劉 陽,張新穎,耿萬友,毛景東,杜立銀*
(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010; 2.內(nèi)蒙古民族大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,內(nèi)蒙古 通遼 028042)
蒙古牛是我國畜禽遺傳資源保護(hù)的地方黃牛,是我國北方地區(qū)黃牛改良的主要母系之一,屬于國家戰(zhàn)略性生物資源。但由于圍產(chǎn)期免疫抑制疾病如奶牛產(chǎn)后子宮炎、乳房炎等導(dǎo)致農(nóng)牧區(qū)蒙古牛存欄量銳減,個(gè)別地區(qū)甚至出現(xiàn)種群消失的現(xiàn)象[1]。而作為機(jī)體免疫的第一道防線的中性粒細(xì)胞(Polymorphonuclear neutrophils,PMNs),其數(shù)量、功能的改變均會(huì)對(duì)動(dòng)物機(jī)體的免疫功能起到至關(guān)重要的作用。細(xì)胞凋亡又稱程序性細(xì)胞死亡,被廣泛認(rèn)為是調(diào)控圍產(chǎn)期 PMNs數(shù)量的一種重要途徑。參與調(diào)控細(xì)胞凋亡的基因主要有促細(xì)胞凋亡基因(主要包括Bax、P53、Cyt-c、caspases)和抗細(xì)胞凋亡基因,如Bcl-2。細(xì)胞凋亡通過上調(diào)或下調(diào)Bax、Cyt-c、P53和Bcl-2等基因的表達(dá),從而調(diào)節(jié)PMNs數(shù)量,以達(dá)到維持機(jī)體免疫狀態(tài)的目的。其中,Bcl-2與Bax表達(dá)量的比值對(duì)細(xì)胞凋亡具有決定作用[2]。Bcl-2基因可通過穩(wěn)定線粒體結(jié)構(gòu)而阻止線粒體釋放Cyt-c,Bax基因則會(huì)破壞線粒體膜的穩(wěn)定性。P53基因可通過激活其他促凋亡基因轉(zhuǎn)錄的方式來啟動(dòng)細(xì)胞凋亡,其表達(dá)量與細(xì)胞凋亡率呈正相關(guān)[3]。研究證實(shí),細(xì)胞內(nèi)凋亡信號(hào)能夠直接促進(jìn)或抑制細(xì)胞因子Fas(Fatty acid synthase)觸發(fā)PMNs凋亡[4],而Cyt-c基因在觸發(fā)PMNs凋亡和驅(qū)動(dòng)PMNs老化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中有顯著作用[5]。此外,圍產(chǎn)期免疫抑制的發(fā)生與體內(nèi)雌二醇(主要為17β-雌二醇,E2)、糖皮質(zhì)激素(Glucocorticoid,GC)和孕酮(Progesterone,P4)濃度及其受體活性的改變密切相關(guān),顯著影響PMNs等免疫細(xì)胞的分布及功能變化。蒙古牛為古老地方黃牛品種,目前,關(guān)于其圍產(chǎn)期外周PMNs凋亡相關(guān)基因的研究尚無報(bào)道。為此,研究圍產(chǎn)期蒙古牛外周PMNs凋亡基因的表達(dá)情況,以揭示蒙古牛圍產(chǎn)期免疫抑制下外周PMNs的免疫狀態(tài),從而為評(píng)價(jià)PMNs免疫抑制特征及機(jī)制提供理論參考。
主要試劑有Percoll細(xì)胞分離液(Pharmacia公司),Trizol試劑(Invitrogen公司),AMV反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TaqDNA聚合酶(KR公司),Bradford蛋白質(zhì)定量試劑盒(北京天根生物科技公司),Tubulin抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗兔IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)公司),Bcl-2抗體、Bax抗體、Cyt-c抗體(武漢博士德生物工程公司),P53抗體(碧云天生物科技研究所),DL2000 DNA Marker、蛋白質(zhì)預(yù)染Marker(北京天根生物科技公司),RIPA裂解液、DAB辣根過氧化物酶顯色試劑盒(碧云天生物科技研究所)。
