橡膠樹熱墾525胚性懸浮細胞系的建立及其胚性能力的維持

摘""要：易碎胚性愈傷組織和胚性懸浮細胞系都是基因工程和細胞工程的理想受體材料。然而橡膠樹（Hevea"brasiliensis）易碎胚性愈傷組織誘導(dǎo)頻率低、耗時長，且其胚性能力通常隨繼代次數(shù)的增加而下降甚至完全喪失，限制了相關(guān)研究的持續(xù)開展。因此，快速獲得易碎胚性愈傷組織，建立具有高效體胚發(fā)生能力的胚性懸浮細胞系，并盡可能較長時間維持其胚性能力是當前橡膠樹基因工程和細胞工程研究的重要內(nèi)容。本研究以橡膠樹熱墾525未成熟花藥為外植體進行愈傷組織的誘導(dǎo)和胚性懸浮細胞系的建立，分析比較固液2種長期繼代方式對維持其胚性能力的影響。結(jié)果表明：花藥外植體在愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中獲得的黃色致密初代愈傷組織體胚發(fā)生能力低，分散性差，不適合進行懸浮培養(yǎng)。將初代愈傷組織轉(zhuǎn)移至胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)70～80"d后，可觀察到有胚性結(jié)構(gòu)的形成和早期體細胞胚發(fā)生，同時周圍長出鮮黃色小顆粒狀易碎胚性愈傷組織。通過常規(guī)方法建立的Ⅰ型胚性懸浮細胞系具備胚性細胞的典型特征，體胚發(fā)生能力顯著高于胚性愈傷組織，但在體胚發(fā)生過程中容易重新愈傷化；而通過篩選特定形態(tài)的胚性愈傷組織低密度啟動懸浮培養(yǎng)建立的Ⅱ型胚性懸浮細胞系，在顯微鏡下可觀察到細胞處在有序的胚性結(jié)構(gòu)中，其體胚發(fā)生頻率可達100%。在含2"mg/L"2，4-D的液體培養(yǎng)中持續(xù)繼代2"a后細胞明顯老化且增殖緩慢，體胚發(fā)生能力幾近喪失；而在去除2，4-D并添加低濃度脫落酸（0.1"mg/L）和水解酪蛋白（0.5"g/L）的固體培養(yǎng)基上持續(xù)繼代2"a后，體胚發(fā)生能力仍能維持在較高水平。所建立的Ⅱ型胚性懸浮細胞系可為橡膠樹遺傳轉(zhuǎn)化及原生質(zhì)體培養(yǎng)等相關(guān)研究長期提供優(yōu)質(zhì)充足且狀態(tài)相對穩(wěn)定的材料來源。

關(guān)鍵詞：橡膠樹；易碎胚性愈傷組織；胚性懸浮細胞系；體胚發(fā)生；胚性維持中圖分類號：S794.1""""""文獻標志碼：A

Establishment"of"Embryogenic"Cell"Suspensions"of"Hevea"brasiliensis"Clone"Reken"525"and"Maintenance"of"Its"Embryogenic"Competence

DAI"Xuemei，"PENG"Suna，"CHENG"Jing，"GU"Xiaochuan，"HUANG"Tiandai*

Rubber"Research"Institute，"Chinese"Academy"of"Tropical"Agricultural"Sciences"/"Key"Laboratory"of"Biology"and"Genetic"Resources"of"Rubber"Tree，nbsp;Ministry"of"Agriculture"and"Rural"Affairs"/"State"Key"Laboratory"Incubation"Base"for"Cultivation"amp;"Physiology"of"Tropical"Crops"/"Engineering"Center"for"Rapid"Propagation"of"Tropical"Woody"Plants"/"Haikou"Key"Laboratory"of"Tropical"Plant"Seedling"Innovation，"Haikou，"Hainan"571101，"China

