外源水楊酸對高溫脅迫下牡丹幼苗耐熱性的影響

吳 莎，金曉玲,2*，張旻桓，張方靜，羅 峰

(1.中南林業(yè)科技大學(xué)，湖南 長沙 410004；2.湖南省環(huán)境資源植物開發(fā)與利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410004)

牡丹(PaeoniasuffruticosaAndr.)為芍藥科芍藥屬落葉灌木，原產(chǎn)于我國北部及中部，喜光、耐寒、喜涼爽、不耐熱，素有“花中之王”的美譽(yù)，具有極高的觀賞價(jià)值，為我國傳統(tǒng)名花。此外，牡丹根皮可入藥，有清熱涼血、活血散淤、抗菌消炎等功效，為我國傳統(tǒng)中藥[1]。近年來，隨著牡丹產(chǎn)業(yè)鏈的發(fā)展，牡丹的深加工產(chǎn)品在糧油、保健、美容、生物醫(yī)藥等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，從而使牡丹綜合利用價(jià)值得以提升，牡丹產(chǎn)業(yè)在地方經(jīng)濟(jì)中的作用日益凸顯，牡丹的栽培面積不斷擴(kuò)大[2]。但南方地區(qū)夏季的高溫天氣，使得牡丹莖葉熱害嚴(yán)重，植株提早枯萎，有機(jī)物積累有限，地下根系發(fā)育不良，最終導(dǎo)致牡丹的產(chǎn)量和品質(zhì)降低[3-4]。因此，緩解高溫對牡丹的傷害是亟待解決的問題。

水楊酸(Salicylic acid, SA)是植物體內(nèi)普遍存在的一種酚類生長調(diào)節(jié)劑，是重要的能夠激活植物過敏反應(yīng)和系統(tǒng)獲得抗性的內(nèi)源信號分子；在誘導(dǎo)植物抗病性、抗熱性、抗寒性、抗鹽性等抗性中發(fā)揮著重要的作用[5]。已有研究表明，SA能通過提高葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量和抗氧化酶活性，減少細(xì)胞膜脂過氧化作用來有效提高皖貝母[6]、西洋杜鵑[7]的耐熱性。薛建平等[8]研究表明，SA可通過保護(hù)半夏葉片光合機(jī)構(gòu)來提高其抗高溫能力。目前，國內(nèi)外關(guān)于牡丹耐熱性方面的研究較少，尤其是有關(guān)SA對高溫脅迫下牡丹耐熱性影響的研究還未見報(bào)道。因此，確認(rèn)SA對牡丹幼苗耐熱性的調(diào)控效果，找到能有效提高牡丹幼苗耐熱性的適宜SA濃度，研究SA對高溫脅迫下牡丹幼苗生長和生理的影響，探討SA提高牡丹幼苗耐熱性的機(jī)制，為緩解牡丹熱害提供理論依據(jù)和思路。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試牡丹品種為鳳丹(P.ostiiFengdan)1年生幼苗。鳳丹種子采購自湖南省邵陽縣酈家坪鎮(zhèn)鳳丹種植基地。SA為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。主要儀器：中器PQX-450HPL人工氣候箱、756P紫外可見分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司)、雷磁DDSJ-308A電導(dǎo)率儀、AR423CN電子天平(奧豪斯儀器有限公司)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2016年8月至2017年6月于中南林業(yè)科技大學(xué)內(nèi)進(jìn)行。牡丹種子經(jīng)沙藏生根發(fā)芽后，種植于7 cm×10 cm×8 cm(底直徑×上口直徑×高)規(guī)格的營養(yǎng)缽中(1苗/盆)，栽培基質(zhì)為泥炭∶蛭石∶河砂=3∶1∶1 (V∶V∶V)。幼苗置于湖南省環(huán)境資源植物開發(fā)與利用工程技術(shù)研究中心的溫室內(nèi)常規(guī)栽培管理。待幼苗復(fù)葉的3個(gè)小葉發(fā)育成熟后，選取高度和長勢一致、健康的植株用于試驗(yàn)。

