貴州百香果主要種植區(qū)病毒種類的檢測

摘""要：百香果（Passiflora"edulis）作為貴州特色優(yōu)勢水果，在鞏固脫貧攻堅(jiān)成果和深入實(shí)施鄉(xiāng)村振興戰(zhàn)略中具有重要意義。但近年來百香果病毒病危害日趨嚴(yán)重，造成產(chǎn)量和品質(zhì)急劇下降，嚴(yán)重影響產(chǎn)業(yè)發(fā)展。為確定貴州百香果主要種植區(qū)病毒種類、分布及復(fù)合侵染情況，本研究從貴州省羅甸縣、從江縣、榕江縣、鎮(zhèn)寧縣和貞豐縣5個(gè)百香果主要種植區(qū)采集疑似感病葉片153份，采用RT-PCR技術(shù)對其進(jìn)行檢測。結(jié)果表明：樣本共檢測到7種病毒，分別是東亞西番蓮病毒（East"Asian"Passiflora"virus，"EAPV）、夜來香花葉病毒（Telosma"mosaic"virus，"TeMV）、黃瓜花葉病毒（Cucumber"mosaic"virus，"CMV）、蕪菁花葉病毒（Turnip"mosaic"virus，"TuMV）、西番蓮斑駁病毒（Passiflora"mottle"virus，"PaMV）、西番蓮潛隱病毒（Passiflora"latene"carlavirus，"PLV）和馬鈴薯Y病毒（Potato"virus"Y，"PVY）。EAPV檢出率最高，達(dá)96.08%，以下依次為TeMV（81.70%）、CMV（78.43%）、TuMV（44.44%）、PaMV（26.80%）、PVY（24.84%）和PLV（15.03%）；值得重視的是，PVY主要為害馬鈴薯，而侵染百香果為首次報(bào)道。本次檢測到的7種病毒的測序結(jié)果與相應(yīng)參考序列的核酸一致性均在95%以上，經(jīng)構(gòu)建進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)，EAPV、TeMV、PaMV、PLV、TuMV分別與中國各省份的百香果病毒分離物存在一定的地理聚集性，而CMV和PVY分別與西班牙CMV甜瓜分離物和盧旺達(dá)PVY辣椒分離物親緣關(guān)系最近，這說明這些病毒來源及感染途徑復(fù)雜，未在國內(nèi)大面積傳播。本次共檢測到24種復(fù)合侵染類型，以3～5種復(fù)合侵染類型為主，復(fù)合侵染率達(dá)94.77%，其中EAPV+TeMV+CMV組合是復(fù)合侵染中出現(xiàn)最多的類型；EAPV、TeMV和CMV的檢出率高達(dá)78.43%～96.08%，在5個(gè)百香果主要種植區(qū)均有檢出，且在多種復(fù)合侵染類型中普遍存在，因此這3種病毒為侵染貴州百香果主要種植區(qū)的優(yōu)勢病毒。此外，本研究建立了EAPV、TeMV和CMV的多重PCR檢測體系，為相關(guān)病毒的快速檢測提供技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞：貴州；百香果；病毒檢測；RT-PCR；復(fù)合侵染

中圖分類號：S436.67""""""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Detection"of"Virus"Species"from"Main"Plantation"Areas"of"Passion"Fruit"（Passiflora"edulis）"in"Guizhou

YAN"Yixin，"QIAO"Guang，"ZHOU"Kui，"ZHANG"Manying，"LI"Ruirui，"WEN"Xiaopeng*

College"of"Life"Sciences，"Guizhou"University"/"Institute"of"Agro-bioengineering"/"Key"laboratory"of"Plant"Resource"Conservation"and"Germplasm"Innovation"in"Mountainous"Region"（Ministry"of"Education），"Guiyang，"Guizhou"550025，"China