Abstract："Both"friable"embryogenic"callus"and"suspension"cells"are"ideal"materials"for"genetic"and"cell"engineering."However，"the"induction"of"friable"embryogenic"callus"of"Hevea"brasiliensis"is"low"frequency"and"time-consuming，"and"its"embryogenic"competence"usually"decreases"gradually"or"even"completely"loses"with"the"increase"of"subculture"times."Therefore，"to"quickly"obtain"friable"embryogenic"callus，"establish"embryogenic"cell"suspensions"with"high"efficiency"of"somatic"embryogenesis，"and"maintain"the"embryogenic"competence"as"long"as"possible，"are"important"research"contents"for"genetic"and"cell"engineering"of"H."brasiliensis."In"this"study，"the"immature"anthers"of"H."brasiliensis"clone"Reken"525"was"used"as"the"explants"to"induce"callus"and"establish"embryogenic"cell"suspensions，"and"the"effects"of"two"long-term"subculture"methods-solid"and"liquid"on"the"maintenance"of"embryogenic"competence"were"compared"and"analyzed."The"results"showed"that"the"yellow"and"compact"primary"callus"tissue"induced"from"anther"explants"on"callus"induction"medium"had"a"low"ability"for"somatic"embryogenesis，"and"was"not"suitable"for"suspension"culture"due"to"poor"dispersion."After"70-80"d"of"culture"on"the"medium"for"embryogenic"callus"induction，"the"formation"of"embryogenic"structures"and"early"somatic"embryogenesis"were"observed，"and"bright"yellow"small"granular"friable"embryogenic"calli"grew"around"them."The"type"Ⅰ"embryogenic"suspension"cell"line"established"through"routine"methods"possessed"typical"characteristics"of"embryogenic"cells，"and"the"frequency"of"somatic"embryogenesis"was"significantly"higher"than"that"of"embryogenic"callus"tissue，"but"proned"to"callus"formation"during"somatic"embryogenesis;"the"type"Ⅱ"embryogenic"suspension"cell"line"established"by"screening"specific"embryogenic"tissue"and"initiating"with"low"density"suspension"culture"was"in"an"orderly"embryonic"structure"observed"by"microscope，"and"its"frequency"of"somatic"embryogenesis"could"reach"up"to"100%."After"two"years"of"continuous"subculture"in"liquid"culture"medium"containing"2"mg/L"2，4-D，"the"cells"were"obviously"aging"with"lower"proliferation"coefficient，"and"the"ability"for"somatic"embryogenesis"was"almost"lost."However，"the"ability"for"somatic"embryogenesis"still"remained"at"a"high"level"after"two"years"of"continuous"subculture"on"solid"culture"medium"without"2，4-D"but"supplemented"with"abscisic"acid"（0.1"mg/L）"and"hydrolyzed"casein"（0.5"g/L）."The"type"Ⅱ"embryogenic"suspension"cell"line"could"provide"high-quality，"sufficient"and"relatively"stable"material"sources"for"genetic"transformation"and"protoplast"culture"of"Hevea"brasiliensis"in"the"long"term.

Keywords："Hevea"brasiliensis;"friable"embryogenic"callus;"embryogenic"cell"suspensions;"somatic"embryogenesis;"maintenance"of"embryogenic"competence

