釀酒酵母菌株的篩選與發(fā)酵特性分析

張 莉,張 蘭,張 玉,許亞杰,李華瑋

(1.河南工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001； 2.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450046)

酵母菌大多數(shù)為腐生，生活在含糖量較高、偏酸性的環(huán)境中。酵母是人類應(yīng)用最早和較為廣泛的微生物之一，利用酵母可以制作發(fā)酵食品、釀酒。隨著人們對酵母菌研究的不斷深入，酵母菌也逐漸被應(yīng)用在環(huán)境保護(hù)、物料生產(chǎn)、酶制劑以及醫(yī)藥工業(yè)等各個方面。釀酒酵母是釀酒工業(yè)發(fā)酵最主要的菌種，是酒品質(zhì)的靈魂，對酒體顏色、氣味、口感的影響非常大[1]。品質(zhì)優(yōu)良的釀酒酵母生長速度比較快，而且在較高的糖度、酸度、酒精度或SO2濃度中也能夠快速平穩(wěn)地發(fā)酵。使用不同酵母菌種發(fā)酵生產(chǎn)的酒，其酒體質(zhì)量和口感也不一樣，因此，篩選優(yōu)良釀酒酵母菌對于優(yōu)質(zhì)酒的生產(chǎn)具有重要意義。目前,國內(nèi)大部分葡萄酒廠所使用的酵母菌大多是國外的商業(yè)酵母，此種酵母的大量使用會使葡萄酒釀造過程中本土酵母失去發(fā)酵主導(dǎo)地位，導(dǎo)致釀造出的葡萄酒風(fēng)格單一，體現(xiàn)不出產(chǎn)區(qū)特色[2]。優(yōu)良的本土釀酒酵母菌缺乏，在一定程度上制約了我國釀酒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，目前國內(nèi)的研究者已對我國本土優(yōu)質(zhì)酵母菌種進(jìn)行了選育工作。王志恒等[3]對寧夏玉泉營地區(qū)葡萄園土壤、葡萄果皮等中的酵母菌進(jìn)行分離篩選和菌株鑒定，共鑒定出6種菌株，分別為大隱球酵母(Cryptococcusmagnus)、美極梅奇酵母(Metsclmikowiapulcherrima)、葡萄酒有孢漢生酵母(Hanseniasporavineae)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)等。楊小沖等[4]對內(nèi)蒙古各旗縣果園的果實(shí)和土壤中的酵母菌進(jìn)行分離篩選，得到一株可耐受酒精度16% vol的酵母菌株。程仕偉等[5]對煙臺本土釀酒酵母進(jìn)行選育，用貴人香葡萄自然發(fā)酵醪液涂布選擇性培養(yǎng)基篩選出優(yōu)良酵母菌株YGF2，將其用于釀造霞多麗干白葡萄酒，釀造的葡萄酒質(zhì)量較好，香氣濃郁。對本土釀酒酵母菌種資源的研究鑒定是優(yōu)良釀酒酵母菌種選種、育種、優(yōu)化的基礎(chǔ)，對保存我國優(yōu)良釀酒酵母菌種資源和開發(fā)工業(yè)菌種也具有重要意義[6]。為此，對河南省本土釀酒酵母菌種進(jìn)行分離篩選，并對其發(fā)酵特性進(jìn)行研究，以期為本地優(yōu)良酵母菌種資源研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

酵母菌分離材料來自河南省鄭州、洛陽、南陽、開封4個地區(qū)的果園土壤、果實(shí)及表皮。

PDA培養(yǎng)基(分離培養(yǎng)基)：稱取100 g馬鈴薯，切成小塊煮爛，用紗布過濾，加入葡萄糖10 g、瓊脂10 g，繼續(xù)加熱混勻，稍冷卻后補(bǔ)水定容至500 mL，分裝到三角瓶中，115 ℃滅菌25 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：稱取100 g馬鈴薯切塊，煮爛過濾，加入葡萄糖7.5 g，補(bǔ)水至500 mL，115 ℃滅菌25 min。

