)ELB誘導(dǎo)率可至97.77%，莖段次之(75.90%)，根的誘導(dǎo)效果較差(71.40%)(表2)。而3種外植體在添加不同濃度NAA的培養(yǎng)基中均未能成功誘導(dǎo)出FELB結(jié)構(gòu)。并且，在光照條件下，不同濃度的2,4-D與NAA的所有處理亦未能誘導(dǎo)出FELB結(jié)構(gòu)。當(dāng)生長(zhǎng)素類(lèi)似物2,4-D的質(zhì)量濃度高于或小于10 mg/L時(shí)也可以誘導(dǎo)出特殊愈傷組織和FELB，但是數(shù)量明顯減少(表2)。經(jīng)過(guò)胚性鑒定的雙染色(伊文斯藍(lán)和醋酸洋紅)處理可以發(fā)現(xiàn)，胚性細(xì)胞被染成淺色，而非胚性組織被染成了深色(圖1H與I)。

A．葉片外植體，bar=1 cm； B．7 d后形成少量愈傷，bar=1 cm； C．B圖局部放大，bar=0.5 cm； D．10 d形成少量FELB，bar=1 cm；E．D圖局部放大，并具有透明的粘性愈傷組織，bar=0.25 cm； F．誘導(dǎo)15 d后的FELB，bar=1 cm；G．F圖局部放大，示發(fā)育中的FELB，bar=0.25 cm； H．25 d后形成大量FELB，經(jīng)伊文斯蘭與醋酸洋紅雙染色，淺色為FELB胚體，深色為非胚性組織，bar=1 cm； I．H圖局部放大，bar=0.25 cm圖1 煙草W38葉片外植體FELB結(jié)構(gòu)的誘導(dǎo)發(fā)生

表1 2,4-D對(duì)煙草根、莖、葉外植體特殊愈傷組織誘導(dǎo)率的影響%

注：愈傷組織誘導(dǎo)率是指產(chǎn)生愈傷組織的外植體總數(shù)與所有接種的煙草外植體總數(shù)之比。每個(gè)外植體單個(gè)處理組的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差均由30個(gè)培養(yǎng)皿中的300個(gè)外植體(即30個(gè)重復(fù))統(tǒng)計(jì)獲得；大、小寫(xiě)字母分別表示在1%、5%的置信區(qū)間具有顯著差異，下同。

2.2 再生與生根誘導(dǎo)

將FELB外植體(離體與原位處理)轉(zhuǎn)移到再生培養(yǎng)基上誘導(dǎo)7 d后，其顏色由無(wú)色逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)闇\色(圖2G)，體積增大。誘導(dǎo)約10 d之后FELB的顏色變?yōu)樯钌?圖2H)，15 d誘導(dǎo)出叢生芽(圖2I)。

在光照條件下，不同質(zhì)量濃度BAP(1.0 mg/L、2.0 mg/L、3.0 mg/L)均可誘導(dǎo)FELB結(jié)構(gòu)完成胚體萌發(fā)成苗(圖2G—J)。其中，2.0 mg/L BAP的誘導(dǎo)效果最佳，對(duì)根、莖、葉外植體所產(chǎn)生FELB結(jié)構(gòu)的胚體萌發(fā)誘導(dǎo)率分別可至29.53%、15.27%、67.07%(表3)。而在黑暗條件下未能成功誘導(dǎo)FELB出苗。

表2 2,4-D對(duì)煙草根、莖、葉外植體FELB誘導(dǎo)率的影響 %

注：FELB誘導(dǎo)率是指產(chǎn)生FELB結(jié)構(gòu)的外植體總數(shù)與所有接種的煙草外植體總數(shù)之比。

A．葉片外植體； B．A圖的局部放大，示FELB結(jié)構(gòu)(誘導(dǎo)10 d)； C．離體FELB； D和E．不同發(fā)育階段FELB的醋酸洋紅染色；F．不同發(fā)育階段FELB的形態(tài)； G，H，I和J．FELB的再生誘導(dǎo)； K．FELB再生植株；L和O．再生植株單花和花序； N．再生植株的未成熟果實(shí)； M．再生植株的成熟種子圖2 煙草FELB結(jié)構(gòu)的發(fā)育流程與植株再生