本研究分為2個(gè)試驗(yàn)，試驗(yàn)1確定提高牡丹幼苗耐熱性的最適外源SA濃度。方法如下：將試驗(yàn)苗用蒸餾水沖洗3遍后移入人工氣候箱中預(yù)處理，箱內(nèi)溫度設(shè)為25 ℃/20 ℃(晝/夜)；光照強(qiáng)度為3 000 lx，光周期為14 h/10 h；濕度為80%。5 d后對上述植株葉面噴施不同濃度的SA溶液：0.1、10.0、100.0、1 000.0、10 000.0 μmol/L，以噴施蒸餾水作為對照。用于噴施的SA溶液和蒸餾水均用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7。每株噴施約10 mL，每天17：00進(jìn)行噴施，連續(xù)噴施3 d。隨后將幼苗置于40 ℃的高溫下暗脅迫2 d，濕度設(shè)為80%。為減輕高溫引起的水分脅迫傷害，高溫脅迫期間對幼苗進(jìn)行補(bǔ)水保濕。每個(gè)濃度梯度處理9株苗，3次重復(fù)。高溫脅迫后測定幼苗的熱害指數(shù)及葉片電解質(zhì)滲透率。

試驗(yàn)2是在試驗(yàn)1結(jié)果基礎(chǔ)上，探討外源SA提高牡丹幼苗耐熱性的作用機(jī)制。方法如下：將用于試驗(yàn)的牡丹幼苗預(yù)處理后，噴施蒸餾水或100.0 μmol/L SA溶液，方法同試驗(yàn)1。共設(shè)置3個(gè)試驗(yàn)組：空白對照(CK)，蒸餾水+常溫(25 ℃/20 ℃，晝/夜)；單純高溫處理(T1)：蒸餾水+高溫(40 ℃/30 ℃，晝/夜)；SA處理 (T2)：SA+高溫。每個(gè)試驗(yàn)組各處理15株苗，3次重復(fù)。3個(gè)試驗(yàn)組的光照條件、濕度均同預(yù)處理。高溫脅迫期間每天對幼苗進(jìn)行補(bǔ)水保濕。高溫脅迫6 d后，將植株移入日光溫室中恢復(fù)，溫室中溫度約為25 ℃/18 ℃(晝/夜)，自然光照，常規(guī)管理。在高溫脅迫的0、2、4、6 d及恢復(fù)7 d后(R7)，觀測幼苗熱害指數(shù)，并采取同等大小的功能葉片測定葉綠素含量、電解質(zhì)滲透率、丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD) 活性、可溶性蛋白含量、游離脯氨酸含量；此外，恢復(fù)7 d后測定幼苗的干質(zhì)量。

1.3 測定項(xiàng)目及方法

1.3.1 熱害指數(shù) 熱害指數(shù)的觀測參考張佳平等[9]的方法。熱害分級如下。0級：莖葉幾乎無熱害；1級：少于1/4的莖葉萎蔫或焦尖；2級：1/4～1/2的莖葉焦邊；3級：1/2～3/4的莖葉穿孔或枯焦；4級：3/4以上的莖葉枯焦；5級：植株枯萎或枯死。熱害指數(shù)=Σ(某級別數(shù)值×該級別的株數(shù))/(最高級數(shù)值×該品種觀察總株數(shù))×100%。其數(shù)值越小，表明植株耐熱性越強(qiáng)。

1.3.2 干質(zhì)量 將幼苗用蒸餾水快速?zèng)_洗干凈，吸干表面水分。隨后分為地上部分和根系，置于105 ℃烘箱中殺青10 min后轉(zhuǎn)至60 ℃烘干至恒質(zhì)量，用天平稱質(zhì)量。

1.3.3 生理指標(biāo) 葉綠素含量采用丙酮乙醇混合液法測定[10]。電解質(zhì)滲透率采用電導(dǎo)儀法測定；MDA含量采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法測定；SOD活性采用氮藍(lán)四唑(NBT)法測定；可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測定；游離脯氨酸含量采用茚三酮顯色法測定[11]。所有指標(biāo)測定均重復(fù)3次。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)(LSD法)，Origin Pro 9.1軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度SA對牡丹幼苗耐熱性的影響

由表1可以看出，0.1～1 000.0 μmol/L的SA處理與蒸餾水處理相比，均能顯著降低高溫脅迫后牡丹幼苗的熱害指數(shù)和葉片電解質(zhì)滲透率，其中以100.0 μmol/L SA處理效果最好。10 000.0 μmol/L SA處理使得牡丹幼苗熱害加重。