Abstract："Passion"fruit"（Passiflora"edulis）"is"a"characteristic"and"advantageous"fruit"in"Guizhou，"which"is"of"great"significance"in"poverty"relief"consolidation"and"the"rural"revitalization."However，"in"recent"years，"the"viral"diseases"of"passion"fruit"have"become"increasingly"severe，"leading"to"a"sharp"decline"in"yield"and"quality，"which"thereby"seriously"constrain"industry"development"of"passion"fruit."In"order"to"determine"the"virus"species，"distribution"and"compound"infestation"in"the"main"plantation"areas"of"passion"fruit"in"Guizhou"province，"a"total"of"153"samples"suspectedly"infected"by"virus"were"collected"from"five"main"plantation"orchards"of"passion"fruit"in"five"counties，"i.e."Luodian，"Congjiang，"Rongjiang，"Zhenning"and"Zhenfeng，"and"the"virus"detection"was"carried"out"by"RT-PCR."The"results"showed"that"seven"viruses"were"detected"from"the"tested"samples，"namely"East"Asian"Passiflora"virus"（EAPV），"Telosma"mosaic"virus"（TeMV），"Cucumber"mosaic"virus"（CMV），"Turnip"mosaic"virus"（TuMV），"Passiflora"mottle"virus"（PaMV），"Passiflora"latene"carlavirus"（PLV），"and"Potato"virus"Y"（PVY），"among"which"PVY"infection"was"firstly"reported"from"passion"fruit."EAPV"was"the"most"prevalent"one"with"infection"rate"as"high"as"96.08%，"followed"consecutively"by"TeMV"（81.70%），"CMV"（78.43%），"TuMV"（44.44%），"PaMV"（26.80%），"PVY"（24.84%）"and"PLV"（15.03%）."In"the"present"case，"the"distribution"of"passion"fruit"viruses"in"Guizhou"province"and"the"diversity"of"virus"sequences"were"analyzed."Seven"viruses"were"detected"in"Zhenning，"six"in"Zhenfeng，"five"in"Rongjiang"and"Congjiang，"and"three"in"Luodian."There’snbsp;a"close"identity"between"the"nucleic"acid"of"the"seven"detected"viruses"and"the"corresponding"reference"sequences"（above"95%）."Phylogenetic"analysis"revealed"that"EAPV，"TeMV，"PaMV，"PLV"and"TuMV"somewhat"geographical"clustered"with"passion"fruit"virus"isolated"from"other"provinces"in"China."CMV"and"PVY"were"most"closely"related"to"Cucumis"melo"CMV"isolated"from"Spain"and"Capsicum"annuum"PVY"isolated"from"Rwanda"respectively，"suggesting"that"the"virus"sequences"diversely"varies"among"the"origins"in"China."A"total"of"24"types"of"mixed"infection"were"detected"in"the"main"growing"areas"of"passion"fruit"in"Guizhou，"and"the"complex"infection"rate"was"as"high"as"94.77%."The"complex"infection"with"3-5"types"predominated"in"the"tested"samples，"and"the"combination"of"EAPV+TeMV+CMV"was"most"frequent"among"the"complex"infections"among"which，"EAPV，"TeMV"and"CMV"detected"ranged"from"78.43%"to"96.08%"in"the"five"counties，"somehow"reflecting"that"they"were"the"major"viruses"to"prevent"in"passion"fruit"industry"of"Guizhou"province."In"addition，"a"multiplex"PCR"assay"system"for"EAPV，"TeMV"and"CMV"was"established"in"this"study，"which"provides"technical"support"for"the"rapid"detection"of"related"viruses.

Keywords："Guizhou;"Passiflora"edulis;"virus"detection;"RT-PCR;"complex"infestation

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2024.07.020

百香果又稱西番蓮（Passiflora"edulis），是西番蓮科（Passifloraceae）西番蓮屬（Passiflora"Linn.）多年生常綠藤本熱帶水果，原產(chǎn)于南美洲，我國引種栽培后主要分布在臺灣、廣西、貴州、福建、廣東、海南和云南等亞熱帶及熱帶地區(qū)[1]。百香果作為“第三代新興果樹”[2]，集果用、藥用、油用和庭院觀賞為一體[3]，且當(dāng)年種植當(dāng)年掛果，經(jīng)濟(jì)見效快，我國不少地區(qū)將其列為“短、平、快”的農(nóng)業(yè)項(xiàng)目[4]。

在百香果種植過程中，病毒病是其效益發(fā)揮的重要制約因素[5]。百香果感染病毒后，植株出現(xiàn)葉片黃化、花葉、畸變、卷曲，果實(shí)小且畸形，嚴(yán)重影響經(jīng)濟(jì)效益[1]。由于百香果多采用營養(yǎng)繁殖，且長期連作，使病毒病蔓延迅速[6]。目前，已報(bào)道能侵染百香果的病毒高達(dá)40余種，包括東亞西番蓮病毒（East"Asian"Passiflora"virus，"EAPV）[7]、夜來香花葉病毒（Telosma"mosaic"virus，"TeMV）[8]、黃瓜花葉病毒（Cucumber"mosaic"virus，"CMV）[9]、西番蓮木質(zhì)化病毒（Passion"fruit"woodiness"virus，"PWV）[10]和豇豆蚜傳花葉病毒（Cowpea"aphid-"borne"mosaic"virus，"CABMV）[11]等。在貴州種植的百香果上，嚴(yán)佳文等[12]檢測到CMV和TeMV，任羽羽等[13]檢測到PLV，這些結(jié)果為當(dāng)?shù)匕傧愎a(chǎn)業(yè)發(fā)展及病毒病防控提供了參考，但這些檢測僅涉及個(gè)別種植園，尚缺乏全省主要種植區(qū)病毒病種類和分布的報(bào)道。本研究擬采用RT-PCR法，對貴州百香果的病毒種類及復(fù)合侵染情況進(jìn)行鑒定分析，旨在為全省范圍內(nèi)百香果果園規(guī)劃、種苗繁育和病毒病防控等產(chǎn)業(yè)問題提供參考。

