番茄胚性愈傷組織誘導(dǎo)與增殖研究

許丁帆，劉艷軍，陶則滿，鮮睿，范麗娜，于祎晗，徐玖，楊靜慧

番茄胚性愈傷組織誘導(dǎo)與增殖研究

許丁帆，劉艷軍通信作者，陶則滿，鮮睿，范麗娜，于祎晗，徐玖，楊靜慧

（天津農(nóng)學(xué)院園藝園林學(xué)院，天津 300384）

為建立番茄胚性愈傷組織繁殖體系，將番茄合子胚接種于不同培養(yǎng)基上進(jìn)行胚性愈傷組織的誘導(dǎo)，并將誘導(dǎo)出的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)接到含有不同激素的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖培養(yǎng)。試驗(yàn)結(jié)果顯示，在MS＋5.0 mg/L BA＋3.0 mg/L 2,4-D＋0.5 mg/L NAA＋60 g/L蔗糖培養(yǎng)基上可直接誘導(dǎo)出胚性愈傷組織；在MS＋2.0 mg/L BA＋0.5 mg/L 2,4-D＋30 g/L蔗糖的培養(yǎng)基上愈傷組織胚性化保持效果最好，生長(zhǎng)速度最快。本試驗(yàn)研究結(jié)果對(duì)番茄人工種子的研制具有一定的參考價(jià)值。

番茄；胚性愈傷組織；合子胚；人工種子

番茄（）別名西紅柿、洋柿子等，果實(shí)風(fēng)味獨(dú)特，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，是世界栽培最為普遍的果菜之一。番茄在我國(guó)各地普遍種植，近年來我國(guó)番茄栽培面積和產(chǎn)量連年遞 增[1]。目前，我國(guó)番茄育種基本采用自然突變選育、人工雜交等常規(guī)方法，育種周期長(zhǎng)、難度大、效率低。由于番茄是一種嚴(yán)格的自花授粉植物，接受長(zhǎng)期的人工培育定向選擇，番茄的遺傳背景日益狹窄。雖然番茄育種工作已在分子水平上展開，利用分子標(biāo)記技術(shù)及轉(zhuǎn)基因工程技術(shù)等尋找阻止基因沉默的有效途徑和發(fā)展可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，開發(fā)更多有重要應(yīng)用價(jià)值的目的基因[2-5]，但轉(zhuǎn)基因番茄的安全問題深受人們質(zhì)疑。

伴隨生物技術(shù)的發(fā)展，人工種子技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。植物的人工種子與天然種子類似，是通過組織培養(yǎng)技術(shù)，誘導(dǎo)植物體細(xì)胞形成在形態(tài)上和生理上均與合子胚相似的體細(xì)胞胚，然后將其包埋于有一定養(yǎng)分和激素等營(yíng)養(yǎng)成分和保護(hù)功能的介質(zhì)中，組成便于播種的單位，并可在適宜條件下發(fā)芽[6-8]。人工種子是一種高效快速的繁殖方法，擁有發(fā)育上的全能性和遺傳上的穩(wěn)定性，能夠快速固定雜種優(yōu)勢(shì)，大大縮短育種年限，具有成本低、運(yùn)輸方便、適合機(jī)械化操作等優(yōu)點(diǎn)[9-10]。

為進(jìn)行番茄人工種子胚的研制，本試驗(yàn)采用番茄種子為外植體，誘導(dǎo)番茄胚性愈傷組織，從而建立穩(wěn)定的番茄胚性愈傷組織培養(yǎng)體系，為進(jìn)一步研制番茄人工種子奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)所用番茄種子由天津市耕耘種業(yè)股份有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 番茄外植體處理

選取飽滿的番茄種子，在超凈工作臺(tái)中用75%的乙醇打濕，40%的安替福民表面消毒10 min，用無菌水沖洗3次，每次沖洗10 min，沖洗后用無菌水浸泡種子2 h，備用。

1.2.2 番茄胚性愈傷組織的誘導(dǎo)

在無菌濾紙上用解剖刀剝除種皮，切去子葉邊緣，分別接種到不同胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每個(gè)培養(yǎng)基中接種10粒種子，每個(gè)處理重復(fù)5次。胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基采用MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，通過改變培養(yǎng)基蔗糖添加量調(diào)節(jié)培養(yǎng)基滲透壓，配合不同種類和用量的植物激素，7 g/L的瓊脂粉固化，調(diào)節(jié)pH為5.8。培養(yǎng)條件為：光照24 h，光照強(qiáng)度1 000 lx，培養(yǎng)溫度（24±1）℃。每天觀察記錄番茄種子的愈傷組織誘導(dǎo)情況，30 d后配合顯微鏡觀察，計(jì)算番茄愈傷組織誘導(dǎo)率，記錄胚性化情況。

