圍產(chǎn)期蒙古牛外周中性粒細胞凋亡相關(guān)基因的表達分析

劉 陽，張新穎，耿萬友，毛景東，杜立銀*

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學 獸醫(yī)學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010； 2.內(nèi)蒙古民族大學 動物科學技術(shù)學院，內(nèi)蒙古 通遼 028042)

蒙古牛是我國畜禽遺傳資源保護的地方黃牛，是我國北方地區(qū)黃牛改良的主要母系之一，屬于國家戰(zhàn)略性生物資源。但由于圍產(chǎn)期免疫抑制疾病如奶牛產(chǎn)后子宮炎、乳房炎等導致農(nóng)牧區(qū)蒙古牛存欄量銳減，個別地區(qū)甚至出現(xiàn)種群消失的現(xiàn)象[1]。而作為機體免疫的第一道防線的中性粒細胞(Polymorphonuclear neutrophils，PMNs)，其數(shù)量、功能的改變均會對動物機體的免疫功能起到至關(guān)重要的作用。細胞凋亡又稱程序性細胞死亡，被廣泛認為是調(diào)控圍產(chǎn)期 PMNs數(shù)量的一種重要途徑。參與調(diào)控細胞凋亡的基因主要有促細胞凋亡基因(主要包括Bax、P53、Cyt-c、caspases)和抗細胞凋亡基因，如Bcl-2。細胞凋亡通過上調(diào)或下調(diào)Bax、Cyt-c、P53和Bcl-2等基因的表達，從而調(diào)節(jié)PMNs數(shù)量，以達到維持機體免疫狀態(tài)的目的。其中，Bcl-2與Bax表達量的比值對細胞凋亡具有決定作用[2]。Bcl-2基因可通過穩(wěn)定線粒體結(jié)構(gòu)而阻止線粒體釋放Cyt-c，Bax基因則會破壞線粒體膜的穩(wěn)定性。P53基因可通過激活其他促凋亡基因轉(zhuǎn)錄的方式來啟動細胞凋亡，其表達量與細胞凋亡率呈正相關(guān)[3]。研究證實，細胞內(nèi)凋亡信號能夠直接促進或抑制細胞因子Fas(Fatty acid synthase)觸發(fā)PMNs凋亡[4]，而Cyt-c基因在觸發(fā)PMNs凋亡和驅(qū)動PMNs老化的信號轉(zhuǎn)導中有顯著作用[5]。此外，圍產(chǎn)期免疫抑制的發(fā)生與體內(nèi)雌二醇(主要為17β-雌二醇，E2)、糖皮質(zhì)激素(Glucocorticoid，GC)和孕酮(Progesterone，P4)濃度及其受體活性的改變密切相關(guān)，顯著影響PMNs等免疫細胞的分布及功能變化。蒙古牛為古老地方黃牛品種，目前，關(guān)于其圍產(chǎn)期外周PMNs凋亡相關(guān)基因的研究尚無報道。為此，研究圍產(chǎn)期蒙古牛外周PMNs凋亡基因的表達情況，以揭示蒙古牛圍產(chǎn)期免疫抑制下外周PMNs的免疫狀態(tài)，從而為評價PMNs免疫抑制特征及機制提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

主要試劑有Percoll細胞分離液(Pharmacia公司)，Trizol試劑(Invitrogen公司)，AMV反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TaqDNA聚合酶(KR公司),Bradford蛋白質(zhì)定量試劑盒(北京天根生物科技公司)，Tubulin抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標記羊抗兔IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)公司)，Bcl-2抗體、Bax抗體、Cyt-c抗體(武漢博士德生物工程公司)，P53抗體(碧云天生物科技研究所)，DL2000 DNA Marker、蛋白質(zhì)預染Marker(北京天根生物科技公司)，RIPA裂解液、DAB辣根過氧化物酶顯色試劑盒(碧云天生物科技研究所)。

