香樟胚性與非胚性愈傷組織間的差異研究

荊茹月，霍 坤，李志輝

（1.中南林業(yè)科技大學(xué) 林學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410004；2.湖南省汨羅市玉池國(guó)有林場(chǎng)，湖南 汨羅 414400）

香樟Cinnamomum camphoraL.為樟科樹(shù)種。是我國(guó)亞熱帶常綠闊葉林的代表種，國(guó)家二級(jí)保護(hù)的鄉(xiāng)土樹(shù)種，是天然香料提取、南方道路綠化、園林植物配置的首選樹(shù)種[1]。20世紀(jì)后期體細(xì)胞胚胎作為植物組織培養(yǎng)中的重要技術(shù)手段應(yīng)用于香樟的離體培養(yǎng)，在體細(xì)胞胚胎發(fā)生方面有杜麗等[2]以香樟未成熟合子胚為外植體通過(guò)誘導(dǎo)胚性愈傷組織產(chǎn)生完整植株。施雪萍等[3]在其基礎(chǔ)上進(jìn)一步完善了體胚發(fā)生體系并且研究了如何保持次生胚胚性。楊柳等[4]在此基礎(chǔ)上研究了不同種源間香樟體細(xì)胞胚胎發(fā)生各個(gè)階段所需的激素濃度的差異。目前已建立了較為完善的香樟組織培養(yǎng)及植株再生體系，為研究香樟胚性愈傷組織和非胚性愈傷組織提供了實(shí)驗(yàn)材料。

植物體細(xì)胞胚胎誘導(dǎo)過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)多種不同類型的愈傷組織，盡管不同的愈傷組織可以根據(jù)外觀、質(zhì)地、顏色的不同加以區(qū)別，但在體胚發(fā)生中需要快速且準(zhǔn)確地篩選出具有胚性、能進(jìn)一步增殖成熟的胚性愈傷組織。為保證體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑的后續(xù)步驟,對(duì)胚性愈傷組織和非胚性愈傷組織進(jìn)行早期識(shí)別是十分重要的環(huán)節(jié)。近年來(lái)，對(duì)于植物體胚誘導(dǎo)階段胚性愈傷組織和非胚性愈傷組織的研究從多個(gè)方面進(jìn)行展開(kāi),如對(duì)棗[5]、荔枝[6]、香榧[7]進(jìn)行的組織細(xì)胞學(xué)觀察,在麻櫟[8]、楸樹(shù)[9]等樹(shù)種中進(jìn)一步發(fā)展為掃描電鏡及透射電鏡觀察，以及在栓皮櫟[10]等多個(gè)樹(shù)種的體胚發(fā)生過(guò)程中的生理生化機(jī)理的研究都曾有報(bào)道。但在香樟體細(xì)胞胚發(fā)生過(guò)程中,僅有少數(shù)對(duì)于體細(xì)胞胚發(fā)生過(guò)程的切片觀察，而對(duì)胚性愈傷組織和非胚性愈傷組織的掃描電鏡觀察和生理生化的研究未有報(bào)道。

本文通過(guò)對(duì)香樟4 種愈傷組織進(jìn)行形態(tài)、石蠟切片及掃描電鏡觀察，從組織細(xì)胞水平對(duì)胚性愈傷組織和非胚性愈傷組織作了外部形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)差異的比較；與此同時(shí)利用生物化學(xué)技術(shù)，探究胚性愈傷組織與非胚性愈傷組織間的可溶性蛋白質(zhì)、可溶性糖、淀粉、抗氧化物酶含量的差異，通過(guò)兩者的生理生化差異為香樟胚性和非胚性愈傷組織的區(qū)分提供可靠的判斷依據(jù)，進(jìn)一步優(yōu)化誘導(dǎo)培養(yǎng)基的成分、提高體胚誘導(dǎo)率，為建立起愈傷組織的胚性發(fā)生能力與生化代謝間的關(guān)系提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料準(zhǔn)備