愈傷組織誘導(dǎo)率/%＝誘導(dǎo)出愈傷組織的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100

1.2.3 番茄胚性愈傷組織增殖培養(yǎng)

將番茄胚性愈傷組織用鑷子分成大小約5 mm×5 mm的小塊，接種在不同的增殖培養(yǎng)基上，從中篩選出既保持胚性，又有良好增殖效果的培養(yǎng)基配方。增殖培養(yǎng)基采用MS為基本培養(yǎng)基，分別附加不同濃度的BA和2,4-D，并添加30 g/L蔗糖、7 g/L瓊脂粉，調(diào)節(jié)pH＝5.8。每個(gè)培養(yǎng)基接種6塊胚性愈傷組織，每個(gè)培養(yǎng)基重復(fù)5次。培養(yǎng)條件：連續(xù)光照，光照強(qiáng)度2 000 lx，培養(yǎng)溫度為（26±1） ℃。每天觀察記錄番茄愈傷組織的生長(zhǎng)變化，30 d后統(tǒng)計(jì)番茄胚性愈傷組織的增殖生長(zhǎng)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對(duì)番茄胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響

外植體在胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)9 d后，在種子的切口處陸續(xù)出現(xiàn)愈傷組織，繼續(xù)培養(yǎng)則愈傷組織數(shù)量增加，其在不同胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上的誘導(dǎo)情況明顯不同。30 d后，將誘導(dǎo)的愈傷組織取出用顯微鏡觀察，確定愈傷組織的胚性，試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 不同培養(yǎng)基對(duì)番茄胚性愈傷組織的誘導(dǎo)結(jié)果

由表1可知，當(dāng)蔗糖濃度為30 g/L時(shí)，采用不同濃度BA與2,4-D組合，均可誘導(dǎo)出愈傷組織，且愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)100%；隨著BA和2,4-D濃度的增加，愈傷組織質(zhì)地變硬，結(jié)構(gòu)也變得緊密，但所有愈傷組織經(jīng)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)均無胚性；BA與2,4-D濃度不變，改變培養(yǎng)基蔗糖添加量為60 g/L，培養(yǎng)基滲透壓增加，愈傷組織誘導(dǎo)率較30 g/L蔗糖時(shí)明顯降低，但隨著激素用量增加，愈傷組織誘導(dǎo)率也增加，經(jīng)顯微鏡觀察，誘導(dǎo)出的愈傷組織細(xì)胞質(zhì)濃度大，液泡小，細(xì)胞核較大，細(xì)胞個(gè)體較小，是典型的胚性愈傷組織類型，但此時(shí)愈傷組織生長(zhǎng)緩慢，而且結(jié)構(gòu)也較緊密；在培養(yǎng)基4、5、6的基礎(chǔ)上添加0.5 mg/L NAA后，愈傷組織誘導(dǎo)率明顯提高，且愈傷組織質(zhì)地變硬、結(jié)構(gòu)變松散，顯微鏡觀察誘導(dǎo)的愈傷組織均具胚性，為理想的愈傷組織類型；在9號(hào)培養(yǎng)基上愈傷組織誘導(dǎo)率最高，達(dá)98%，誘導(dǎo)所得的愈傷組織質(zhì)地硬，結(jié)構(gòu)松散且具有胚性。因此，MS＋5.0 mg/L BA＋3.0 mg/L 2,4-D＋0.5 mg/L NAA＋60 g/L蔗糖為理想的番茄胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

2.2 不同激素組合對(duì)番茄胚性愈傷組織增殖的影響

將獲得的番茄胚性愈傷組織繼續(xù)在MS＋5.0 mg/L BA＋3.0 mg/L 2,4-D＋0.5 mg/L NAA＋60 g/L蔗糖的培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，愈傷組織結(jié)構(gòu)越來越緊密，最后無法分離，并且出現(xiàn)組織化現(xiàn)象。為獲得穩(wěn)定生長(zhǎng)、結(jié)構(gòu)松散的胚性愈傷組織，需改變培養(yǎng)基組成，篩選出愈傷組織增殖效果好的培養(yǎng)基。番茄胚性愈傷組織在不同胚性愈傷組織增殖培養(yǎng)基上生長(zhǎng)情況不同，見表2。