1""材料與方法

1.1""材料

2021—2022年，從貴州省羅甸縣、從江縣、榕江縣、鎮(zhèn)寧縣和貞豐縣百香果種植基地，采集百香果疑似感病葉片153份（表1），樣品癥狀主要包括花葉、黃化、皺縮、卷曲等；另采集健康百香果種子萌發(fā)的實(shí)生苗葉片作為陰性對照。所有樣品經(jīng)液氮速凍后于–80"℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2""方法

1.2.1""總RNA的提取""采用RNA提取試劑盒（Omega"Bio-Tek）提取疑似病毒侵染葉片混合樣品總RNA，具體方法參照試劑說明書。用酶標(biāo)儀測定其濃度和純度，瓊脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量。

1.2.2""引物合成""根據(jù)GenBank上已登錄的序列，利用Oligo"7軟件設(shè)計(jì)EAPV、TeMV、CMV、TuMV、CABMV、PWV的特異性檢測引物，PaMV、PLV、PVY的檢測引物參考相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道（表2），本研究所有引物均委托生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行合成。

1.2.3""cDNA合成及RT-PCR擴(kuò)增""以疑似病毒侵染的百香果葉片RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，具體過程見逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書（TaKaRa寶生物工程有限公司）。以cDNA為模板，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為50"μL：2×"Canace"Gold"PCR"buffer"25"μL，Hieff"Canace"Gold"High-Fidelity"DNA"Polymerase"0.5"μL，10"μmol/L的上下游引物各2.5"μL，cDNA模板5"μL，無菌ddH2O補(bǔ)足后混合均勻。PCR具體反應(yīng)程序?yàn)椋?8"℃預(yù)變性6"min；98"℃變性10"s，60"℃退火20"s，72"℃延伸30"s，循環(huán)35次；72"℃延伸5"min，4"℃保存。取PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，通過凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。PCR陰性對照為百香果無病毒侵染的實(shí)生苗。

1.2.4""PCR產(chǎn)物回收及測序""采用DNA凝膠回收試劑盒（TaKaRa寶生物工程有限公司）將特異性目的片段回收純化，連接PEASY-Blunt載體（全式金生物技術(shù)股份有限公司產(chǎn)），轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)中，將PCR陽性克隆產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫中對應(yīng)序列進(jìn)行Blast比對。采用MEGA-7的鄰接法（Neighbor-Joining，"NJ）進(jìn)行1000次置信度自展分析，并構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.2.5""統(tǒng)計(jì)及分析""采用RT-PCR法，對采集的153份百香果疑似感病葉片進(jìn)行病毒檢測，統(tǒng)計(jì)病毒檢出樣本數(shù)、采集樣本數(shù)、分布情況及貴州百香果病毒的復(fù)合侵染類型。病毒檢出率=病毒檢出樣本數(shù)/采集樣本數(shù)×100%。

1.2.6""多重RT-PCR擴(kuò)增體系的優(yōu)化和建立""以復(fù)合感染EAPV、TeMV和CMV病毒的百香果樣品cDNA為模板，適量稀釋后進(jìn)行多重RT-PCR擴(kuò)增。對多重RT-PCR體系的退火溫度（50、52、54、56、58、60"℃）、引物含量（0.5、1、1.5、2"μL）和循環(huán)次數(shù)（20、25、30、35、40次）進(jìn)行梯度設(shè)置，以優(yōu)化該反應(yīng)體系。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，通過凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。利用優(yōu)化建立后的多重RT-PCR擴(kuò)增體系對采集的部分復(fù)合侵染樣品進(jìn)行檢測，以驗(yàn)證該體系的準(zhǔn)確性。

2""結(jié)果與分析

2.1""感病百香果表現(xiàn)癥狀

田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在貴州省羅甸縣、從江縣、榕江縣、鎮(zhèn)寧縣和貞豐縣5個(gè)百香果主要種植區(qū)，均有病毒病發(fā)生，主要表現(xiàn)為葉片卷曲（圖1A）、皺縮、畸形（圖1B）、花葉、黃化、黃斑（圖1C）、果皮斑駁（圖1D）等癥狀。長期連作地區(qū)如貞豐、鎮(zhèn)寧等，病毒病發(fā)生率明顯高于新種植地區(qū)，新果園也有發(fā)生，說明苗木帶毒。

2.2""樣品病毒的RT-PCR檢測

采用RT-PCR法對采集的153份樣品進(jìn)行9種病毒檢測，結(jié)果顯示，EAPV、TeMV、CMV、TuMV、PaMV、PLV和PVY共7對引物對可分別在286、395、690、306、261、840、447"bp處擴(kuò)增出特異性條帶，條帶位置與預(yù)期大小吻合，清晰明亮（圖2）。CABMV與PWV未擴(kuò)增到預(yù)期大小的目的條帶，表明樣品中未檢測出這2種病毒；百香果實(shí)生苗未擴(kuò)增出條帶，說明百香果實(shí)生苗不帶病毒，可以作為陰性對照。