主要儀器有Gene AMP PCR System 2700(Applied Bio system公司),TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī)(湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司),TGL-16M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司), JY-92-2D型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司),W-CJ-2FD潔凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司),DYY-12C型電泳儀、DYY-7C型電泳儀(北京六一公司),UV-3C紫外透射分析儀、凝膠成像分析系統(tǒng)(珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器公司),MDF-U2086S超低溫冰箱(SANYO公司),核酸-蛋白測定儀(Biophotometer)(德國Eppendorf公司),YS100顯微鏡(Nikon公司),M200酶標(biāo)儀(TECAN公司)。
選擇3頭2~3胎次妊娠蒙古牛,分別于分娩前22、18、14、10、8、6、4、2 d,分娩當(dāng)天和產(chǎn)后2、4、6、8、10、14 d頸靜脈采血50 mL,用于PMNs分離。分娩前采血時(shí)間標(biāo)記“-”,分娩當(dāng)天記作“0”。
1.2.1 PMNs的分離、計(jì)數(shù) 采用Bhatnagar等[6]、Stillie等[7]報(bào)道的Percoll分離液法。Percoll分離液質(zhì)量濃度為1.084 g/mL,按上述分離方法,得到紅細(xì)胞與PMNs混合沉淀層,再用RIPA裂解液裂解細(xì)胞2~3次,即可分離出PMNs白色沉淀,加入適量RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液,盡量洗盡殘留的紅色液體。采用臺(tái)盼藍(lán)拒染法鑒定細(xì)胞活力,經(jīng)檢驗(yàn)細(xì)胞活力若達(dá)97%以上,則可以進(jìn)行計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。將PMNs沉淀按每管6×106~8×106個(gè)細(xì)胞分裝凍存于-80 ℃。
1.2.2 血清中類固醇激素濃度的檢測 試驗(yàn)采用放射免疫法(Radioimmunoassay,RIA)分析外周血血清中GC、E2和P4濃度變化。具體操作步驟如下:首先,稀釋GC、E2 和P4標(biāo)準(zhǔn)品,溶解15 min搖勻后方可使用。溶解兔抗GC、E2 和P4抗體,其他組成成分充分混勻后可直接使用。然后取圓底聚苯乙烯試管若干,將待測樣品管編號(hào),用微量加樣器加樣,充分搖勻后,室溫放置15 min,1 500×g離心15 min,棄上清,測各沉淀管的放射性計(jì)數(shù)(cpm),計(jì)算結(jié)果并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
1.2.3 外周血各型白細(xì)胞動(dòng)態(tài)變化檢測 將外周抗凝血輕輕上下顛倒混勻,取1 mL利用全自動(dòng)動(dòng)物血液細(xì)胞分析儀檢測不同時(shí)間外周血PMNs、單核細(xì)胞(Mononuclear cell,MC)數(shù)和淋巴細(xì)胞數(shù)的變化。
1.2.4 RT-PCR檢測PMNs凋亡相關(guān)基因mRNA表達(dá)量 將PMNs凍存樣品在室溫進(jìn)行融化,而后在小型振蕩器上振蕩30 s,直到完全解離出PMNs核蛋白復(fù)合物。然后依照Sigma RNA提取試劑盒說明書進(jìn)行總RNA 的提取。吸取3 μL RNA溶液,利用核酸濃度微量測定儀,檢測RNA濃度及其OD值,OD260/OD280≥1.9、OD260/OD230≥2.0 的RNA,純度符合要求,可用于反轉(zhuǎn)錄。