表1 不同濃度SA對高溫脅迫后牡丹幼苗熱害指數(shù)和葉片電解質(zhì)滲透率的影響

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。

2.2 SA對高溫脅迫下牡丹幼苗生長的影響

由表2可知，在單純高溫脅迫下，隨著時(shí)間的延長，牡丹幼苗熱害程度加深；恢復(fù)7 d后，部分受損程度大的植株死亡，熱害指數(shù)稍有上升。牡丹幼苗經(jīng)SA處理后，在脅迫期間植株的熱害程度明顯低于單純高溫處理，且在脅迫第2天時(shí)，植株熱害現(xiàn)象不明顯；恢復(fù)7 d后，脅迫后萎蔫的葉片、植株表現(xiàn)出恢復(fù)趨勢，熱害指數(shù)稍有下降。以上結(jié)果說明SA處理能緩解高溫對牡丹幼苗的傷害。

表2SA對高溫脅迫下牡丹幼苗熱害指數(shù)的影響%

處理處理時(shí)間/d0 2 4 6 R7 CK 00000T105.3738.2450.4353.75T200.4910.0030.6729.00

由表3可以看出，牡丹幼苗經(jīng)單純高溫處理后，莖葉、根、總干質(zhì)量均顯著低于CK，相對CK分別減少了38.10%、89.29%、67.35%。經(jīng)SA處理后，幼苗的莖葉、根、總干質(zhì)量顯著高于單純高溫處理，分別是單純高溫處理的1.31、5.67、2.19倍。以上結(jié)果說明高溫脅迫抑制牡丹幼苗干物質(zhì)的積累，而SA處理能明顯緩解高溫的抑制作用。

表3 SA對高溫脅迫后牡丹幼苗干質(zhì)量的影響 g

2.3 SA對高溫脅迫下牡丹幼苗葉片葉綠素含量的影響

由圖1可以看出，牡丹幼苗在單純高溫處理后期(≥4 d)，葉片中葉綠素含量顯著低于CK，并隨著脅迫時(shí)間的延長，下降幅度增加。SA處理后，與單純高溫處理相比，在高溫脅迫后期(≥4 d)，葉綠素含量下降幅度明顯減緩，并隨著時(shí)間的延長，減緩幅度增加，在脅迫的第4天、第6天時(shí)葉綠素含量分別是單純高溫處理的1.15、1.41倍；恢復(fù)培養(yǎng)7 d后葉片葉綠素含量稍有回升，顯著高于單純高溫處理。以上結(jié)果說明，SA能有效緩解高溫對牡丹幼苗葉片光合色素合成的抑制作用。

不同小寫字母表示不同處理間差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)，下同圖1 SA對高溫脅迫下牡丹幼苗葉片葉綠素含量的影響

2.4 SA對高溫脅迫下牡丹幼苗葉片電解質(zhì)滲透率和MDA含量的影響

由圖2可以看出，高溫脅迫下，SA處理和單純高溫處理的牡丹幼苗葉片電解質(zhì)滲透率均隨脅迫時(shí)間延長而增加。但SA處理的牡丹幼苗電解質(zhì)滲透率在脅迫第2、4、6天時(shí)均顯著低于單純高溫處理，相對單純高溫處理分別減少了33.07%、31.50%、33.79%，且脅迫第2天時(shí)與CK無顯著差異。恢復(fù)正常條件培養(yǎng)7 d后，SA處理仍顯著低于單純高溫處理，但二者均顯著高于CK。以上結(jié)果說明，SA處理能有效減輕高溫脅迫下牡丹幼苗電解質(zhì)的滲出。

圖2 SA對高溫脅迫下牡丹幼苗葉片電解質(zhì)滲透率的影響

由圖3可以看出，高溫脅迫下，SA處理和單純高溫處理的牡丹幼苗葉片MDA含量均隨脅迫時(shí)間的延長而增加。但SA處理與單純高溫處理相比，MDA含量上升趨勢明顯減緩，在脅迫第2、4、6天時(shí)均顯著低于單純高溫處理，相對單純高溫處理分別減少了23.84%、35.23%、32.84%。SA處理在脅迫第2天和第4天時(shí)MDA含量與CK無顯著差異?；謴?fù)7 d后，SA處理的牡丹幼苗MDA含量恢復(fù)到正常水平，顯著低于單純高溫處理。說明SA有助于緩解高溫脅迫下MDA的積累，從而降低高溫對細(xì)胞膜的過氧化傷害。