耐性基礎(chǔ)培養(yǎng)基：稱取100 g馬鈴薯切塊，煮爛過濾，加入2%葡萄糖，調(diào)節(jié)pH值至7.0，115 ℃滅菌25 min。

1.2 方法

1.2.1 釀酒酵母菌的分離 采用10倍稀釋法用無菌水將果園土壤、果實(shí)及表皮等樣品稀釋至10-4、10-5、10-6[7]，分別吸取1 mL稀釋液轉(zhuǎn)入PDA培養(yǎng)基中，用涂布棒涂抹均勻，于28 ℃培養(yǎng)48 h，待培養(yǎng)基表面長出單個菌落。根據(jù)菌落大小、顏色、透明度，篩選出具有釀酒酵母菌典型菌落特征的單個菌落[8]，用接種針挑取單個菌落于平板上劃線分離，劃線分離3次后，用顯微鏡觀察，挑選純菌落，然后接種在試管培養(yǎng)基斜面上，28 ℃條件下培養(yǎng)48 h后，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 釀酒酵母菌的篩選 將分離得到的釀酒酵母活化24 h后，接種于含100 g/L葡萄糖帶有杜氏小管的發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為2%，接種濃度為106個/mL(使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù))，在28 ℃條件下發(fā)酵，以起始發(fā)酵時間、發(fā)酵速度和發(fā)酵氣味為指標(biāo)，篩選發(fā)酵啟動時間較快、發(fā)酵速度快、發(fā)酵氣味較好的菌株進(jìn)行下一步耐受性試驗(yàn)[9]。

1.2.3 釀酒酵母菌耐受性測定

1.2.3.1 高糖耐受性 分別配制含葡萄糖100、200、300、400 g/L帶有杜氏小管的耐性基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別接種活化24 h的1.2.2中篩選的釀酒酵母菌株(使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，接種量為2%，接種濃度為106個/mL)[10]，恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度設(shè)定為28 ℃，記錄發(fā)酵啟動時間和發(fā)酵結(jié)束時間。在釀酒酵母菌接種之后開始記時，等到培養(yǎng)基內(nèi)杜氏小管開始產(chǎn)生氣泡時，記錄產(chǎn)氣的開始時間即發(fā)酵啟動時間，以氣泡產(chǎn)生時間的長短來評定釀酒酵母發(fā)酵過程的長短。下同。

1.2.3.2 高酒精耐受性 分別配制酒精體積分?jǐn)?shù)10%、20%、30%、40%帶有杜氏小管的耐性基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別接種活化24 h的1.2.2篩選的釀酒酵母菌株(使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，接種量為2%，接種濃度為106個/mL)，在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度設(shè)定為28 ℃，記錄發(fā)酵啟動時間和結(jié)束時間。

1.2.3.3 高酸耐受性 分別配制含檸檬酸質(zhì)量濃度為5、10、15、20 g/L帶有杜氏小管的耐性基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別接種活化24 h的1.2.2中篩選的釀酒酵母菌株(使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，接種量為2%，接種濃度為106個/mL)，在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度設(shè)定為28 ℃，記錄發(fā)酵啟動時間和結(jié)束時間。

1.2.3.4 高SO2耐受性 分別配制含SO2100、150、200、250 mg/L帶有杜氏小管的耐性基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別接種活化24 h的1.2.2篩選的釀酒酵母菌株(使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，接種量為2%，接種濃度為106個/mL)，在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度設(shè)定為28 ℃，記錄發(fā)酵啟動時間和結(jié)束時間。

1.2.4 釀酒酵母發(fā)酵條件的優(yōu)化

1.2.4.1 原料的預(yù)處理 將挑選、清洗后的蘋果原料去核打漿。為防止蘋果汁褐變,可在去核的過程中用SO2進(jìn)行護(hù)色，同時SO2還具有殺菌、抗氧化、澄清、改善酒的風(fēng)味等作用。打漿壓榨后立即加入100 mg/L SO2，并攪拌均勻(SO2選用偏重亞硫酸鉀，1 g偏重亞硫酸鉀約含0.5 g SO2)[11]。使用SO2處理盛裝蘋果汁的容器。將處理過的蘋果汁搖勻，對其進(jìn)行過濾，之后靜置澄清。由于果膠酶在低溫下作用不明顯，同時影響對不同蘋果原料沉渣量的觀測，所以在澄清過程中未使用果膠酶。