表2 不同激素組合對(duì)番茄胚性愈傷組織增殖培養(yǎng)的結(jié)果

從表2可以看出，只添加BA，愈傷組織生長(zhǎng)速度慢，愈傷組織質(zhì)地硬、結(jié)構(gòu)緊密，培養(yǎng)一段時(shí)間后，愈傷組織變綠，出現(xiàn)分化現(xiàn)象和組織化現(xiàn)象，愈傷組織向著組織分化方向發(fā)展，同時(shí)愈傷組織胚性消失；當(dāng)只添加2,4-D時(shí)，愈傷組織生長(zhǎng)迅速，但愈傷組織質(zhì)地較軟且不具有胚性，說明2,4-D不利于愈傷組織胚性的保持，會(huì)使胚性化的愈傷組織再次進(jìn)入脫分化狀態(tài)；當(dāng)培養(yǎng)基BA濃度保持不變，2,4-D濃度逐漸增大時(shí)，愈傷組織生長(zhǎng)速度加快，愈傷組織質(zhì)地變軟，胚性化逐漸消失；當(dāng)培養(yǎng)基中2,4-D濃度不變，BA濃度逐漸增加，愈傷組織生長(zhǎng)速度未見明顯變化，但愈傷組織胚性化數(shù)量逐漸增多，說明BA是愈傷組織保持胚性化的關(guān)鍵。在培養(yǎng)基5中，愈傷組織生長(zhǎng)速度快且保持胚性，愈傷組織質(zhì)地與結(jié)構(gòu)為理想的松散型硬胚性愈傷組織。因此，選擇MS＋2.0 mg/L BA＋0.5 mg/L 2,4-D＋30 g/L蔗糖作為番茄胚性愈傷組織增殖培養(yǎng)基效果最好。

3 討論

3.1 外植體對(duì)胚性愈傷組織遺傳穩(wěn)定性的影響

有研究認(rèn)為，含有胚性細(xì)胞的組織容易獲得胚性愈傷組織，合子胚是誘導(dǎo)植物體胚發(fā)生最理想的材料[11-12]。其容易獲得胚性愈傷組織的原因，可能是利用胚性外植體誘導(dǎo)胚性愈傷組織的過程實(shí)質(zhì)上是胚性細(xì)胞的增殖過程。體胚再生系統(tǒng)由于胚性愈傷組織周圍的細(xì)胞分裂快，使細(xì)胞分化和成熟，而中央細(xì)胞有絲分裂活性低，有利于保持遺傳穩(wěn)定性，從而使體胚再生系統(tǒng)的無性系變異小[13]。而王錦楠等[14]認(rèn)為，外植體與胚性愈傷組織之間遺傳穩(wěn)定性相對(duì)較低。因此，如何保證番茄在誘導(dǎo)胚性愈傷組織過程中的遺傳穩(wěn)定性，是利用番茄胚性愈傷組織進(jìn)行人工種子胚研制的關(guān)鍵。本試驗(yàn)采用番茄成熟合子胚為外植體，直接誘導(dǎo)產(chǎn)生番茄胚性愈傷組織，在一定程度上保證了體胚再生的遺傳穩(wěn)定性。

3.2 BA與2,4-D對(duì)胚性愈傷組織胚性化保存的影響

建立穩(wěn)定的胚性愈傷組織增殖體系是獲得大量人工種子胚材料的基礎(chǔ)。胚性愈傷組織的快速增殖與胚性保持需要適宜的激素條件和充分的養(yǎng)分供給。而使用高濃度的植物激素會(huì)使胚性愈傷組織增殖速度降低，甚至導(dǎo)致體細(xì)胞胚成熟能力喪失等[15]。本試驗(yàn)在胚性愈傷組織增殖培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，2,4-D對(duì)愈傷組織胚性化具有雙重效應(yīng)，較低濃度的2,4-D有利于胚性愈傷組織保持胚性狀態(tài)，而高濃度抑制愈傷組織胚性化，這與高潔等[16]誘導(dǎo)綠花百合胚性愈傷組織研究結(jié)果一致。試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，BA與2,4-D的比例對(duì)于愈傷組織的發(fā)育方向有較大的影響。當(dāng)BA與2,4-D比值較高時(shí)，愈傷組織向著胚性化發(fā)展；當(dāng)其比值較低時(shí)，愈傷組織向著薄壁細(xì)胞發(fā)展。