根據(jù)GenBank中牛源凋亡相關(guān)基因(Bax、P53、Cyt-c、Bcl-2)序列,運(yùn)用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物,引物序列見表1。合成cDNA第一條鏈后進(jìn)行PCR反應(yīng),反應(yīng)體系:10×PCR Buffer 2.0 μL,cDNA 1 μL,dNTP 0.5 μL,上、下游引物各0.5 μL,TaqDNA聚合酶0.2 μL,加ddH2O至20 μL。PCR反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 30 s,合適溫度退火30 s,72 ℃ 30 s,30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳,用Quantity One對(duì)凋亡相關(guān)基因mRNA和內(nèi)參基因Tubulin條帶進(jìn)行灰度掃描,計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。
表1 牛源凋亡基因的PCR引物信息
1.2.5 Western blotting檢測PMNs凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)量 在4 ℃條件下,解凍PMNs,14 000 ×g離心2 min棄上清,加入RIPA裂解液,充分振蕩,14 000×g離心10 min,取上清用Bradford法測定蛋白質(zhì)濃度;然后用2×SDS樣品緩沖液按1∶1混合煮沸變性,10% SDS-PAGE凝膠電泳;轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上,TBST緩沖液漂洗3 次,每次5~10 min,將PVDF膜置5%脫脂奶中室溫封閉3 h后取出,TBST漂洗3次,每次10 min,與P53、Bax、Cyt-c、Bcl-2和Tubulin(對(duì)照)蛋白一抗孵育(1∶500)(4 ℃過夜),PVDF膜經(jīng)TBST漂洗3次,每次10 min;與HRP標(biāo)記的IgG(1∶1 000)室溫孵育2 h,經(jīng)TBST漂洗、DAB顯色,觀察拍照,用Glyko Bandcan 5.0軟件分析。
采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理,利用單因素方差分析(One-way ANOVA)、LSD法比較差異顯著性。
外周血輕輕置于分離液液面上,離心后取出白色層即下數(shù)第3層,經(jīng)瑞氏染色鏡檢鑒定為PMNs,核呈深染的彎曲桿狀(馬蹄鐵形)或分葉狀,葉間有纖細(xì)的縮窄部相連。
2.2.1 PMNs和MC總數(shù) 由圖1可知,蒙古牛分娩前22~10 d PMNs和MC總數(shù)逐漸升高,分娩前10 d達(dá)到峰值,分娩前10~0 d逐漸下降,分娩后又逐漸升高。這說明伴隨分娩臨近,PMNs和MC免疫抑制作用逐漸減弱,分娩當(dāng)天細(xì)胞數(shù)量降至最低,免疫抑制作用最弱,分娩后又逐漸增強(qiáng)。
圖1 圍產(chǎn)期蒙古牛外周血中PMNs和MC總數(shù)
2.2.2 淋巴細(xì)胞總數(shù) 由圖2可知,蒙古牛分娩前8~0 d淋巴細(xì)胞總數(shù)逐漸下降,0 d降至最低,分娩后2 d明顯升高,分娩前22~8 d、分娩后2~14 d變化不明顯。這說明隨著分娩臨近,淋巴細(xì)胞免疫抑制作用顯著減弱,0 d達(dá)到最低,產(chǎn)后淋巴細(xì)胞數(shù)量逐漸增多,機(jī)體免疫作用增強(qiáng)。
圖2 圍產(chǎn)期蒙古牛外周血中淋巴細(xì)胞總數(shù)
2.2.3 E2質(zhì)量濃度 由圖3可知,蒙古牛分娩前22~2 d E2質(zhì)量濃度明顯升高,并在分娩前2 d達(dá)到峰值,分娩前2~0 d明顯下降,分娩后2~14 d變化趨勢相對(duì)平緩。這表明隨著分娩逐漸臨近,E2活性明顯升高,而分娩時(shí)活性明顯下降,分娩后2 d活性降至基礎(chǔ)水平,之后無明顯變化。
圖3 圍產(chǎn)期蒙古牛外周血清中E2質(zhì)量濃度
2.2.4 P4質(zhì)量濃度 由圖4可知,蒙古牛分娩前22 d至分娩后2 d P4質(zhì)量濃度逐漸下降,分娩后2~14 d無明顯變化。這表明,隨著分娩臨近,P4活性逐漸下降,分娩當(dāng)天活性降低最明顯,分娩后2 d達(dá)到正常生理活性,之后無明顯變化。
圖4 圍產(chǎn)期蒙古牛外周血清中P4質(zhì)量濃度
2.2.5 GC質(zhì)量濃度 由圖5可知,蒙古牛分娩前8~0 d GC質(zhì)量濃度逐漸升高,0 d達(dá)到峰值,分娩后0~2 d迅速下降,分娩后2 d之后無明顯變化。這表明隨著分娩臨近,GC活性逐漸升高,分娩當(dāng)天活性最強(qiáng),分娩后2 d降低至正常生理水平,之后變化不明顯。