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2024.07.011

橡膠樹（Hevea"brasiliensis）花藥、內(nèi)珠被等外植體通過離體誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得的初代愈傷組織的體胚發(fā)生頻率和植株再生能力通常均不高，必須通過進一步合適的培養(yǎng)或采取特定的方法才能誘導(dǎo)出松散型的易碎胚性愈傷組織。這種類型的愈傷組織不僅體胚發(fā)生能力得到大幅度的提高，而且能通過繼代培養(yǎng)進行穩(wěn)定快速增殖，是進行橡膠樹轉(zhuǎn)基因和基因編輯的良好受體材料[1-5]。橡膠樹高質(zhì)量易碎胚性愈傷組織的誘導(dǎo)頻率低，耗時長，從起始外植體的誘導(dǎo)到獲得能穩(wěn)定快速增殖的易碎胚性愈傷組織系至少需要半年，且獲得的難易程度具有品種依賴性。目前橡膠樹易碎胚性愈傷組織的誘導(dǎo)主要通過以下2種途徑：（1）以花藥或內(nèi)珠被等為外植體，在誘導(dǎo)出初代愈傷組織后，調(diào)整繼代培養(yǎng)基中的激素配比和氯化鈣濃度，或直接在相同成分的培養(yǎng)基中通過長期的繼代培養(yǎng)篩選得到易碎胚性愈傷組織，此方法建立胚性愈傷組織系需耗時10～18個月，且誘導(dǎo)頻率通常低于1%[6-9]。（2）經(jīng)花藥或內(nèi)珠被培養(yǎng)得到的愈傷組織，先誘導(dǎo)出體細胞胚，再以幼嫩的初生或次生胚為材料，將其對半縱切或用接種針刺劃后，轉(zhuǎn)至合適的培養(yǎng)基中進行胚性愈傷組織的誘導(dǎo)和繼代篩選[10-11]，經(jīng)該方法得到易碎胚性愈傷組織的時間可縮短至7～10個月，誘導(dǎo)頻率也有所提高，但受品種胚性能力的限制，不能誘導(dǎo)出初生胚的品種無法通過此途徑獲得易碎胚性愈傷組織。易碎胚性愈傷組織通過懸浮培養(yǎng)建立的胚性懸浮細胞系，由于細胞團大小和生理狀態(tài)較一致，在合適的液體培養(yǎng)條件下增殖速度往往快于固體培養(yǎng)的胚性愈傷組織，體胚發(fā)生頻率也得到一定程度的提高，可為規(guī)?；w胚誘導(dǎo)和體胚苗繁育提供大量生理狀態(tài)一致、發(fā)育同步性較好的材料來源[12]，同時也可為橡膠樹原生質(zhì)體培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化等提供細胞水平上的理想研究對象[13-16]。然而胚性懸浮細胞系的體胚發(fā)生能力隨著繼代培養(yǎng)次數(shù)的增加而呈下降趨勢，通常在繼代培養(yǎng)2～3"a后胚性便嚴重下降甚至完全丟失，這在很大程度上限制了橡膠樹遺傳轉(zhuǎn)化和原生質(zhì)體培養(yǎng)等研究的持續(xù)開展。因此，如何快速獲得橡膠樹易碎胚性愈傷組織，建立具有高效體胚發(fā)生能力的胚性懸浮細胞系，并在繼代過程中盡可能較長時間維持其胚性能力，是當前橡膠樹基因工程和細胞工程研究的重要內(nèi)容。

橡膠樹熱墾525是由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所牽頭，聯(lián)合多家科研生產(chǎn)單位，經(jīng)系統(tǒng)鑒定選育出的我國首個速生、高產(chǎn)且具有廣適性的膠木兼優(yōu)品種[17]，目前尚無關(guān)于熱墾525胚性懸浮細胞系建立的報道。本研究以膠木兼優(yōu)的橡膠樹品種熱墾525為研究對象，通過花藥培養(yǎng)途徑在獲得易碎胚性愈傷組織后，選取特定形態(tài)的胚性愈傷組織為材料，采用低密度啟動懸浮培養(yǎng)的方式，建立具有高效體胚發(fā)生能力的胚性懸浮細胞系，并在繼代培養(yǎng)過程中探索長時間維持其胚性能力的培養(yǎng)條件和方式，旨在為橡膠樹規(guī)?；w胚苗繁育及遺傳轉(zhuǎn)化、原生質(zhì)體培養(yǎng)等相關(guān)研究長期提供相對穩(wěn)定且優(yōu)質(zhì)充足的材料來源。

1""材料與方法

1.1""材料

1.1.1""外植體材料""熱墾525花序采自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院儋州試驗場基地。選取黃綠色未開放的雄花蕾，經(jīng)常規(guī)消毒后，剝離完整的花藥粒作為起始外植體。

1.1.2""試劑及培養(yǎng)基""配制培養(yǎng)基所使用的無機鹽（包括大量元素、微量元素和鐵鹽）、蔗糖等購自廣州化學(xué)試劑廠；各種植物生長調(diào)節(jié)劑及有機成分如維生素、氨基酸等均購自上海生物工程技術(shù)有限公司；植物凝膠購自Sigma公司。在培養(yǎng)的各個階段采用的培養(yǎng)基編號及其組成成分見表1。

1.2""方法

1.2.1""初代愈傷組織和易碎胚性愈傷組織的誘導(dǎo)""從消毒雄花剝離出完整花藥粒接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基M1中，置于27"℃暗室中培養(yǎng)30～35"d后，將得到的初代愈傷組織轉(zhuǎn)入胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基M2中，每30"d繼代1次，直至長出鮮黃色小顆粒狀易碎胚性愈傷組織。