2.3""病毒序列分析

將上述檢測到的7種病毒隨機(jī)選取部分樣品進(jìn)行克隆測序，將獲得的序列分別命名為EAPV-"GZ、TeMV-GZ、CMV-GZ、TuMV-GZ、PaMV-GZ、PLV-GZ和PVY-GZ，結(jié)果顯示，這些序列與EAPV（KP114136）、TeMV（KJ789129）、CMV（KX 525733）、TuMV（KF246570）、PaMV（MK492286）、PLV（MK340756）和PVY（ON604844）核苷酸序列一致性非常高，分別為97.56%、98.41%、95.67%、98.37%、99.69%、99.23%和97.54%。

采用鄰接法對7種病毒測序結(jié)果構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明，EAPV-GZ、TeMV-GZ、PaMV-GZ、PLV-GZ和TuMV-GZ均與中國不同省份的百香果病毒分離物在同一個(gè)亞組，存在一定的地理聚集性。EAPV-GZ與臺灣百香果EAPV分離物（KP 114136）有較近的親緣關(guān)系（圖3A）；TeMV-"GZ與廣西百香果TeMV分離物（KJ789129）聚為一支（圖3B）；TuMV-GZ除了與福建百香果TuMV分離物（MK340758）親緣關(guān)系較近外，還與福建廈門蝴蝶蘭TuMV分離物（KF246570）、中國TuMV芥菜分離物（LC537522）同處于一個(gè)亞組（圖3D）；PaMV-GZ分離物與海南百香果PaMV分離物（MK492286）以較高的自展值（Bootstrap"value=100）聚為同一分支（圖3E）；PLV-GZ分離物和福建百香果PLV分離物（MK340756）有較近的親緣關(guān)系，而與福建廈門百香果PLV分離物（MK340757）親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（圖3F）。

CMV-GZ和PVY-GZ則與不同物種的病毒分離物親緣關(guān)系較近。CMV-GZ和西班牙甜瓜CMV分離物（KX525733）、西班牙番茄CMV分離物（AM183115）、意大利西葫蘆CMV分離物（OM867855）聚為一支，有較近的親緣關(guān)系，而與浙江半夏CMV分離物（EU723570）、中國山東矮牽牛CMV分離物（EU414799）親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（圖3C）；PVY-GZ和盧旺達(dá)辣椒PVY分離物（ON604844）親緣關(guān)系較近，而與貴州煙草PVY分離物親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（圖3G）。

2.4""主要病毒的檢出率及分布

在貴州省5個(gè)百香果主產(chǎn)區(qū)采集的153份樣品中，全部檢測出病毒。不同的病毒分布存在一定差異（表3），EAPV的總檢出率最高，達(dá)96.08%，其余依次為TeMV（81.70%）、CMV（78.43%）、TuMV（44.44%）、PaMV（26.80%）、PVY（24.84%）和PLV（15.03%）。EAPV、TeMV和CMV分布最為廣泛，在所有百香果種植基地均有檢出，EAPV的檢出率在88.89%～100%之間，TeMV的檢出率在77.78%～90.48%之間，CMV的檢出率在63.89%～90.48%之間，是貴州省侵染百香果的主要病毒。TuMV在羅甸縣未檢出，在其余四縣的檢出率達(dá)52.38%～63.89%；PaMV和PLV的分布僅涉及鎮(zhèn)寧縣和貞豐縣；PVY在從江縣的檢出率最高。鎮(zhèn)寧縣檢測到7種病毒，貞豐縣檢測到6種病毒，榕江縣和從江縣檢測到5種病毒，羅甸縣檢測到3種病毒。

2.5""病毒的復(fù)合侵染類型

本研究采集的153份樣品中，共有8份為單一病毒侵染，分別為羅甸縣EAPV樣品3份、TeMV樣品2份、CMV樣品1份和貞豐縣PaMV樣品2份，其余145份樣品均為病毒復(fù)合侵染，"復(fù)合侵染率為94.77%。共有24種復(fù)合侵染類型，其中3～5種復(fù)合侵染類型占比較大，僅在7份樣品中檢測到6種病毒復(fù)合侵染類型，均出現(xiàn)在鎮(zhèn)寧縣和貞豐縣，未發(fā)現(xiàn)7種病毒復(fù)合侵染類型。EAPV+TeMV+CMV的復(fù)合侵染組合檢出23份，是復(fù)合侵染出現(xiàn)最多的類型（圖4）。

2.6""多重RT-PCR擴(kuò)增體系的建立和優(yōu)化

對侵染貴州百香果的主要病毒EAPV、TeMV"和CMV建立多重RT-PCR擴(kuò)增體系。設(shè)置不同引物濃度進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示引物加入量為0.5～"2"μL時(shí)，3種病毒均能擴(kuò)增出目的條帶，因此為節(jié)約成本，選取引物加入量為0.5"μL（反應(yīng)終濃度為2.0"mmol/L）為最佳引物濃度（圖5）。采用優(yōu)化后的引物濃度對多重RT-PCR體系的退火溫度進(jìn)行篩選，結(jié)果顯示當(dāng)退火溫度為54"℃時(shí)，3種病毒擴(kuò)增的目的條帶清晰無雜帶，因此選取54"℃為多重RT-PCR體系的最優(yōu)退火溫度（圖6）。采用優(yōu)化后的引物濃度和退火溫度對多重RT-PCR體系的循環(huán)次數(shù)進(jìn)行篩選，結(jié)果顯示當(dāng)循環(huán)次數(shù)為35次和40次時(shí)，擴(kuò)增出的條帶較清晰，因此為節(jié)約循環(huán)時(shí)間，選取循環(huán)次數(shù)35次為最佳循環(huán)次數(shù)（圖7）。