表3 BAP對(duì)不同煙草外植體FELB胚體萌發(fā)再生率的影響%

注：FELB胚體萌發(fā)再生率是指發(fā)生胚體萌發(fā)的FELB結(jié)構(gòu)總數(shù)與所有進(jìn)行胚體萌發(fā)再生的煙草FELB總數(shù)之比。

2.3 FELB結(jié)構(gòu)的組織細(xì)胞學(xué)分析

煙草FELB結(jié)構(gòu)的發(fā)生發(fā)育流程主要?dú)v經(jīng)2個(gè)重要標(biāo)志階段，即球形胚(圖3C)和心形-魚(yú)雷過(guò)渡胚(圖3D)。在FELB的發(fā)生過(guò)程中，最先誘導(dǎo)出來(lái)的是透明狀的特殊愈傷組織，其結(jié)構(gòu)比較疏松，致密性差(圖3A)。隨著愈傷組織的增多，致密的細(xì)胞快速分裂區(qū)(FCDZ，即Fast-cell-division zone)[4]開(kāi)始出現(xiàn)，F(xiàn)ELB的細(xì)胞組成比較密集、緊湊(圖3B、C)。通過(guò)冷凍切片觀(guān)察和分析，發(fā)現(xiàn)FELB起源于葉片的薄壁組織(圖3D)，屬于內(nèi)起源發(fā)育方式。

A和B.FELB早期結(jié)構(gòu)，示FELB細(xì)胞快速分裂區(qū)(FCDZ)，bar=250 μm； C.FELB發(fā)育中期(球形胚)，bar=500 μm； D.FELB發(fā)育后期(心形-魚(yú)雷過(guò)渡胚)，bar=750 μm圖3 煙草FELB結(jié)構(gòu)不同發(fā)育階段的冷凍切片

3 結(jié)論與討論

在煙草FELB的誘導(dǎo)發(fā)生過(guò)程中，黑暗條件與2,4-D(10 mg/L)能夠高頻誘導(dǎo)出大量特殊的愈傷組織與FELB結(jié)構(gòu)，而添加不同濃度NAA的培養(yǎng)基，以及光照條件下的所有2,4-D和NAA處理組均未能誘導(dǎo)出FELB結(jié)構(gòu)。由此認(rèn)為，合適的生長(zhǎng)素類(lèi)物質(zhì)與濃度、避光是誘導(dǎo)煙草FELB成功的關(guān)鍵因素。并且，葉片的特殊愈傷組織與FELB產(chǎn)率最高，根次之，莖最少，這說(shuō)明同一受體植物材料的不同外植體對(duì)相同誘導(dǎo)條件的反應(yīng)不盡相同。在光照條件下，添加BAP(2.0 mg/L)的培養(yǎng)基可以高效地啟動(dòng)FELB再生成苗；但是，黑暗條件下，因缺失光的參與，致使無(wú)法啟動(dòng)煙草FELB胚體萌發(fā)的形態(tài)建成。這與之前研究龍葵、蔊菜FELB結(jié)構(gòu)的胚體萌發(fā)誘導(dǎo)結(jié)果是一致的，合適的光照處理與一定濃度的細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)是FELB胚體萌發(fā)成苗的關(guān)鍵因素[3,5]。