2018年7月上旬，在湖南省長(zhǎng)沙市中南林業(yè)科技大學(xué)校園內(nèi)選擇20年生，胸徑24～26 cm，長(zhǎng)勢(shì)一致且無(wú)病蟲害的1 株香樟優(yōu)樹(shù)為材料供體，采集外表嫩綠、光滑，無(wú)明顯機(jī)械損傷，直徑在0.6 cm 左右的未成熟果實(shí),去除果皮果肉，洗凈種子保存于4 ℃冰箱內(nèi)備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 愈傷組織的誘導(dǎo)

選取百粒重超過(guò)130 g 的種子，流水沖洗10 min，去除浮于水面上的種子，瀝水后放入事先滅菌過(guò)的燒杯中置于超凈工作臺(tái)上，75%的酒精浸泡60 s，無(wú)菌水沖洗3 次后，轉(zhuǎn)入0.1% HgCl2溶液中搖晃滅菌8 min，無(wú)菌水沖洗3～5 次。在超凈工作臺(tái)上劃開(kāi)種殼中部，取出未成熟合子胚以全胚胚根向下接種于香樟體胚發(fā)生誘導(dǎo)培養(yǎng)基上（MS+1.0mg/L 6-BA+0.3 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L 鏈霉素+6.5 g/L 瓊脂+700 mg/L 水解酪蛋白+30 g/L蔗糖），14 d 轉(zhuǎn)1 次，培養(yǎng)溫度為（23±2）℃，培養(yǎng)濕度為50%～60%，pH 值調(diào)至5.8～6.0，在121 ℃下消毒滅菌20 min，采用暗培養(yǎng)，每瓶接入2 個(gè)外植體，每個(gè)處理接種15 瓶，3 次重復(fù)。在接種10 d 后開(kāi)始，根據(jù)顏色、形態(tài)、質(zhì)地特征，分別選取胚性和非胚性愈傷組織，作為研究的材料，并對(duì)其進(jìn)行拍照記錄（圖1）。

1.2.2 愈傷組織的細(xì)胞學(xué)觀察

實(shí)驗(yàn)采用常規(guī)石蠟切片[11]，新鮮材料用50%酒精配制的FAA 固定液固定并用注射器進(jìn)行抽氣，切片厚度為9 um；用甘油和蛋清3∶2 的比例制作粘片劑，在載玻片上按照同方向拍打蛋液，烤片并烘干；進(jìn)行脫蠟和染色時(shí)，采用0.5%的固綠染色7 min，在95%的酒精中沖洗去多余的固綠，中性樹(shù)膠封片，將制作好的玻片放置于蔡司倒置顯微鏡下觀察拍照記錄。

1.2.3 愈傷組織的掃描電鏡觀察

掃描電鏡樣品的制作參照Fowke[12]的方法，挑選新鮮的胚性愈傷組織和非胚性愈傷組織材料固定在4%戊二醛中4 h，經(jīng)過(guò)一系列處理，在（CPD）臨界點(diǎn)干燥，粘臺(tái)，離子濺射儀噴金，在SEM-500 Philips 下進(jìn)行觀察拍照記錄。

1.2.4 愈傷組織的透射電鏡觀察

透射電鏡樣品的制作出去參照Fowke[12]，用乙醇逐級(jí)脫水每次30 min，環(huán)氧丙烷過(guò)渡3 次，每次30 min，調(diào)節(jié)環(huán)氧丙烷∶包埋劑比例為3∶1、1∶1、1∶3 進(jìn)行滲透，滲透時(shí)間分別為1、2、3 h，在純樹(shù)脂包埋劑中過(guò)夜。在恒溫箱中經(jīng)歷35 ℃～45 ℃～60 ℃分段升溫，在LKB-V 超薄切片機(jī)上切片，醋酸雙氧鈾染色，在Hitachi H-600型透射電鏡下觀察拍照。

1.2.5 愈傷組織的生理生化指標(biāo)測(cè)定

可溶性糖含量的測(cè)定采用蒽酮比色法測(cè)定[13]，稱取胚性和非胚性愈傷組織0.2 g，放入25 mL 刻度試管中，加入10～15 mL蒸餾水，塑料薄膜封口，沸水浴30 min，浸提2 次，在630 nm 波長(zhǎng)下測(cè)其吸光度。