綜上所述，多重RT-PCR的最佳反應(yīng)體系為：2×Taq"PCR"MasterMix"Ⅱ"10"μL，10"μmol/L的上下游引物各0.5"μL，cDNA模板0.5"μL，無菌ddH2O補(bǔ)足至20"μL。最佳反應(yīng)條件為：94"℃預(yù)變性3"min；94"℃變性30"s，54"℃退火30"s，72"℃延伸50"s，循環(huán)35次；72"℃延伸10"min，4"℃保存。如圖8所示，利用優(yōu)化后的多重RT-PCR體系對12份EAPV、TeMV和CMV復(fù)合侵染的樣品進(jìn)行擴(kuò)增，條帶位置與預(yù)期大小吻合，檢測結(jié)果與單一RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果一致，因此該體系適用于EAPV、TeMV和CMV的多重檢測。

3""討論

3.1""貴州百香果病毒的復(fù)合感染情況

目前，國內(nèi)外報(bào)道能侵染百香果的病毒高達(dá)44種[16]，但對其復(fù)合侵染的研究較少。謝慧婷等[17]在廣西百香果上檢測出3種病毒，存在4種復(fù)合侵染類型，復(fù)合侵染率為34.30%；陳禮浪等[16]在海南百香果上檢測出7種病毒，存在32種復(fù)合侵染類型，以2～4種病毒復(fù)合侵染為主，復(fù)合侵染率達(dá)78.91%。本研究對貴州百香果主要種植區(qū)進(jìn)行檢測，共檢測到7種病毒及24種復(fù)合侵染類型，3～5種復(fù)合侵染類型占比較大，復(fù)合侵染率達(dá)94.77%。其中EAPV、TeMV和CMV的總檢出率高達(dá)78.43%～96.08%，在5個(gè)百香果主要種植區(qū)都有檢出，且在11種復(fù)合侵染類型中普遍存在，因此，這3種病毒為侵染貴州百香果主要種植區(qū)的優(yōu)勢病毒。

此外，本研究首次在百香果上檢測出PVY。PVY最早發(fā)現(xiàn)于英國的馬鈴薯上[18]，我國于1950年在煙草上首次發(fā)現(xiàn)[19]，該病毒傳播方式多樣，主要以蚜蟲為媒介進(jìn)行傳播，也可以通過汁液摩擦和嫁接等方式傳播。PVY的寄主種類繁多，可侵染茄科、豆科和藜科34個(gè)屬170余種植物，嚴(yán)重影響植物品質(zhì)及產(chǎn)量[20]。PVY與EAPV、TeMV、PaMV等常侵染百香果的病毒均屬于馬鈴薯Y病毒屬（Potyvirus），本研究通過孫琦等[15]已建立的PVY檢測體系，在百香果上首次檢測出PVY，說明百香果是PVY的新宿主，這為百香果病毒病監(jiān)測及防控提供了依據(jù)，為后續(xù)的相關(guān)研究提供技術(shù)支持。鑒于病毒發(fā)生和傳播的特性，后續(xù)應(yīng)加強(qiáng)對該病毒的監(jiān)管與檢測，防止其大面積傳播。

多重RT-PCR法可同時(shí)檢測多種病毒，顯著提高了檢測效率，但目前關(guān)于百香果的多重RT-PCR報(bào)道較少。本研究前期利用單一RT-PCR法檢測出貴州百香果的主要優(yōu)勢病毒為EAPV、TeMV和CMV，這3種病毒在福建[10]、海南[16]、廣西[17]等地也被廣泛檢出，是感染國內(nèi)百香果的主要病毒。本研究以單一RT-PCR檢測為基礎(chǔ)，對引物濃度和退火溫度等因素進(jìn)行了篩選優(yōu)化，建立了這3種病毒的多重RT-PCR體系，為百香果病毒的快速檢測提供了技術(shù)支持。

病毒侵染百香果后會呈現(xiàn)不同的田間癥狀，植物的表型癥狀會隨宿主種類、生長狀況、生長年齡、感染階段和外部條件不同而變化，在某些情況下，植物病毒病的癥狀與病蟲害的發(fā)生、植物營養(yǎng)缺乏、逆境脅迫和除草劑損害的癥狀非常相似，難以辨別[21]。本研究中百香果病毒病復(fù)合侵染情況嚴(yán)重，存在“一毒多癥”和“多毒一癥”的情況，僅通過表型觀察難以區(qū)分，因此在田間防治過程中，遇到疑似病毒感染植株應(yīng)及時(shí)送檢，以明確病毒種類，及時(shí)防治，從源頭上控制該病害的發(fā)生及傳播。值得注意的是，病毒病在新果園也有發(fā)生，說明苗木帶病，為了貴州百香果產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)性發(fā)展，培育本地脫毒苗并實(shí)行嚴(yán)格的種苗檢驗(yàn)檢疫措施刻不容緩。