煙草FELB的發(fā)生發(fā)育和再生過(guò)程可以簡(jiǎn)單概述為：外植體—愈傷組織—FELB—成苗。在FELB的誘導(dǎo)發(fā)生過(guò)程中，筆者發(fā)現(xiàn)首先誘導(dǎo)出現(xiàn)的是特殊的愈傷組織，其排列比較疏松，細(xì)胞核較小，呈黏性和半透明狀態(tài)。繼而，在愈傷組織中逐步形成許多蛙卵狀的胚狀體。愈傷組織為胚狀體的早期發(fā)育提供了水分、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑等物質(zhì)的共質(zhì)體途徑傳遞與供給，以及保護(hù)作用。特別是胚體發(fā)育后期，特殊愈傷組織的逐步減少，為胚體的進(jìn)一步自我干燥、胚體萌發(fā)提供了良好的外周環(huán)境。FELB發(fā)生部位因其細(xì)胞的增殖速度以及新陳代謝旺盛，細(xì)胞核較大，染色體豐富，因此易被醋酸洋紅染成淺色。而愈傷組織部分的細(xì)胞增殖速度慢，新陳代謝速率不旺盛，細(xì)胞核較小，因此會(huì)被伊文斯蘭染成深色。筆者在鑒定區(qū)別龍葵[3]、蔊菜[5]等植物的FELB結(jié)構(gòu)與非胚性組織，以及其他胚體結(jié)構(gòu)如栝樓RTB[4]與非胚性組織等研究中，也得了印證。

研究發(fā)現(xiàn)，典型SE結(jié)構(gòu)、蘭科與薔薇屬PLB等體細(xì)胞胚結(jié)構(gòu)與煙草FELB結(jié)構(gòu)在誘導(dǎo)發(fā)生方法、發(fā)育流程、胚體萌發(fā)再生等方面均存在較大區(qū)別。比如，多數(shù)植物的SE結(jié)構(gòu)無(wú)需培萌再生誘導(dǎo)，其發(fā)育后期可以直接形成萌發(fā)狀態(tài)胚體；狗薔薇(Rosa canina)的PLB[13]結(jié)構(gòu)的發(fā)育流程為：薔薇小葉—愈傷組織—類(lèi)根體—PLB，并且單個(gè)PLB結(jié)構(gòu)可以形成多個(gè)獨(dú)立單胚，部分可進(jìn)行自發(fā)胚萌，亦可離體誘導(dǎo)再生。在煙草FELB結(jié)構(gòu)的誘導(dǎo)過(guò)程中，其誘導(dǎo)發(fā)生途徑相對(duì)簡(jiǎn)單、易于分離和便于人為調(diào)控分析。特別是，煙草FELB的發(fā)生誘導(dǎo)與其再生誘導(dǎo)存在著明顯的時(shí)空隔離，由兩步法完成。因此認(rèn)為，煙草FELB結(jié)構(gòu)不同于經(jīng)典SE、蘭科和薔薇屬PLB結(jié)構(gòu)，屬于一種新型的體細(xì)胞胚發(fā)生結(jié)構(gòu)。

煙草的轉(zhuǎn)化和再生體系[21]雖然已建立，但因其無(wú)菌苗培養(yǎng)等步驟以及轉(zhuǎn)化過(guò)程相對(duì)比較繁瑣。利用煙草新型體細(xì)胞胚FELB可以快速、高效建立其遺傳轉(zhuǎn)化體系，并由此可以獲得無(wú)菌、脫毒材料，為其他茄科植物的再生與轉(zhuǎn)化等相關(guān)研究提供了研究思路。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，煙草FELB結(jié)構(gòu)可以進(jìn)行超低溫保存，鑒于其發(fā)生誘導(dǎo)與再生誘導(dǎo)存在時(shí)空隔離，因此構(gòu)建了基于FELB結(jié)構(gòu)的煙草干細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系。由于FELB結(jié)構(gòu)的誘導(dǎo)路徑簡(jiǎn)單，應(yīng)用前景廣闊，所以深入研究煙草新型體細(xì)胞胚FELB結(jié)構(gòu)的發(fā)生、優(yōu)化其懸浮培養(yǎng)體系，對(duì)煙草干細(xì)胞生物反應(yīng)器的實(shí)驗(yàn)室初試、中試模型的構(gòu)建具有很高的理論價(jià)值和實(shí)踐意義。