1.2.4.2 釀酒酵母發(fā)酵條件優(yōu)化 將上述澄清蘋果汁分別加入三角瓶中，蘋果汁的量約占發(fā)酵容器的3/4，釀酒酵母接種量為200 mg/L，在不同發(fā)酵條件下測定蘋果汁在發(fā)酵過程中殘?zhí)橇俊⒕凭鹊淖兓?，并通過感官評價釀酒酵母發(fā)酵性能的優(yōu)劣，以確定最優(yōu)發(fā)酵條件。從理論上計(jì)算，1 mol葡萄糖經(jīng)過發(fā)酵之后可生成2 mol乙醇，根據(jù)蘋果酒的主要生理生化指標(biāo)及特性，只有酒精度達(dá)到10% vol以上，產(chǎn)品質(zhì)量才算合格。當(dāng)蘋果汁糖度不夠時需要加糖，但加糖量不宜過高，過高會影響成品質(zhì)量。因此，在溫度25 ℃、pH值4.0條件下，初始發(fā)酵糖(葡萄糖)質(zhì)量濃度分別選擇200、250、300 g/L進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，以確定最優(yōu)葡萄糖質(zhì)量濃度。低酸性環(huán)境可以抑制有害微生物的生長，如果蘋果汁的酸度不夠，可能會造成細(xì)菌、霉菌等雜菌的大量生長，最后污染蘋果汁，影響其發(fā)酵。釀酒酵母菌的最適pH值為4.0～5.0，因此，在溫度25 ℃、葡萄糖質(zhì)量濃度200 g/L條件下，選擇pH值分別為3.0、4.0、5.0進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，以確定最優(yōu)pH值。釀酒酵母菌最適生長溫度在28 ℃左右，故在葡萄糖質(zhì)量濃度200 g/L、pH值4.0條件下，選擇初始溫度分別為20、25、30 ℃進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，以確定最優(yōu)溫度[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 釀酒酵母菌株的篩選及形態(tài)特征

對從蘋果園土壤、果實(shí)及表皮等分離得到的釀酒酵母，進(jìn)行初步篩選，得到發(fā)酵啟動時間較早、發(fā)酵速度較快、發(fā)酵氣味較好的36株菌株。進(jìn)一步對這36株釀酒酵母菌株進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，釀酒酵母菌株Y-1、Y-2、Y-5、Y-7、F-3、F-4、F-5、F-8發(fā)酵開始后6 h杜氏小管產(chǎn)氣泡，發(fā)酵后20 h開始大量產(chǎn)生氣泡，24 h達(dá)到高峰，菌液濃度可以達(dá)到108個/mL，酒香味較濃，26 h發(fā)酵基本結(jié)束。說明這8株釀酒酵母菌適合進(jìn)行下一步耐受性試驗(yàn)。

對這8株釀酒酵母菌株進(jìn)行菌落和細(xì)胞形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，菌落呈白色、乳白色、淡黃色、黃色，菌體扁平或凸起，菌落大小各異，邊緣整齊，挑起時粘連，多數(shù)生長速度較快，有明顯或者濃郁的酒香味；細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)圓球形、橢圓形或卵圓形，一端或兩端出芽(表1)。

表1 釀酒酵母菌株的菌落和細(xì)胞形態(tài)特征

2.2 釀酒酵母菌株的耐受性

2.2.1 高糖耐受性 釀酒工業(yè)中，酒精發(fā)酵的基礎(chǔ)是糖，但是高濃度的糖會對釀酒酵母生長產(chǎn)生抑制作用，影響發(fā)酵的進(jìn)行。從表2可以看出，隨著葡萄糖質(zhì)量濃度逐漸升高，釀酒酵母發(fā)酵啟動時間總體上隨之延長。其中，Y-2、F-3菌株與同系列其他菌株相比總體上發(fā)酵啟動時間較早、發(fā)酵速度較快，即使在300～400 g/L高葡萄糖質(zhì)量濃度下也能較快的啟動發(fā)酵。