淀粉含量的測(cè)定[13]是向提取過(guò)可溶性糖的沉淀中加入10 mL 蒸餾水，沸水浴15 min，冷卻至室溫后加入4 mL 的9.2 mol·L-1HClO4，4 000 r/min 離心10 min，浸提2 次，在630 nm 波長(zhǎng)下測(cè)其吸光度。

可溶性蛋白含量測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)G-250 染色法[13]，準(zhǔn)確稱取胚性和非胚性愈傷組織各0.2 g，放入研缽，加入5 mL 磷酸緩沖液，冰浴中研磨成勻漿，4 000 r/min 離心10 min，浸提2 次，上清液即為蛋白質(zhì)提取液，在595 nm 處測(cè)量吸光值，計(jì)算可溶性蛋白含量。

過(guò)氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）和過(guò)氧化氫酶（CAT）含量測(cè)定采用單一提取法，準(zhǔn)確稱取胚性和非胚性愈傷組織各0.2 g 加入磷酸緩沖液7 mL，冰浴研磨后，轉(zhuǎn)入離心管中，并于4 ℃下12 000 r/min 離心15 min，取上清液分別進(jìn)行各項(xiàng)酶活性測(cè)定。超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氮藍(lán)四唑還原法測(cè)定[13]，過(guò)氧化物酶（POD）活性采用愈創(chuàng)木酚比色法測(cè)定[13]，過(guò)氧化氫酶（CAT）活性采用還原過(guò)氧化氫的方法測(cè)定[13]。每項(xiàng)指標(biāo)均重復(fù)測(cè)定3 次，取平均值。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理

利用Excel 2013 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，利用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析，平均數(shù)在P=0.05水平上進(jìn)行鄧肯多重比較。圖表中數(shù)據(jù)均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 愈傷組織的類型及組織細(xì)胞學(xué)觀察

香樟未成熟合子胚接種后，子葉連接處最先誘導(dǎo)出愈傷組織，愈傷組織類型與激素、碳源及溫度、光照等環(huán)境因素緊密相關(guān)。依據(jù)愈傷組織形態(tài)和細(xì)胞特征可分為4 種類型（表1）。

表1 4 類愈傷組織的特征分析?Table 1 Characteristic analysis of four types of Cinnamoumum camphora callus

第1 類愈傷組織（圖1A）由1 mm 的小顆粒團(tuán)塊狀組成，細(xì)胞大形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞壁薄，細(xì)胞內(nèi)含物少，僅含有少量的淀粉粒。愈傷組織呈灰色半透明，質(zhì)地松軟部分呈水漬化，含水量高，和母體聯(lián)系緊密，不易分離。生長(zhǎng)速度快，能在培養(yǎng)基中多次增殖，但隨著增值次數(shù)的增多，生長(zhǎng)速度逐漸減慢，最終褐化死亡，不能發(fā)育為體胚細(xì)胞，屬于非胚性愈傷組織。第2 類愈傷組織（圖1B）由5 mm 的大顆粒凸起組成，細(xì)胞體積大壁薄多為橢球形，細(xì)胞空泡化明顯。愈傷組織為白色不透明，質(zhì)地緊密光滑，和母體連接緊密不易分離。生長(zhǎng)速度緩慢，在培養(yǎng)基中多次轉(zhuǎn)接并沒(méi)有很大的變化，連續(xù)轉(zhuǎn)接5 次后仍然維持原樣，隨著繼代次數(shù)的增加,白色塊狀結(jié)構(gòu)越來(lái)越緊實(shí)，不能誘導(dǎo)出體胚細(xì)胞，屬于非胚性愈傷組織。第3 類愈傷組織（圖1C）由2 mm 的顆粒分散組成，細(xì)胞多數(shù)已經(jīng)衰老、破碎開(kāi)始解體，在少數(shù)衰老細(xì)胞中能看到淀粉粒的積累。愈傷組織為深黃色大顆粒狀，組織脆性疏松，和外植體連接十分松散不需要外力即可分離。生長(zhǎng)速度較緩慢，生活力低下，繼代培養(yǎng)1～2 次即褐化死亡，不能誘導(dǎo)出體胚細(xì)胞，屬于非胚性愈傷組織。第4 類愈傷組織（圖1D）由2 mm 的球狀凸起組成，細(xì)胞壁厚質(zhì)濃、細(xì)胞體積較小、細(xì)胞內(nèi)含物多，愈傷組織整體呈現(xiàn)白色，表面散布淡黃色顆粒，愈傷組織與外植體聯(lián)系較少，生長(zhǎng)速度較快并能多次繼代，培養(yǎng)1 個(gè)月后愈傷組織發(fā)育出肉眼可見(jiàn)白色子葉胚，可以誘導(dǎo)出體胚細(xì)胞，屬于胚性愈傷組織。