1.2.2""胚性懸浮細胞系的建立""常規(guī)方法啟動懸浮培養(yǎng)：直接用鑷子挑取1.2.1中獲得的易碎胚性愈傷組織2"g左右，轉(zhuǎn)至150"mL三角瓶中，加入30"mL液體培養(yǎng)基M3，置于27"℃暗培養(yǎng)室150"r/min搖床上啟動懸浮培養(yǎng)。在培養(yǎng)初期，每3～5"d更換1次液體培養(yǎng)基，同時用60目金屬濾網(wǎng)過濾除去不能分散的大細胞團和褐化的組織，直至細胞團完全均質(zhì)分散后改為每2周繼代一次，每次繼代時保留約1/5舊液體培養(yǎng)基，同時調(diào)整細胞團和液體培養(yǎng)基的質(zhì)量體積分數(shù)為2%～3%。經(jīng)此種方式建立的分散胚性懸浮細胞系命名為Ⅰ型胚性懸浮細胞系。

低密度啟動懸浮培養(yǎng)：在體視顯微鏡下挑取5～10粒顏色鮮黃、表面光滑、結(jié)構(gòu)緊密且含多個球形凸起的胚性組織（直徑為0.2～0.5"mm），轉(zhuǎn)至含30"mL液體培養(yǎng)基M4的三角瓶中，置于27"℃暗培養(yǎng)室150"r/min搖床上啟動懸浮培養(yǎng)。每2周繼代培養(yǎng)1次，直至得到分散均勻且能穩(wěn)定增殖的胚性細胞系。每次繼代時保留約1/5舊液體培養(yǎng)基，同時調(diào)整細胞團和液體培養(yǎng)基的質(zhì)量體積分數(shù)為1%～2%。經(jīng)此種方式建立的均質(zhì)胚性懸浮細胞系命名為Ⅱ型胚性懸浮細胞系。

1.2.3""體細胞胚誘導(dǎo)""將1.2.1中花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)的初代愈傷組織、易碎胚性愈傷組織以及1.2.2中經(jīng)2種不同方式啟動懸浮培養(yǎng)建立的胚性細胞懸浮系分別接種至固體體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基M5上，胚性懸浮細胞團在接入固體培養(yǎng)基前先用不含激素的液體MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基漂洗2遍，以去除細胞的激素殘留，之后用滅菌濾紙吸干多余水分，每皿接種8塊愈傷組織或細胞團（直徑為3～5"mm），不同材料各接種40塊，試驗重復(fù)3次，置于27"℃暗培養(yǎng)室中培養(yǎng)，每30"d繼代培養(yǎng)1次，60"d后分別計算體胚誘導(dǎo)率和體胚誘導(dǎo)系數(shù)。

1.2.4""胚性細胞系的繼代保存""將低密度啟動懸浮培養(yǎng)建立的胚性懸浮細胞系按以下2種方式進行繼代保存：（1）繼續(xù)在相同成分的M4液體培養(yǎng)基中按每14"d一次的頻率進行繼代保存；（2）將其轉(zhuǎn)至固體繼代培養(yǎng)基M6上，每20"d挑取新生長的胚性愈傷組織（直徑為3～5"mm）進行繼代保存。繼代培養(yǎng)2"a后分別取固體和液體繼代保存的材料接種至M5培養(yǎng)基上進行體胚誘導(dǎo)，60"d后分別計算體胚誘導(dǎo)率和體胚誘導(dǎo)系數(shù)。

1.3""數(shù)據(jù)處理

體胚誘導(dǎo)率計算公式：體胚誘導(dǎo)率=誘導(dǎo)獲得體胚的外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)′100%；

體胚誘導(dǎo)系數(shù)計算公式：體胚誘導(dǎo)系數(shù)=誘導(dǎo)獲得的體胚總數(shù)/接種外植體總數(shù)。

采用Excel"2007軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和處理，用Duncan法進行差異顯著性分析。

2""結(jié)果與分析

2.1""熱墾525初代愈傷組織和胚性愈傷組織的誘導(dǎo)

未成熟花藥外植體在接入愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基7"d后外植體開始膨大，14"d后開始有少量愈傷組織的生長，繼續(xù)培養(yǎng)至30"d后即可誘導(dǎo)出黃色大顆粒、質(zhì)地較致密的初代愈傷組織（圖1A）。初代愈傷組織分散性差，不適宜進行懸浮培養(yǎng)，在將其轉(zhuǎn)入胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基M2培養(yǎng)

70～80"d后，可觀察到有胚性結(jié)構(gòu)及早期的體細胞胚發(fā)生，同時在部分體細胞胚基部或周圍生長出鮮黃色、小顆粒狀易碎胚性愈傷組織（圖1B）。