圖3 SA對高溫脅迫下牡丹幼苗葉片MDA含量的影響

2.5 SA對高溫脅迫下牡丹幼苗葉片SOD活性的影響

由圖4可以看出，牡丹幼苗在單純高溫處理下，葉片SOD活性變化呈先降后升再降的趨勢。在脅迫的第2天、第6天時(shí)，葉片SOD活性顯著低于對照，在脅迫第4天SOD活性達(dá)到最大值，與對照相比未有顯著差異。牡丹幼苗經(jīng)SA處理后，在脅迫的第2天、第6天，葉片SOD活性顯著高于單純高溫處理，相對單純高溫處理分別增加了59.02%、118.65%；在脅迫第4天，葉片SOD活性高于單純高溫處理，但差異不顯著；恢復(fù)7 d后，SA處理的牡丹幼苗SOD活性回升，達(dá)到對照水平，顯著高于單純高溫處理。說明在高溫脅迫下，SA有助于牡丹幼苗維持較高的SOD活性，減少活性氧對細(xì)胞的傷害。

圖4 SA對高溫脅迫下牡丹幼苗葉片SOD活性的影響

2.6 SA對高溫脅迫下牡丹幼苗葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

由圖5可以看出，高溫脅迫過程中，SA處理和單純高溫處理的牡丹幼苗葉片可溶性蛋白含量均隨脅迫時(shí)間的延長而增加。但SA處理的植株可溶性蛋白含量顯著高于單純高溫處理，在第2、4、6天相對單純高溫處理分別增加了33.57%、17.55%、19.17%；正常條件培養(yǎng)7 d后，SA處理和單純高溫處理的牡丹幼苗可溶性蛋白含量有所回落，但SA處理仍顯著高于單純高溫處理。

由圖6可以看出，高溫脅迫過程中，SA處理和單純高溫處理的牡丹幼苗葉片游離脯氨酸含量均隨脅迫時(shí)間的延長而增加。但SA處理的牡丹幼苗游離脯氨酸含量在脅迫后期(≥4 d)顯著高于單純高溫處理，且隨時(shí)間的延長增加幅度加大；在脅迫第4天、第6天較單純高溫處理分別增加了22.92%、44.96%?；謴?fù)7 d后，SA處理的牡丹幼苗游離脯氨酸含量仍顯著高于單純高溫處理。說明SA有助于提高高溫脅迫下可溶性蛋白含量和游離脯氨酸含量，從而降低細(xì)胞滲透勢，提高牡丹幼苗耐熱性。

圖5 SA對高溫脅迫下牡丹幼苗葉片可溶性蛋白含量的影響

圖6 SA對高溫脅迫下牡丹幼苗葉片游離脯氨酸含量的影響

3 結(jié)論與討論

SA提高植物耐熱性的有效濃度隨試驗(yàn)設(shè)計(jì)的不同而不同。本研究中，SA濃度在0.1～1 000.0 μmol/L時(shí)均有提高牡丹幼苗耐熱性的效果，其中以100.0 μmol/L的SA處理效果最好。這與在水稻[12]和葡萄[13]上的研究結(jié)果一致。但申惠翡等[7]的研究結(jié)果則表明，有效提高西洋杜鵑耐熱性的SA濃度相對較低，為0.05 μmol/L。由此推測，有效提高植物耐熱性的SA濃度與植物種類及苗齡相關(guān)。

幼苗時(shí)期是植物生長的關(guān)鍵階段，幼苗時(shí)期的生長情況影響植株后期的生長發(fā)育，進(jìn)而影響產(chǎn)量和品質(zhì)。外源施用SA能夠影響植物的多種生理過程，包括幼苗生長、脅迫響應(yīng)等[5]。Kumar等[14]在小麥上的研究表明，SA能增加高溫脅迫后小麥幼苗的葉鮮質(zhì)量。Shi等[15]在黃瓜上的研究發(fā)現(xiàn)，SA能使錳脅迫后黃瓜幼苗的根系干質(zhì)量增加。本研究表明，高溫脅迫使得牡丹幼苗的生長受到抑制，莖葉、根、總干質(zhì)量均顯著低于正常生長的幼苗。而100.0 μmol/L SA溶液處理能有效緩解高溫抑制作用，促進(jìn)牡丹幼苗干物質(zhì)的積累。這可能與SA能調(diào)節(jié)植物葉綠素合成，提高光合效率有關(guān)[5]。本試驗(yàn)中對葉綠素的測定結(jié)果也證實(shí)了這種可能性。