主要儀器有Gene AMP PCR System 2700(Applied Bio system公司)，TG16-WS臺式高速離心機(湖南湘儀離心機儀器有限公司)，TGL-16M臺式高速冷凍離心機(湖南湘儀離心機儀器有限公司)， JY-92-2D型超聲波細胞粉碎機(寧波新芝生物科技股份有限公司)，W-CJ-2FD潔凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)，DYY-12C型電泳儀、DYY-7C型電泳儀(北京六一公司)，UV-3C紫外透射分析儀、凝膠成像分析系統(tǒng)(珠海黑馬醫(yī)學儀器公司)，MDF-U2086S超低溫冰箱(SANYO公司)，核酸-蛋白測定儀(Biophotometer)(德國Eppendorf公司)，YS100顯微鏡(Nikon公司)，M200酶標儀(TECAN公司)。

選擇3頭2～3胎次妊娠蒙古牛，分別于分娩前22、18、14、10、8、6、4、2 d，分娩當天和產(chǎn)后2、4、6、8、10、14 d頸靜脈采血50 mL，用于PMNs分離。分娩前采血時間標記“-”，分娩當天記作“0”。

1.2 試驗方法

1.2.1 PMNs的分離、計數(shù) 采用Bhatnagar等[6]、Stillie等[7]報道的Percoll分離液法。Percoll分離液質(zhì)量濃度為1.084 g/mL，按上述分離方法，得到紅細胞與PMNs混合沉淀層，再用RIPA裂解液裂解細胞2～3次，即可分離出PMNs白色沉淀，加入適量RPMI 1640細胞培養(yǎng)液，盡量洗盡殘留的紅色液體。采用臺盼藍拒染法鑒定細胞活力，經(jīng)檢驗細胞活力若達97%以上，則可以進行計數(shù)板計數(shù)。將PMNs沉淀按每管6×106～8×106個細胞分裝凍存于-80 ℃。

1.2.2 血清中類固醇激素濃度的檢測 試驗采用放射免疫法(Radioimmunoassay，RIA)分析外周血血清中GC、E2和P4濃度變化。具體操作步驟如下：首先，稀釋GC、E2 和P4標準品，溶解15 min搖勻后方可使用。溶解兔抗GC、E2 和P4抗體，其他組成成分充分混勻后可直接使用。然后取圓底聚苯乙烯試管若干，將待測樣品管編號，用微量加樣器加樣，充分搖勻后，室溫放置15 min，1 500×g離心15 min，棄上清，測各沉淀管的放射性計數(shù)(cpm)，計算結(jié)果并進行統(tǒng)計分析。

1.2.3 外周血各型白細胞動態(tài)變化檢測 將外周抗凝血輕輕上下顛倒混勻，取1 mL利用全自動動物血液細胞分析儀檢測不同時間外周血PMNs、單核細胞(Mononuclear cell，MC)數(shù)和淋巴細胞數(shù)的變化。

1.2.4 RT-PCR檢測PMNs凋亡相關(guān)基因mRNA表達量 將PMNs凍存樣品在室溫進行融化，而后在小型振蕩器上振蕩30 s，直到完全解離出PMNs核蛋白復合物。然后依照Sigma RNA提取試劑盒說明書進行總RNA 的提取。吸取3 μL RNA溶液，利用核酸濃度微量測定儀，檢測RNA濃度及其OD值，OD260/OD280≥1.9、OD260/OD230≥2.0 的RNA，純度符合要求，可用于反轉(zhuǎn)錄。

根據(jù)GenBank中牛源凋亡相關(guān)基因(Bax、P53、Cyt-c、Bcl-2)序列，運用Primer 5.0軟件設計引物，引物序列見表1。合成cDNA第一條鏈后進行PCR反應，反應體系：10×PCR Buffer 2.0 μL，cDNA 1 μL，dNTP 0.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，TaqDNA聚合酶0.2 μL，加ddH2O至20 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 30 s，合適溫度退火30 s，72 ℃ 30 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，用Quantity One對凋亡相關(guān)基因mRNA和內(nèi)參基因Tubulin條帶進行灰度掃描，計算相對表達量。