3.2""貴州百香果的病毒序列多樣性分析

序列分析對病毒溯源有一定參考價(jià)值，通過構(gòu)建進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)，EAPV、TeMV、PaMV、PLV、TuMV均與中國各省份的百香果病毒分離物在同一亞組，存在一定的地理聚集性，這說明它們可能具有相同的進(jìn)化來源，病毒是通過苗木的跨地區(qū)引種銷售而實(shí)現(xiàn)的遠(yuǎn)距離傳播。其中，EAPV-"GZ分離物與臺灣百香果分離物（KP114136）一致性最高，與大陸首次檢測的百香果EAPV分離物（ON641738）親緣關(guān)系較近，因此合理推測大陸地區(qū)發(fā)現(xiàn)的EAPV是從臺灣引種時(shí)傳入的，這與謝麗雪等[7]的研究結(jié)果一致。TeMV-GZ與廣西百香果親緣關(guān)系較近，在本次采樣的5個(gè)縣均有檢出，嚴(yán)佳文等[12]和任羽羽等[13]也先后檢測到，這說明TeMV-GZ在貴州百香果中已經(jīng)廣泛流行。

將測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對時(shí)發(fā)現(xiàn)，CMV和PVY與相應(yīng)參考序列的相似性較低，經(jīng)構(gòu)建進(jìn)化樹可以看出，CMV和PVY分別與西班牙甜瓜和盧旺達(dá)辣椒的病毒分離物親緣關(guān)系較近，這說明病毒來源和感染途徑復(fù)雜，合理推測這也是PVY在貴州被首次發(fā)現(xiàn)的原因：（1）病毒的引種攜帶。據(jù)余亞白等[22]報(bào)道，國內(nèi)百香果品種多引自于臺灣，而臺灣百香果均引自于海外，其中不乏民間個(gè)人引進(jìn)，由于病毒病潛伏期長，缺乏引種檢疫意識，病毒可能通過國外引種時(shí)傳入。（2）病毒的跨物種傳播。CMV和PVY的自然寄主類型豐富，傳播方式多樣，蚜蟲等媒介可從通過啃食該病毒的其他宿主將其傳播至百香果中。因此在百香果的種植過程中，除了要增強(qiáng)引種檢疫意識，還要加強(qiáng)對傳播媒介的防治，把進(jìn)化關(guān)系較近的物種在同一地區(qū)分開種植，以免造成病毒的大面積播散。

近年來，在農(nóng)村產(chǎn)業(yè)發(fā)展的推動下，貴州百香果產(chǎn)業(yè)實(shí)現(xiàn)了高速發(fā)展，現(xiàn)種植規(guī)模已躍居全國第三。百香果作為貴州的特色優(yōu)勢水果，對鞏固脫貧攻堅(jiān)成果和深入實(shí)施鄉(xiāng)村振興戰(zhàn)略具有深刻的意義。本研究對貴州百香果主要種植區(qū)的病毒侵染情況進(jìn)行綜合分析，對該產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展具有一定的參考意義。

參考文獻(xiàn)

• 黃愛軍，"王瑩，"胡笑林."西番蓮病毒病研究進(jìn)展[J]."中國南方果樹，"2019，"48（3）："141-146.HUANG"A"J，"WANG"Y，"HU"X"L."Progress"in"research"on"Passiflora"edulis"virus"disease[J]."South"China"Fruits，"2019，"48（3）："141-146."（in"Chinese）
• 王力鈞."西番蓮綜合開發(fā)利用研究[J]."熱帶林業(yè)，"2005，"33（2）："25-26.WANG"L"J."Research"on"the"comprehensive"development"and"utilization"of"Passiflora"edulis[J]."Tropical"Forestry，"2005，"33（2）："25-26."（in"Chinese）
• 孫琪，"王亞楠，"張煥，"許玉蘭，"蔡年輝，"唐軍榮."西番蓮組織培養(yǎng)技術(shù)研究[J]."種子，"2018，"37（7）："78-81.SUN"Q，"WANG"Y"N，"ZHANG"H，"XU"Y"L，"CAI"N"H，"TANG"J"R."Study"on"the"tissue"culture"technology"of"Passiflora"edulis"Sims[J]."Seed，"2018，"37（7）："78-81."（in"Chinese）
• 陳雪梅，"劉夏蕾，"林標(biāo)聲，"陳小紅，"黎英."百香果果皮主要有效成分連續(xù)提取工藝[J]."熱帶作物學(xué)報(bào)，"2023，"44（2）："405-418.CHEN"X"M，"LIU"X"L，"LIN"B"S，"CHEN"X"H，"LI"Y."Continuousnbsp;extraction"technology"of"main"active"components"of"passion"fruit"peel[J]."Chinese"Journal"of"Tropical"Crops，"2023，"44（2）："405-418."（in"Chinese）