圖1 香樟愈傷組織的類型Fig.1 Types of Cinnamomum camphora callus

2.2 香樟胚性細(xì)胞與非胚性細(xì)胞的差異與形成過(guò)程

顯微觀察胚性愈傷組織可以看到其中有多個(gè)分化中心，分化中心內(nèi)部是胚細(xì)胞，其外部是非胚性細(xì)胞（圖2A）。胚細(xì)胞較小約為13～30 um，橢球型，排列緊密，易被染色：一種為細(xì)胞質(zhì)濃厚，細(xì)胞核位于中間，淀粉粒含量多，細(xì)胞多位于分化中心的邊緣，另一種為細(xì)胞質(zhì)濃厚，但細(xì)胞核位于邊緣且淀粉粒含量較少，該類胚性細(xì)胞一般處于分化中心的中央，推測(cè)該類胚性細(xì)胞已經(jīng)完成了初步的分化，隨后將發(fā)育成特定的胚組織（圖2B）。

分化中心周圍由于細(xì)胞質(zhì)濃厚、細(xì)胞體積大、淀粉粒含量較多、具有中央大液泡、幾乎不含有細(xì)胞器的非胚性細(xì)胞包圍，在這類非胚性細(xì)胞的外圍分布著只含有少數(shù)細(xì)胞質(zhì)，除此以外幾乎不含有任何營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，細(xì)胞體積很大呈現(xiàn)空泡狀的第二種非胚性細(xì)胞（圖2C）。

圖2 香樟胚性細(xì)胞與非胚性細(xì)胞間的差異Fig.2 Differences between embryonic and non-embryonic cells of Cinnamomum camphora

2.3 香樟的胚性愈傷組織與非胚性愈傷組織的掃描電鏡觀察

從愈傷組織的掃描電鏡觀察中可以看出4 種愈傷組織表面的差異明顯，第一類愈傷組織表面細(xì)胞不飽滿大部分死亡破裂,呈雪花狀分布,表面粗糙，細(xì)胞之間結(jié)合較緊密，幾乎看不到空隙，細(xì)胞表面有大量絮狀附著物（圖3A），屬于非胚性愈傷組織；第二類愈傷組織表面細(xì)胞形成較大的凸起，形狀呈不規(guī)則的球形或橢球型,在大的凸起上分布著不明顯的小凸起，細(xì)胞之間結(jié)合較緊密，幾乎看不到空隙，其中部分的細(xì)胞老化，存在小的凹陷（圖3B），屬于非胚性愈傷組織。第三類愈傷組織表面細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞表面有少量附著物，大部分以單個(gè)細(xì)胞存在，絕大部分細(xì)胞老化，凹陷明顯（圖3C），屬于非胚性愈傷組織。第四類愈傷組織表面細(xì)胞凸起，呈規(guī)則的顆粒狀突起或皺褶凸起，容易成團(tuán)分布，大小近似，成團(tuán)的細(xì)胞間結(jié)合十分緊密，而細(xì)胞團(tuán)與細(xì)胞團(tuán)之間存在空隙，細(xì)胞表面有少量絮狀附著物，邊緣部分表面細(xì)胞老化死亡破裂（圖3D），屬于胚性愈傷組織。