3.3 滲透壓對(duì)胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響

培養(yǎng)基中常用的滲透壓調(diào)節(jié)劑有蔗糖、聚乙二醇及山梨醇等。滲透壓調(diào)節(jié)劑在植物離體培養(yǎng)中的作用主要是引起細(xì)胞失水，使細(xì)胞內(nèi)含物升高，從而達(dá)到調(diào)整細(xì)胞狀態(tài)的作用[17]。本試驗(yàn)采用蔗糖調(diào)節(jié)培養(yǎng)基滲透壓，試驗(yàn)結(jié)果顯示，較高的滲透壓能夠促進(jìn)番茄愈傷組織胚性化，有利于胚性愈傷組織的產(chǎn)生。與鄺哲師等[18]誘導(dǎo)荔枝愈傷組織的結(jié)果一致，發(fā)現(xiàn)蔗糖濃度過低（＜3%）或過高（＞7%），對(duì)胚性愈傷組織的誘導(dǎo)和生長(zhǎng)有阻礙作用。有研究認(rèn)為，植物體細(xì)胞胚性化誘導(dǎo)中，適度的逆境脅迫有利于細(xì)胞的胚性化[19-20]，其原因可能是逆境脅迫時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)速度減慢，分裂速度減緩，為細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)積累和遺傳物質(zhì)的合成提供了時(shí)間保證，對(duì)誘導(dǎo)胚性發(fā)生有利。本試驗(yàn)在誘導(dǎo)胚性愈傷組織時(shí)，采用的高滲透壓對(duì)番茄種子造成一定的逆境脅迫，從而愈傷組織胚性化程度高。

4 結(jié)論

本研究以番茄成熟種子為外植體，建立穩(wěn)定的番茄胚性愈傷組織增殖體系，具體試驗(yàn)方法總結(jié)如下：選取飽滿的番茄種子，經(jīng)過表面消毒，剝?nèi)シN皮并造成傷口，接種到MS＋5.0 mg/L BA＋3.0 mg/L 2,4-D＋0.5 mg/L NAA＋60 g/L蔗糖的胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，可以獲得結(jié)構(gòu)松散、質(zhì)地較硬的胚性愈傷組織；胚性愈傷組織在MS＋2.0 mg/L BA＋0.5 mg/L 2,4-D＋30 g/L蔗糖的培養(yǎng)基上可穩(wěn)定增殖，并保持胚性化。這些胚性愈傷組織可為番茄胚狀體發(fā)生及人工種子的制作研究奠定基礎(chǔ)。

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Study on embryogenic callus induction and proliferation of tomato

XU Ding-fan, LIU Yan-junCorresponding Author, TAO Ze-man, XIAN Rui, FAN Li-na, YU Yi-han, XU Jiu, YANG Jing-hui

（College of Horticulture and Landscape,Tianjin Agricultural University,Tianjin 300384,China）

In order to establish the propagation system of tomato embryogenic callus, the embryogenic callus was induced by inoculating tomato seed embryo on different media, and the induced embryogenic callus was transferred to MS media containing different hormones for propagation culture. The results showed that embryogenic callus could be induced directly on MS＋ 5.0 mg/L BA＋ 3.0 mg/L 2,4-D＋ 0.5 mg/L NAA medium containing 6% sucrose, and embryogenic callus could be maintained best and grew fastest on MS＋2.0 mg/L BA＋ 0.5 mg/L 2,4-D＋30 g/L sucrose medium. The results of this experiment have certain reference value for the development of tomato artificial seeds.

tomato; embryogenic callus; zygotid embryo; artificial seed

1008-5394（2020）03-0022-04

10.19640/j.cnki.jtau.2020.03.005

S641.2

A

2020-03-22

天津市科技計(jì)劃項(xiàng)目（18ZXBFNC00370）；邯鄲市科學(xué)研究與發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（1812106033）

許丁帆（1997-），男，碩士在讀，主要從事園藝植物育種研究。E-mail：1424039435@qq.com。

劉艷軍（1970-），男，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，碩士，主要從事園藝植物組織培養(yǎng)和分子育種研究。E-mail：liuyanjun00a@126.com。

責(zé)任編輯：楊霞