圖5 圍產(chǎn)期蒙古牛外周血清中GC質(zhì)量濃度
2.3.1Bax基因 由圖6可知,蒙古牛分娩前22~0 dBax基因mRNA表達(dá)量逐漸下降,分娩當(dāng)天降至最低,分娩后0~14 d逐漸升高。這表明隨著分娩臨近,Bax基因表達(dá)抑制作用顯著增強(qiáng),分娩當(dāng)天最明顯,產(chǎn)后表達(dá)量逐漸升高。
圖6 Bax基因相對(duì)表達(dá)量
2.3.2Bcl-2基因 由圖7可知,蒙古牛分娩前22~0 dBcl-2 mRNA表達(dá)量逐漸上升,分娩當(dāng)天升至最高,分娩后0~14 d逐漸降低。這表明,隨著分娩的臨近,Bcl-2基因表達(dá)抑制作用逐漸減弱,分娩當(dāng)天作用最明顯,分娩后抑制作用逐漸增強(qiáng),表達(dá)量逐漸下降。
圖7 Bcl-2基因相對(duì)表達(dá)量
2.3.3P53基因P53 mRNA表達(dá)量總體的變化趨勢如圖8,蒙古牛分娩前22~0 dP53 mRNA表達(dá)量逐漸下降,分娩當(dāng)天降至最低,分娩后0~14 d逐漸升高。其中,分娩后0~8 dP53 mRNA表達(dá)量逐漸升高,8~14 d升高趨勢相對(duì)平緩,無明顯差異;與分娩后8、10、14 d相比,分娩前22、18、14、10 dP53表達(dá)量較高,即產(chǎn)前表達(dá)量明顯高于產(chǎn)后。這說明隨著分娩臨近,P53基因表達(dá)抑制作用逐漸增強(qiáng),分娩時(shí)最明顯,產(chǎn)后抑制作用逐漸消除,表達(dá)量逐漸升高。
圖8 P53基因相對(duì)表達(dá)量
2.3.4Cyt-c基因 由圖9可知,蒙古牛分娩前22~0 dCyt-cmRNA表達(dá)量逐漸下降,并呈現(xiàn)一定的時(shí)間依賴性,分娩當(dāng)天降至最低,分娩后0~14 d逐漸升高。這表明隨著分娩臨近,Cyt-c基因表達(dá)抑制作用明顯增強(qiáng),分娩當(dāng)天最明顯,分娩后表達(dá)抑制作用逐漸解除,表達(dá)量逐漸升高。
圖9 Cyt-c基因相對(duì)表達(dá)量
PMNs凋亡相關(guān)蛋白P53、Bax、Cyt-c、Bcl-2的相對(duì)表達(dá)量及變化趨勢如圖10。對(duì)目的條帶進(jìn)行灰度分析,結(jié)果如圖11—14。由圖10和11可知,Bax蛋白表達(dá)趨勢與BaxmRNA基本一致。分娩前Bax蛋白表達(dá)量呈現(xiàn)下降趨勢,分娩后明顯升高。這表明隨著分娩的臨近,機(jī)體啟動(dòng)分娩過程,明顯抑制了Bax蛋白的表達(dá),分娩當(dāng)天抑制作用最明顯,分娩后隨著抑制作用的解除表達(dá)量逐漸升高。
1—15:妊娠蒙古牛分娩前22、18、14、10、8、6、4、2 d及分娩當(dāng)天及產(chǎn)后2、4、6、8、10、14 d圖10 PMNs凋亡相關(guān)蛋白的Western blot 檢測結(jié)果
圖11 Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量
由圖10和12可知,Bcl-2蛋白表達(dá)變化趨勢與Bcl-2 mRNA基本一致。分娩前Bcl-2蛋白表達(dá)量明顯上升,分娩后呈現(xiàn)下降趨勢。這說明隨著分娩臨近,Bcl-2蛋白表達(dá)抑制作用逐漸解除,分娩當(dāng)天最明顯,分娩后抑制作用逐漸增強(qiáng),表達(dá)量下降。
圖12 Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量
由圖10和13可知,Cyt-c蛋白表達(dá)變化趨勢與Cyt-cmRNA基本一致。分娩前6~0 d Cyt-c蛋白表達(dá)量較分娩前22~6 d明顯下降,分娩后0~6 d較6~14 d明顯上升。這表明隨著分娩臨近,Cyt-c蛋白表達(dá)抑制作用逐漸增強(qiáng),分娩當(dāng)天最明顯,產(chǎn)后隨著抑制作用的逐漸解除,表達(dá)量逐漸升高。
圖13 Cyt-c蛋白相對(duì)表達(dá)量
由圖10和14可知, P53蛋白表達(dá)變化趨勢與P53 mRNA基本一致。分娩前P53蛋白表達(dá)量呈下調(diào)趨勢,分娩后表達(dá)抑制作用解除,表達(dá)量逐漸升高。