[5]"張中潤，"肖麗燕，"馮紅玉，"程子碩，"高玲."海南百香果病蟲害種類調(diào)查鑒定及其發(fā)生危害[J]."熱帶作物學(xué)報(bào)，"2022，"43（10）："2114-2121.ZHANG"Z"R，"XIAO"L"Y，"FENG"H"Y，"CHENG"Z"S，"GAO"L."Investigation"and"identification"of"diseases"and"pests"of"passion"fruit"in"Hainan"and"the"damages[J]."Chinese"Journal"of"Tropical"Crops，"2022，"43（10）："2114-2121."（in"Chinese）

[6]"羅金水，"周知恩，"王隆燊，"陳振東，"吳祖建，"林榮耀."西番蓮病毒病的發(fā)生與防控[J]."東南園藝，"2019，"7（6）："36-40.LUO"J"S，"ZHOU"Z"E，"WANG"L"S，"CHEN"Z"D，"WU"Z"J，"LIN"R"Y."Occurrence"and"prevention"and"control"suggestion"of"virus"diseases"of"passion"fruit[J]."Southeastern"Horticulture，"2019，"7（6）："36-40."（in"Chinese）

• 謝麗雪，"張立杰，"張小艷，"鄭姍，"李韜."福建西番蓮上首次檢出東亞西番蓮病毒[J]."園藝學(xué)報(bào)，"2018，"45（8）："1587-1594.XIE"L"X，"ZHANG"L"J，"ZHANG"X"Y，"ZHENG"S，"LI"T."First"report"of"East"Asian"Passiflora"virus"infecting"Passiflora"edulis"in"Fujian，"China[J]."Acta"Horticulturae"Sinica，"2018，"45（8）："1587-1594."（in"Chinese）
• 謝麗雪，"張小艷，"鄭姍，"張立杰，"李韜."侵染西番蓮的夜來香花葉病毒的分子鑒定及特異性檢測[J]."中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，"2017，"50（24）："4725-4734.XIE"L"X，"ZHANG"X"Y，"ZHENG"S，"ZHANG"L"J，"LI"T."Molecular"identification"and"specific"detection"of"Telosma"mosaic"virus"infecting"passion"fruit[J]."Scientia"Agricultura"Sinica，"2017，"50（24）："4725-4734."（in"Chinese）
• 焦楠，"朱寧，"程春振，"林玉玲，"李漢生，"陳發(fā)興，"賴鐘雄."西番蓮TeMV和CMV雙重RT-PCR檢測體系的建立及應(yīng)用[J]."果樹學(xué)報(bào)，"2019，"36（7）："947-953.JIAO"N，"ZHU"N，"CHENG"C"Z，"LIN"Y"L，"LI"H"S，"CHEN"F"X，"LAI"Z"X."Establishment"and"application"of"the"Telosma"mosaic"virus"and"Cucumber"mosaic"virus"duplex"RT-PCR"system"in"passionfruit[J]."Journal"of"Fruit"Science，"2019，"36（7）："947-953."（in"Chinese）
• 焦楠."西番蓮快繁體系建立及脫毒技術(shù)研究[D]."福州："福建農(nóng)林大學(xué)，"2019.JIAO"N."Establishment"of"a"fast"breeding"system"and"detoxification"technology"for"Passiflora"edulis[D]."Fuzhou："Fujian"Agriculture"and"Forestry"University，"2019."（in"Chinese）
• CARDONA"D，"HIGUITA"M，"POSADA"J，"GALLO"Y，"MARIN"M，"GUTIERREZ"P."Viruses"infecting"purple"passion"fruit"（Passiflora"edulis"f."edulis）"in"southwestern"Antioquia，"Colombia[J]."Archives"of"Phytopathology"and"Plant"Protection，"2022，"55（12）："1394-1409.
• 嚴(yán)佳文，"袁啟鳳，"解璞，"王立娟，"馬玉華，"王正媛."利用小RNA測序技術(shù)檢測貴州西番蓮病毒[J]."熱帶作物學(xué)報(bào)，"2019，"40（8）："1577-1584.YAN"J"W，"YUAN"Q"F，"XIE"P，"WANG"L"J，"MA"Y"H，"WANG"Z"Y."Identification"of"viruses"infecting"Passiflora"edulis"in"Guizhou"province"by"small"RNA"sequencing[J]."Chinese"Journal"of"Tropical"Crops，"2019，"40（8）："1577-1584."（in"Chinese）
• 任羽羽，"王立娟，"陳楠，"袁啟鳳，"馬玉華."三種百香果病毒在貴州的發(fā)生分布[J]."中國南方果樹，"2022，"51（3）："79-"82.REN"Y"Y，"WANG"L"J，"CHEN"N，"YUAN"Q"F，"MA"Y"H."Distribution"of"the"occurrence"of"three"Passiflora"edulis"viruses"in"Guizhou[J]."South"China"Fruits，"2022，"51（3）："79-82."（in"Chinese）