2.2.2 高酒精耐受性 酒精體積分?jǐn)?shù)越高，越能夠抑制釀酒酵母的存活率、發(fā)酵力和增殖速度。耐酒精能力強(qiáng)的菌株可以發(fā)酵更加完全、徹底，從而提高酒的酒精度[13]。從表3可以看出，酒精體積分?jǐn)?shù)越高，釀酒酵母發(fā)酵啟動和結(jié)束時間均越晚，發(fā)酵速度越緩慢。當(dāng)酒精體積分?jǐn)?shù)達(dá)到14%時，菌株Y-1沒有發(fā)酵產(chǎn)氣；當(dāng)酒精體積分?jǐn)?shù)在12%～16%時，F(xiàn)-8菌株沒有發(fā)酵產(chǎn)氣；當(dāng)酒精體積分?jǐn)?shù)達(dá)到16% 時，菌株F-5沒有發(fā)酵產(chǎn)氣。Y-2、Y-5、Y-7、F-3、F-4菌株在較高酒精體積分?jǐn)?shù)下雖然發(fā)酵啟動時間晚，但仍然能夠啟動發(fā)酵，具有較強(qiáng)的高酒精耐受性。在酒精體積分?jǐn)?shù)14%～16%條件下，Y-2、F-3菌株的發(fā)酵啟動時間早于同系列其他菌株。

表2 葡萄糖質(zhì)量濃度對不同酵母菌株發(fā)酵啟動和結(jié)束時間的影響

表3 酒精體積分?jǐn)?shù)對不同酵母菌株發(fā)酵啟動和結(jié)束時間的影響

注：-代表發(fā)酵沒有產(chǎn)氣，下同。

2.2.3 高酸耐受性 pH值是影響酵母菌株正常生長的重要因素，當(dāng)pH值小于3時，平板內(nèi)的酵母菌不再生長；pH值為5左右時，酵母菌生長良好；當(dāng)pH值大于9時，酵母菌也不能生長[14]。從表4可以看出，釀酒酵母發(fā)酵啟動和結(jié)束時間均隨著檸檬酸質(zhì)量濃度的增加而延長。當(dāng)檸檬酸質(zhì)量濃度≤10 g/L 時，Y-2、F-3菌株總體上發(fā)酵啟動時間和結(jié)束時間早于同系列其他菌株。當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到 15 g/L 及以上時，釀酒酵母菌株F-8停止發(fā)酵。當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到20 g/L時，Y-2、Y-7能較快啟動發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束時間也較早，釀酒酵母菌株F-4在此條件下停止發(fā)酵。

表4 檸檬酸濃度對不同酵母菌株發(fā)酵啟動和結(jié)束時間的影響

2.2.4 高SO2耐受性 SO2在釀酒過程中起到重要的作用，它既可以抑制有害微生物，抗氧化，并且能加速有機(jī)酸的溶解，還有助于改善酒的風(fēng)味，有利于酒體的澄清[15]。從表5可以看出，釀酒酵母發(fā)酵啟動和結(jié)束時間均隨著SO2質(zhì)量濃度增加而延長。SO2質(zhì)量濃度為100 mg/L時，釀酒酵母都能夠啟動發(fā)酵，但啟動時間比較長；在150 mg/L 時，F(xiàn)-5、F-8菌株停止發(fā)酵；而250 mg/L SO2下，所有釀酒酵母菌株的發(fā)酵明顯受到抑制，其中菌株Y-5、F-3、F-4、F-5、F-8停止發(fā)酵。當(dāng)SO2質(zhì)量濃度為100～200 mg/L時，Y-2、F-3菌株較同系列其他菌株發(fā)酵啟動時間較早、發(fā)酵速度較快。