圖14 P53蛋白相對(duì)表達(dá)量
圍產(chǎn)期是牛繁殖障礙性疾病的高發(fā)期,其免疫抑制主要表現(xiàn)為外周血免疫細(xì)胞分布、數(shù)量及功能的改變,尤其是PMNs的顯著增加及其功能性基因表達(dá)的上調(diào)或下調(diào),從而誘發(fā)多種疾病[8]。外周血中PMNs的生命周期一般為6~8 h,隨即發(fā)生細(xì)胞凋亡或遷移至組織、器官參與炎性反應(yīng),但是當(dāng)?shù)竭_(dá)炎癥部位參與炎癥反應(yīng)時(shí),PMNs的生命周期將延長2~4倍[9]。因此,認(rèn)為外周血PMNs的分布和功能變化與細(xì)胞凋亡密切相關(guān),即促進(jìn)細(xì)胞凋亡利于維持免疫系統(tǒng)穩(wěn)定,反之抑制細(xì)胞凋亡可致免疫抑制[1]。Bax、P53、Cyt-c等促細(xì)胞凋亡基因以及Bcl-2等抗細(xì)胞凋亡基因是參與細(xì)胞凋亡調(diào)控的兩大類主要基因。本試驗(yàn)結(jié)果表明,圍產(chǎn)期蒙古牛外周PMNs的Bcl-2 mRNA和蛋白表達(dá)量均以分娩當(dāng)天為拐點(diǎn)先升后降,分娩前22 d和分娩后14 d明顯低于0 d;Bax、P53和Cyt-cmRNA和蛋白表達(dá)趨勢與Bcl-2相反。表明整個(gè)圍產(chǎn)期外周PMNs免疫活性經(jīng)歷了以分娩為節(jié)點(diǎn)的抑制加劇與減緩過程。
此外,大量試驗(yàn)證實(shí)了圍產(chǎn)期免疫抑制、細(xì)胞功能與外周血主要類固醇激素P4、E2和GC質(zhì)量濃度的變化密切相關(guān)[10-12]。本研究結(jié)果表明,外周血血清E2質(zhì)量濃度于分娩前22 d逐漸升高,分娩前2 d升至最高;P4質(zhì)量濃度于分娩前22 d開始逐漸下降,分娩當(dāng)天迅速下降;GC質(zhì)量濃度于分娩前22 d逐漸升高,分娩當(dāng)天升至最高。GC刺激T細(xì)胞和B細(xì)胞的增殖、抑制相關(guān)因子的產(chǎn)生[11],使產(chǎn)后牛外周PMNs的氧化狀態(tài)發(fā)生改變;E2通過Bcl-2家族成員誘發(fā)外周淋巴細(xì)胞凋亡、促進(jìn)巨噬細(xì)胞炎性介導(dǎo)因子和細(xì)胞因子的產(chǎn)生;而P4能夠直接抑制T淋巴細(xì)胞促炎性因子的產(chǎn)生[6,12-14]。同時(shí),E2、P4和GC依賴其特異性受體雙向調(diào)節(jié)PMNs活性,即低濃度時(shí)增強(qiáng)細(xì)胞活性而高濃度則抑制細(xì)胞活性。外周血PMNs和MC總數(shù)從分娩前22 d開始逐漸增多,分娩前10 d達(dá)最大值,而淋巴細(xì)胞數(shù)量在此期間并未出現(xiàn)明顯變化,這可能提示了PMNs的增多明顯抑制了淋巴細(xì)胞的增殖分化,致使機(jī)體出現(xiàn)免疫抑制,導(dǎo)致免疫應(yīng)答反應(yīng)相關(guān)分子表達(dá)發(fā)生明顯變化。同時(shí),圍產(chǎn)期類固醇激素及激素間相互作用,共同調(diào)控凋亡相關(guān)基因的表達(dá),例如P4可抑制Bax表達(dá),上調(diào)Bcl-2表達(dá);GC降低BaxmRNA豐度[10]。本試驗(yàn)中促/抗細(xì)胞凋亡基因Bax/Bcl-2下調(diào)/上調(diào)趨勢與類固醇激素質(zhì)量濃度變化趨勢基本一致。
本試驗(yàn)探究了類固醇激素水平和凋亡因子表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化特征,以及PMNs凋亡相關(guān)基因表達(dá)調(diào)控之間的關(guān)系,對(duì)臨床應(yīng)用及科學(xué)研究具有一定的指導(dǎo)意義。需要指出的,為了進(jìn)一步闡明圍產(chǎn)蒙古牛外周類固醇激素-受體表達(dá)與PMNs動(dòng)態(tài)變化及相關(guān)分子表達(dá)的關(guān)系,本課題組正在開展PMNs類固醇激素核/膜受體及CD11b等信號(hào)分子表達(dá)研究,找到直接證據(jù)以支持本研究結(jié)果,也為闡明圍產(chǎn)牛機(jī)體免疫狀態(tài)及相關(guān)分子表達(dá)信號(hào)通路提供依據(jù)。