高溫脅迫下，植物細(xì)胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生和清除的動(dòng)態(tài)平衡遭到破壞，過量產(chǎn)生的活性氧引發(fā)膜脂過氧化作用，對植物造成傷害。MDA是膜脂過氧化產(chǎn)物之一，隨著膜傷害的發(fā)生，膜內(nèi)的可溶性物質(zhì)、電解質(zhì)大量滲漏。前人研究表明，MDA含量和電解質(zhì)滲透率是鑒定牡丹耐熱性的可靠指標(biāo)[16]。本研究表明，在整個(gè)高溫脅迫期間，SA處理的植株電解質(zhì)滲透率和MDA含量均顯著低于單純高溫處理。說明SA能減緩牡丹幼苗電解質(zhì)的滲出，減少膜脂過氧化作用，這與李同根等[6]的研究結(jié)果一致。

SOD是抗氧化酶系統(tǒng)的核心酶[17]。一般情況下，SOD活性隨高溫脅迫時(shí)間的延長呈先上升后下降的趨勢[13]。徐艷等[16]認(rèn)為SOD活性可作為鑒定牡丹耐熱性的指標(biāo)。本研究表明，高溫脅迫下，牡丹幼苗葉片中SOD活性變化無穩(wěn)定規(guī)律，這與前人對高溫脅迫下芍藥SOD活性變化趨勢的研究結(jié)果一致[9]。因此，SOD能否作為評價(jià)牡丹耐熱性的可靠指標(biāo)還有待進(jìn)一步研究。牡丹幼苗經(jīng)SA處理后，SOD活性呈先上升后下降的趨勢，且高于單純高溫處理，說明在高溫條件下SA有助于維持較高的SOD活性，這與Gunce等[18]對洋地黃的研究結(jié)果一致。

滲透調(diào)節(jié)是植物抗逆境脅迫的一種重要方式，而可溶性蛋白和游離脯氨酸是重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)?？扇苄缘鞍拙哂斜Ｗo(hù)酶活性的作用，游離脯氨酸具有清除活性氧、防止細(xì)胞脫水及解除氨毒害等作用[19]。本研究表明，高溫脅迫下SA處理的植株可溶性蛋白含量顯著高于單純高溫處理，這與何亞麗等[20]的研究結(jié)果一致。這可能與高溫下SA促進(jìn)細(xì)胞中熱激蛋白的合成有關(guān)，而大量熱激蛋白富集在膜組分中，有可能擔(dān)當(dāng)了阻止膜蛋白變性和防止生物膜熱破碎的功能[17]。本試驗(yàn)中對電解質(zhì)滲透率的測定結(jié)果也證實(shí)了這種可能性。但關(guān)于高溫脅迫下植物葉片可溶性蛋白含量的變化趨勢仍存在爭議[9, 21]。相關(guān)研究表明，SA處理能提高高溫脅迫下葡萄[22]、桔梗[23]等植物的游離脯氨酸含量。本研究結(jié)果表明，高溫脅迫后期(≥4 d)SA處理的植株游離脯氨酸含量顯著高于單純高溫處理，證實(shí)高溫脅迫下SA可以促進(jìn)游離脯氨酸的積累和大量合成，有助于降低細(xì)胞滲透勢，提高植株耐熱性。

綜上所述，外源SA通過提高高溫脅迫下牡丹幼苗葉片葉綠素含量，降低細(xì)胞質(zhì)膜透性，減少膜脂過氧化作用，提高抗氧化酶活性和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量，從而提高牡丹幼苗耐熱性，緩解高溫傷害，增加幼苗干物質(zhì)的積累。在今后的研究中還應(yīng)開展大量田間試驗(yàn)，深入探討在大田條件下SA對牡丹耐熱性提高的效果及相應(yīng)的施用周期和施用量，從而有助于生產(chǎn)上的應(yīng)用推廣，有利于南方地區(qū)牡丹品質(zhì)和產(chǎn)量的提高。