表5 SO2濃度對不同酵母菌株發(fā)酵啟動和結(jié)束時間的影響

綜上，對初步篩選出來的8株釀酒酵母菌株進(jìn)行4個耐受性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，菌株Y-2和F-3在400 g/L葡萄糖下能夠快速啟動發(fā)酵，同時能夠耐受酒精體積分?jǐn)?shù)16%、檸檬酸質(zhì)量濃度20 g/L、SO2質(zhì)量濃度200 mg/L。因此，可以挑選菌株Y-2和F-3作為優(yōu)良釀酒酵母菌株進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

2.3 釀酒酵母菌株發(fā)酵條件優(yōu)化

由表6可以看出，當(dāng)初始溫度25 ℃、葡萄糖質(zhì)量濃度200 g/L、pH值 4.0時，發(fā)酵后酒精度達(dá)到10.5% vol，殘?zhí)橇繛? g/L，符合果酒發(fā)酵理化指標(biāo)，發(fā)酵效果比較好。當(dāng)pH值過高或者過低時，發(fā)酵酒精度不達(dá)標(biāo)。葡萄糖質(zhì)量濃度大于250 g/L時，發(fā)酵結(jié)束后殘?zhí)橇窟^高，果酒缺乏酒香味，口感不足。發(fā)酵溫度為20 ℃時，酒精度不達(dá)標(biāo)，殘?zhí)橇窟^高，不適合釀造果酒；隨著溫度逐漸升高，蘋果酒的酒精度也逐步升高，但當(dāng)溫度升高到30 ℃時，酒精度反而開始下降，并且?guī)в挟愇?。葡萄糖初始濃度?00 g/L時，釀造的蘋果酒酒精度較高，酒香比較濃郁，酒體澄清透明；但當(dāng)初始葡萄糖質(zhì)量濃度過高時，酵母菌發(fā)酵起始時間延長，主發(fā)酵過后剩余糖較多，酒體稍差，而且口感微澀，有異味。

綜合分析，在初始溫度25 ℃、葡萄糖質(zhì)量濃度200 g/L、pH值 4.0條件下，釀造的蘋果酒質(zhì)量比較好，酒精度高，經(jīng)過濾后的蘋果酒，酒體澄清透明，沒有沉淀物質(zhì)，酒質(zhì)優(yōu)，清新爽口，具有清新的果香味和濃郁的酒味。

表6 主發(fā)酵結(jié)束后不同發(fā)酵條件下的酒精度與殘?zhí)橇?/p>

3 結(jié)論與討論

本研究從河南省本土果園土壤、果實(shí)及表皮等分離得到釀酒酵母，進(jìn)行初步篩選，得到發(fā)酵啟動時間較早、發(fā)酵速度較快、發(fā)酵氣味較好的36株菌株。進(jìn)一步對這36株釀酒酵母菌株進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，獲得發(fā)酵性能較優(yōu)的8株釀酒酵母，對這8株釀酒酵母進(jìn)行耐性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，菌株Y-2和F-3在400 g/L葡萄糖下能夠快速啟動發(fā)酵，同時耐20 g/L檸檬酸和200 mg/L SO2。工業(yè)化葡萄酒釀造過程中酒精度一般為10% vol～13% vol[16]，如果所試菌株在此酒精度范圍時均能夠持續(xù)發(fā)酵，說明其具有較好的酒精耐受能力。本研究篩選出釀酒酵母菌株Y-2和F-3具有較好的酒精耐受力，在酒精體積分?jǐn)?shù)16%時仍能快速啟動發(fā)酵。本研究對篩選出的耐受性較高的Y-2、F-3菌株進(jìn)行理化指標(biāo)和感官評定，確定其最優(yōu)發(fā)酵條件為：葡萄糖質(zhì)量濃度200 g/L、溫度25 ℃、pH值4.0。菌株Y-2和F-3發(fā)酵性能優(yōu)良可以作為釀酒的開發(fā)菌株。