圖3 香樟愈傷組織的掃描電鏡觀察Fig.3 Scanning observation of Cinnamomum camphora callus

2.4 香樟胚性愈傷組織與非胚性愈傷組織的透射電鏡觀察

從愈傷組織的透射電鏡觀察圖4中可以看出4種愈傷組織間的差異明顯，第一類愈傷組織的細(xì)胞沒(méi)有明顯的形狀，細(xì)胞間排列緊密，有較大的液泡，細(xì)胞質(zhì)較少且分布在細(xì)胞四周，內(nèi)部只有零星的小物質(zhì)，沒(méi)有細(xì)胞核和其它細(xì)胞器，細(xì)胞壁變形，有輕微的質(zhì)壁分離現(xiàn)象（圖4A），屬于非胚性愈傷組織。第二類愈傷組織有明顯的中央大液泡，細(xì)胞質(zhì)很少分布于細(xì)胞的邊緣，存在少量的淀粉粒及零星的小物質(zhì)，沒(méi)有細(xì)胞核和其他細(xì)胞器，質(zhì)壁分離現(xiàn)象不明顯（圖4B），屬于非胚性愈傷組織。第三類愈傷組織只有少量的細(xì)胞質(zhì)和液泡，液泡皺縮，質(zhì)壁分離現(xiàn)象明顯（圖4C），屬于非胚性愈傷組織。第四類愈傷組織有濃厚的細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞核大，核仁明顯，內(nèi)含物很豐富，在靠近細(xì)胞膜的胞質(zhì)區(qū)域里有較多的淀粉粒和線粒體，還可觀察到其內(nèi)含有淀粉粒的葉綠體，有很多脂體分布在靠近細(xì)胞膜的區(qū)域（圖4D），屬于胚性愈傷組織。

圖4 香樟愈傷組織的透射電鏡觀察Fig.4 Ultrastructure of Cinnamomum camphora callus

2.5 香樟胚性愈傷組織與非胚性愈傷組織的生理生化特性研究

香樟胚性和非胚性愈傷組織的生理生化特性測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2，結(jié)果顯示第四類愈傷組織內(nèi)的可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、淀粉以及抗氧化物酶（除POD 酶外）的活性均明顯高于前三類愈傷組織中各成分的含量，結(jié)合組織細(xì)胞學(xué)觀察的結(jié)果再次驗(yàn)證第一類、第二類、第三類愈傷組織為非胚性愈傷組織，而第四類愈傷組織為胚性愈傷組織。

表2 香樟胚性愈傷組織與非胚性愈傷組織的生理生化特性測(cè)定Table 2 Physiological and biochemical characteristics of embryogenic and non-embryogenic callus of Cinnamomum camphora

香樟胚性愈傷組織的可溶性糖的含量約為非胚性愈傷組織中的3 倍，胚性愈傷組織與非胚性愈傷組織的可溶性糖的含量差異顯著（P＜0.05），在三種非胚性愈傷組織可溶性糖的含量差異不明顯（P＞0.05）。

香樟胚性愈傷組織中可溶性蛋白質(zhì)的含量顯著大于非胚性愈傷組織，兩者相差約4.7 倍。胚性愈傷組織與非胚性愈傷組織的可溶性蛋白含量差異顯著（P＜0.05），說(shuō)明香樟胚性愈傷組織可溶性蛋白含量極顯著高于非胚性愈傷組織，而在非胚性愈傷組織間三者差異不顯著（P＞0.05）。

香樟胚性愈傷組織的淀粉的含量約為非胚性愈傷組織中的3.6 倍，胚性愈傷組織與非胚性愈傷組織的淀粉的含量差異顯著（P＜0.05），而三種非胚性愈傷組織淀粉的含量差異不明顯（P＞0.05）。

香樟胚性愈傷組織中過(guò)氧化氫酶（CAT）活性明顯高于非胚性愈傷組織,其活性大小約為非胚性愈傷組織的2.4 倍，胚性愈傷組織與非胚性愈傷組織的CAT 的含量差異顯著（P＜0.05），在三種非胚性愈傷組織中CAT 的含量差異不明顯（P＞0.05）。

香樟胚性愈傷組織中過(guò)氧化物酶（POD）活性非胚性愈傷組織的活性明顯高于胚性愈傷組織中POD 活性，約為胚性愈傷組織中的1.4 倍，胚性愈傷組織與非胚性愈傷組織的POD 酶含量差異顯著（P＜0.05），而三種非胚性愈傷組織POD的含量差異不明顯（P＞0.05）。