2.2""不同方式建立胚性細胞懸浮系

以易碎胚性愈傷組織為材料，采用常規(guī)方法啟動懸浮培養(yǎng)，經(jīng)過60目金屬濾網(wǎng)的過濾篩選和6～8次的繼代培養(yǎng)后，獲得均質(zhì)分散且快速增殖的Ⅰ型胚性懸浮細胞系（圖2A），大多數(shù)細胞團直徑大小集中在0.1～0.2"mm之間。在顯微鏡下可觀察到細胞團由多個等徑球形細胞緊密結(jié)合而成，細胞質(zhì)濃厚，內(nèi)含物豐富（圖2B），具備胚性細胞的典型特征。而通過體視顯微鏡挑選出特定形態(tài)的胚性愈傷組織采用低密度方式啟動的懸浮培養(yǎng)，平均每4"d細胞生長量可增加1～2倍。經(jīng)過4～6次的繼代培養(yǎng)，得到穩(wěn)定增殖的Ⅱ型胚性懸浮細胞系（圖2C）。在顯微鏡下觀察，Ⅱ型胚性懸浮細胞直徑介于1～2"mm之間，具有多個致密的球形凸起結(jié)構(gòu)（圖2D），細胞處在有序快速分裂的原球胚階段。

2.3""不同培養(yǎng)物的體細胞胚誘導(dǎo)

如表2所示，分別將初代愈傷組織、易碎胚性愈傷組織和2種類型的胚性懸浮細胞在固體體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基M5上培養(yǎng)60"d后，體胚誘導(dǎo)率和體胚誘導(dǎo)系數(shù)均呈現(xiàn)顯著差異。初代愈傷組織的體胚誘導(dǎo)效果最差（圖3A），體胚誘導(dǎo)率僅有37.5%左右，平均每塊愈傷組織僅誘導(dǎo)出1.2個體細胞胚；易碎胚性愈傷組織的體胚誘導(dǎo)率和體胚誘導(dǎo)系數(shù)均有顯著升高（圖3B），分別是初代愈傷組織的1.7倍和4.3倍；Ⅰ型胚性懸浮細胞的體胚誘導(dǎo)率雖然比易碎胚性愈傷組織有較明顯的提高，但體胚誘導(dǎo)系數(shù)卻低于后者，原因在于Ⅰ型胚性懸浮細胞在體胚誘導(dǎo)過程中存在嚴重的愈傷化現(xiàn)象（圖3C）；特定形態(tài)的胚性組織通過低密度懸浮培養(yǎng)得到的Ⅱ型胚性細胞系體胚誘導(dǎo)率最高（圖3D），達到100%，且平均每團胚性細胞可誘導(dǎo)出10個以上的體細胞胚，體胚誘導(dǎo)率和誘導(dǎo)系數(shù)分別比Ⅰ型胚性懸浮細胞提高了1.3倍和2.8倍。

2.4""不同繼代方式對胚性細胞增殖和胚性能力維持的影響

Ⅱ型胚性懸浮細胞系在相同成分的液體培養(yǎng)基中持續(xù)繼代培養(yǎng)2"a后，細胞團增殖效率嚴重下降，與建立初期細胞團相比有明顯增大趨勢（圖4A），將其轉(zhuǎn)至體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，僅觀察到類似球形胚結(jié)構(gòu)的組織產(chǎn)生，在隨后的發(fā)育過程中進一步膨大褐化（圖4B），最終未能得到正常的體細胞胚；將Ⅱ型胚性細胞轉(zhuǎn)移至去除植物生長調(diào)節(jié)劑并添加少量脫落酸（0.1"mg/L）和水解酪蛋白（0.5"g/L）的固體培養(yǎng)基M6中持續(xù)繼代培養(yǎng)2"a后，仍能均質(zhì)快速增殖（圖4C），并且能保持較高的體胚發(fā)生能力（圖4D），此時的體胚誘導(dǎo)率和體胚誘導(dǎo)系數(shù)分別為60%和3.80（表3），與最初獲得的易碎胚性愈傷組織胚性潛力相當，且體胚發(fā)育的同步性明顯有所提升。