• 宋若楠，"侯永翔，"崔夢迪，"馮巖，"韓群鑫，"饒雪琴."廣東百香果病毒的檢測[J]."仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院學(xué)報(bào)，"2020，"33（1）："11-15.SONG"R"N，"HOU"Y"X，"CUI"M"D，"FENG"Y，"HAN"Q"X，"RAO"X"Q."Detection"of"virus"infecting"passion"fruit"in"Guangdong[J]."Journal"of"Zhongkai"University"of"Agriculture"and"Engineering，"2020，"33（1）："11-15."（in"Chinese）
• 孫琦，"張春慶."PVYN與PVYO病毒RT-PCR快速檢測體系研究[J]."中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，"2005，"38（1）："213-216.SUN"Q，"ZHANG"C"Q."Studies"on"the"methods"of"detecting"PVYN"and"PVYO"by"RT-PCR[J]."Scientia"Agricultura"Sinica"2005，"38（1）："213-216."（in"Chinese）
• 陳禮浪，"楊天章，"蔡儒平，"林小漫，"鄧南康，"車海彥，"林雅婷，"孔祥義."海南西番蓮主要病毒種類的分子檢測與鑒定[J]."園藝學(xué)報(bào)，"2022，"49（8）："1785-1794.CHEN"L"L，"YANG"T"Z，"CAI"R"P，"LIN"X"M，"DENG"N"K，"CHE"H"Y，"LIN"Y"T，"KONG"X"Y."Molecular"detection"and"identification"of"viruses"from"Passiflora"edulis"in"Hainan[J]."Acta"Horticulturae"Sinica，"2022，"49（8）："1785-1794."（in"Chinese）
• 謝慧婷，"李戰(zhàn)彪，"崔麗賢，"秦碧霞，"劉麗輝，"林珊宇，"陳錦清，"蔡健和."廣西局地西番蓮病毒病的病原鑒定及優(yōu)勢病毒分析[J]."植物病理學(xué)報(bào)，"2020，"50（4）："387-393.XIE"H"T，"LI"Z"B，"CUI"L"X，"QIN"B"X，"LIU"L"H，"LIN"S"Y，"CHEN"J"Q，"CAI"J"H."Identification"of"pathogens"and"analysis"of"the"dominant"viruses"of"passion"fruit"virus"disease"in"some"areas"of"Guangxi[J]."Acta"Phytopathologica"Sinice，"2020，"50（4）："387-393."（in"Chinese）
• SMITH"K"M."On"the"composite"nature"of"certain"potato"virus"diseases"of"the"mosaic"group"as"revealed"by"the"use"of"plant"indicators"and"selective"methods"of"transmission[J]."Proceedings"of"the"Royal"Society"of"London，"1931，"109（762）："251-267.
• 張諾妮，"曹洋，"梅運(yùn)鵬，"韓猛，"姚峰，"何文勤，"楊鵬，"楊章明，"王陽，"安德榮."煙草馬鈴薯Y病毒病發(fā)生規(guī)律及生物防治研究進(jìn)展[J]."北方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，"2022，"50（2）："110-116.ZHANG"N"N，"CAO"Y，"MEI"Y"P，"HAN"M，"YAO"F，"HE"W"Q，"YANG"P，"YANG"Z"M，"WANG"Y，"AN"D"R."Research"progress"on"the"occurrence"pattern"and"biological"control"of"tobacco"potato"virus"Y[J]."Journal"of"Northern"Agriculture，"2022，"50（2）："110-116."（in"Chinese）
• 楊森."馬鈴薯Y病毒病檢測方法及防治策略研究進(jìn)展[J]."世界農(nóng)藥，"2022，"44（10）："15-20.YANG"S."Research"progress"on"detection"methods"and"control"strategies"of"potato"Y"virus"disease[J]."World"Pesticide，"2022，"44（10）："15-20."（in"Chinese）
• 閻世江，"郭建恩."植物病毒病的防治研究進(jìn)展[J]."天津農(nóng)林科技，"2022（6）："26-32.YAN"S"J，"GUO"J"E."Advances"in"research"on"the"control"of"plant"viral"diseases[J]."Science"and"Technology"of"Tianjin"Agriculture"and"Forestry，"2022（6）："26-32."（in"Chinese）
• 余亞白，"陳源，"王琦，"謝鴻根，"賴呈純."臺灣果樹品種的引種、改良與種植[J]."福建農(nóng)業(yè)科技，"2008，"5（1）："92-94.YU"Y"B，"CHEN"Y，"WANG"Q，"XIE"H"G，"LAI"C"C."Introduction，"improvement"and"planting"of"fruit"tree"varieties"in"Taiwan[J]."Fujian"Agricultural"Science"and"Technology，"2008，"5（1）："92-94."（in"Chinese）