香樟胚性愈傷組織中超氧化物歧化酶（SOD）活性表現(xiàn)為胚性愈傷組織仍明顯高于非胚性愈傷組織，其活性為非胚性愈傷組織中的3 倍，胚性愈傷組織與非胚性愈傷組織的SOD 酶含量差異顯著（P＜0.05），而三種非胚性愈傷組織SOD 酶的含量差異不明顯（P＞0.05）。

2.6 香樟胚性愈傷組織與非胚性愈傷組織的發(fā)生位置差異

對(duì)于胚性愈傷組織和非胚性愈傷組織發(fā)生的位置來(lái)說(shuō)，從圖5可以看出，非胚性愈傷組織先發(fā)生在兩片子葉的中間，向外部不斷擴(kuò)增。胚性愈傷組織的發(fā)生位置有三種：一種是發(fā)生在胚根端（圖5A），直接發(fā)生方式形成的胚性愈傷組織多發(fā)生在此；第二種發(fā)生在已形成的愈傷組織的外側(cè)（圖5B），愈傷組織邊緣細(xì)胞通過(guò)有絲分裂活動(dòng)形成胚性細(xì)胞，胚性細(xì)胞進(jìn)一步分裂、增殖，形成顆粒團(tuán)塊狀的胚性愈傷組織，位于愈傷組織外側(cè)。第三種情況較特殊是極少數(shù)非胚性愈傷組織在多次轉(zhuǎn)接接近褐化或衰退的時(shí)候其邊緣會(huì)出現(xiàn)極少量的胚性愈傷組織（圖5C），這種轉(zhuǎn)化與培養(yǎng)基中所使用的激素關(guān)系很大，外植體脫分化形成的愈傷組織體積越大，其表面的細(xì)胞受到外植體內(nèi)激素的制約越小，多次繼代后，隨著愈傷組織內(nèi)部2,4-d的積累，極少部分細(xì)胞脫分化在褐化的表面形成了胚性愈傷組織。

圖5 香樟愈傷組織的發(fā)生位置Fig.5 Location of Cinnamomum camphora callus

3 討論與結(jié)論

本研究通過(guò)對(duì)4 種愈傷組織進(jìn)行組織細(xì)胞學(xué)觀察、掃描電鏡觀察可以看出，不同愈傷組織的組織學(xué)形態(tài)不同,其細(xì)胞學(xué)觀察也存在著明顯的差異。這與蒙古黃榆[14]、柑橘[15]、黃山欒樹(shù)[16]等木本植物的研究結(jié)果類似。掃描電鏡的結(jié)果與香雪蘭[17]、西洋參[17]、人參[17]、光棘豆[17]的研究結(jié)果類似。但在對(duì)楸樹(shù)[9]的研究中還發(fā)現(xiàn)紫色愈傷組織表面細(xì)胞呈現(xiàn)線形條紋,以及楸樹(shù)褐色愈傷組織及麻櫟非胚性愈傷組織表面細(xì)胞形態(tài)為長(zhǎng)條形，這在香樟的掃描電鏡觀察中還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)，可能是由于樹(shù)種間的不同和培養(yǎng)基中的激素種類、濃度引起愈傷組織的發(fā)育情況不同造成的。

本研究通過(guò)對(duì)4 種愈傷組織進(jìn)行組織細(xì)胞學(xué)觀察、掃描透射電鏡觀察可以看出,胚性愈傷組織細(xì)胞質(zhì)濃,細(xì)胞核大,細(xì)胞器豐富，而非胚性愈傷組織只有大液泡和稀薄的細(xì)胞質(zhì)，幾乎不含有細(xì)胞器，本研究與在石刁柏[18]、楸樹(shù)[9]、山杏[19]、早實(shí)核桃[20]中得到的結(jié)果類似。

研究表明淀粉含量是決定胚胎發(fā)生能力的關(guān)鍵因素，在對(duì)馬唐愈傷組織的組織學(xué)研究中可以得出，胚性組織中淀粉粒含量是非胚性中的10～40 倍[21]。這與本研究的結(jié)果相符。