3""討論

本研究通過將熱墾525未成熟花藥外植體接入較高激素含量的培養(yǎng)基中獲得初代愈傷組織，隨即將其轉(zhuǎn)入低激素含量且添加了適量ABA和AgNO3的胚性誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)70～80"d后便可誘導(dǎo)出具有較高體胚發(fā)生能力的易碎胚性愈傷組織。這與LARDER等[10]報道的獲得易碎胚性愈傷組織的時間相比有較明顯的縮短，可在一定程度上降低長期繼代篩選帶來的細胞變異風(fēng)險。通過這種方式得到易碎胚性愈傷組織可在固體培養(yǎng)基上穩(wěn)定增殖，體胚發(fā)生能力也比初代愈傷組織有大幅度的提高，但其在體胚誘導(dǎo)和發(fā)育過程中同時存在胚性愈傷、球形胚、心形胚、魚雷形胚和子葉胚等不同發(fā)育階段的培養(yǎng)物，不利于后續(xù)體胚苗的同步批量生產(chǎn)。

建立懸浮細胞系是胚性組織快速增殖且同步化培養(yǎng)的一種重要手段。在橡膠樹中，目前只有少數(shù)品種有成功建立胚性懸浮細胞系的報道，均是采用常規(guī)高密度啟動懸浮培養(yǎng)的方式，即不經(jīng)特別篩選直接挑取1～3"g愈傷組織轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)基中進行懸浮培養(yǎng)，并在繼代過程中使用一定孔徑的濾網(wǎng)進行過濾篩選得到均質(zhì)懸浮細胞系[11，"18-19]。本研究通過常規(guī)和低密度2種懸浮培養(yǎng)方式均建立了均質(zhì)分散的胚性懸浮細胞系，但二者在大小形態(tài)及體胚發(fā)生能力上存在較大差別。采用常規(guī)方式建立的Ⅰ型胚性細胞系在顯微鏡下由幾個到幾十個大小較一致且內(nèi)含物豐富的細胞組成，體胚發(fā)生能力明顯高于易碎胚性愈傷組織，但在體胚發(fā)育過程中存在較嚴重的愈傷化現(xiàn)象；而通過在體視顯微鏡下挑選特定形態(tài)的胚性愈傷組織進行低密度懸浮培養(yǎng)建立的Ⅱ型胚性懸浮細胞系，在顯微鏡下觀察具有多個球形凸起，細胞處在有序的胚性結(jié)構(gòu)中，可快速誘導(dǎo)出大量發(fā)育較同步的魚雷形胚和子葉型胚，這將是利用間歇浸沒式生物反應(yīng)器（RITA）進行橡膠樹體胚苗規(guī)模化繁殖的理想材料。

胚性懸浮細胞系在建立后隨著繼代次數(shù)的增加胚性逐年下降甚至完全喪失是多數(shù)植物在離體培養(yǎng)過程中存在的共同問題。HERINGER等[20]在通過間歇浸沒培養(yǎng)系統(tǒng)提高桃棕（Bactris"gasipaes"Kunth）的體胚發(fā)生效率研究中指出，細胞總DNA甲基化水平與其體胚發(fā)生能力呈現(xiàn)負相關(guān)，細胞長期暴露在外源激素和液體等滲透和氧化脅迫環(huán)境下會通過提高自身甲基化水平來增加抗脅迫耐受性，從而導(dǎo)致胚性的下降或喪失。在萱草（Hemerocallis）胚性愈傷組織的繼代培養(yǎng)過程中，通過去除培養(yǎng)基中的激素成分，使胚性組織維持在原球胚階段增殖而未進一步發(fā)育，再通過改變pH緩沖培養(yǎng)后在分化培養(yǎng)基上可繼續(xù)體胚發(fā)育[21]；在狼尾草（Pennisetum"purpureum"Schum.）胚性愈傷組織長期繼代過程中通過在培養(yǎng)基中添加低濃度的ABA，可使愈傷組織的胚性得到一定程度的恢復(fù)[22]。本研究通過分析比較固體和液體2種長期繼代培養(yǎng)方式對細胞胚性能力維持的影響，進一步證實長時間的激素處理和液體環(huán)境是細胞老化和胚性下降的主要原因，而在繼代培養(yǎng)基中去除激素，適當添加有利于胚性恢復(fù)的物質(zhì)，并采用固體培養(yǎng)方式降低繼代頻次可較長時間維持細胞的胚性潛力。通過這種方法保存的胚性組織可長期為橡膠樹遺傳轉(zhuǎn)化、原生質(zhì)體培養(yǎng)等研究提供相對穩(wěn)定且不受季節(jié)限制的優(yōu)質(zhì)材料。

參考文獻

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