有關(guān)體細(xì)胞胚發(fā)生中胚性和非胚性組織中可溶性蛋白質(zhì)含量已有大量的研究報(bào)道，其中胚性愈傷組織代謝活性明顯高于非胚性。對(duì)連香樹(shù)[22]等植物體細(xì)胞胚的研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)胚性愈傷組織的可溶性蛋白質(zhì)含量和合成速率遠(yuǎn)高于非胚性愈傷組織。鄭曉峰等[17]對(duì)西洋參、香雪蘭、光棘豆和人參4種植物的胚性、非胚性愈傷組織及胚狀體的可溶性蛋白進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，這4 種植物的胚性愈傷組織中可溶性蛋白含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)非胚性愈傷組織.這與本研究中香樟的胚性愈傷組織的可溶性蛋白含量大約是非胚性的4.7 倍的結(jié)果相符。

可溶性糖含量水平標(biāo)志著源端的同化物供應(yīng)能力和庫(kù)端對(duì)同化物的轉(zhuǎn)化、利用能力[23]。在本實(shí)驗(yàn)中，香樟胚性愈傷組織可溶性糖含量顯著高于非胚性愈傷組織，這與Neves 等[24]在甘蔗、孟姣等[10]在栓皮櫟中的研究相符，表明胚性愈傷組織新陳代謝速率高于非胚型愈傷組織，高濃度的可溶性糖為胚性愈傷組織產(chǎn)生體細(xì)胞提供能量。而在張獻(xiàn)龍等[25]對(duì)陸地棉的研究以及李茜等[26]在對(duì)白皮松體細(xì)胞胚的研究發(fā)現(xiàn)表明其胚性愈傷組織中可溶性糖含量會(huì)接近或低于非胚性愈傷組織，這是因?yàn)榕咝杂鷤M織已經(jīng)將可溶性糖轉(zhuǎn)化成誘導(dǎo)體細(xì)胞胚所需的RNA 和蛋白質(zhì)。因此取樣的時(shí)間不同很可能會(huì)導(dǎo)致胚性愈傷組織和非胚性愈傷組織的可溶性糖含量的差異。

抗氧化酶常作為植物生理代謝活動(dòng)的指標(biāo)酶,其活性的變化可以反映出外植體生理代謝水平的變化及胚胎發(fā)育情況[27]。一般認(rèn)為，POD 在體胚誘導(dǎo)階段起主要作用，而SOD 和CAT 在體胚的發(fā)育和成熟中發(fā)揮主要作用[28]。杜虹等[29]研究大白菜子葉培養(yǎng)過(guò)程中觀察到，再分化時(shí)期POD 活性較高，酶的反應(yīng)活躍。崔凱榮等[30]測(cè)定枸杞的體胚發(fā)生中發(fā)現(xiàn)，抑制SOD 活性后，體胚發(fā)生頻率會(huì)降低，抑制CAT 活性后，體胚發(fā)生頻率會(huì)升高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述結(jié)果類似：胚性愈傷組織中SOD、CAT 酶的活性均高于非胚性愈傷組織，且POD 酶的活性在胚性愈傷組織中占有主要作用，說(shuō)明胚性愈傷組織細(xì)胞的適應(yīng)性、抗逆性強(qiáng)于非胚性愈傷組織，為誘導(dǎo)出體細(xì)胞胚做好了準(zhǔn)備。

在本研究中已經(jīng)從組織學(xué)、細(xì)胞學(xué)以及生理生化三個(gè)方面分析了香樟胚性愈傷組織和非胚性愈傷組織之間的差異，在但對(duì)體細(xì)胞胚胎發(fā)生過(guò)程中的特異性蛋白、同工酶的活性未做更深層次的研究。之后的研究過(guò)程中還可以繼續(xù)分析測(cè)定完整的體細(xì)胞胚胎發(fā)生過(guò)程中的生理生化特性以及蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化，找出體細(xì)胞胚胎發(fā)生的分子標(biāo)志物，對(duì)體細(xì)胞胚胎發(fā)生發(fā)育過(guò)程進(jìn)行調(diào)控，更深入的揭示體細(xì)胞胚胎發(fā)生的分子機(jī)理。