表1 牛源凋亡基因的PCR引物信息

1.2.5 Western blotting檢測PMNs凋亡相關(guān)蛋白表達量 在4 ℃條件下，解凍PMNs，14 000 ×g離心2 min棄上清，加入RIPA裂解液，充分振蕩，14 000×g離心10 min，取上清用Bradford法測定蛋白質(zhì)濃度；然后用2×SDS樣品緩沖液按1∶1混合煮沸變性，10% SDS-PAGE凝膠電泳；轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，TBST緩沖液漂洗3 次，每次5～10 min，將PVDF膜置5%脫脂奶中室溫封閉3 h后取出，TBST漂洗3次，每次10 min，與P53、Bax、Cyt-c、Bcl-2和Tubulin(對照)蛋白一抗孵育(1∶500)(4 ℃過夜)，PVDF膜經(jīng)TBST漂洗3次，每次10 min；與HRP標記的IgG(1∶1 000)室溫孵育2 h，經(jīng)TBST漂洗、DAB顯色，觀察拍照，用Glyko Bandcan 5.0軟件分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析處理，利用單因素方差分析(One-way ANOVA)、LSD法比較差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 圍產(chǎn)期蒙古牛外周PMNs的分離鑒定

外周血輕輕置于分離液液面上，離心后取出白色層即下數(shù)第3層，經(jīng)瑞氏染色鏡檢鑒定為PMNs，核呈深染的彎曲桿狀(馬蹄鐵形)或分葉狀，葉間有纖細的縮窄部相連。

2.2 圍產(chǎn)期蒙古牛血液PMNs數(shù)量和血清類固醇激素濃度的變化

2.2.1 PMNs和MC總數(shù) 由圖1可知，蒙古牛分娩前22～10 d PMNs和MC總數(shù)逐漸升高，分娩前10 d達到峰值，分娩前10～0 d逐漸下降，分娩后又逐漸升高。這說明伴隨分娩臨近，PMNs和MC免疫抑制作用逐漸減弱，分娩當天細胞數(shù)量降至最低，免疫抑制作用最弱，分娩后又逐漸增強。

圖1 圍產(chǎn)期蒙古牛外周血中PMNs和MC總數(shù)

2.2.2 淋巴細胞總數(shù) 由圖2可知，蒙古牛分娩前8～0 d淋巴細胞總數(shù)逐漸下降，0 d降至最低，分娩后2 d明顯升高，分娩前22～8 d、分娩后2～14 d變化不明顯。這說明隨著分娩臨近，淋巴細胞免疫抑制作用顯著減弱，0 d達到最低，產(chǎn)后淋巴細胞數(shù)量逐漸增多，機體免疫作用增強。

圖2 圍產(chǎn)期蒙古牛外周血中淋巴細胞總數(shù)

2.2.3 E2質(zhì)量濃度 由圖3可知，蒙古牛分娩前22～2 d E2質(zhì)量濃度明顯升高，并在分娩前2 d達到峰值，分娩前2～0 d明顯下降，分娩后2～14 d變化趨勢相對平緩。這表明隨著分娩逐漸臨近，E2活性明顯升高，而分娩時活性明顯下降，分娩后2 d活性降至基礎(chǔ)水平，之后無明顯變化。

圖3 圍產(chǎn)期蒙古牛外周血清中E2質(zhì)量濃度

2.2.4 P4質(zhì)量濃度 由圖4可知，蒙古牛分娩前22 d至分娩后2 d P4質(zhì)量濃度逐漸下降，分娩后2～14 d無明顯變化。這表明，隨著分娩臨近，P4活性逐漸下降，分娩當天活性降低最明顯，分娩后2 d達到正常生理活性，之后無明顯變化。

圖4 圍產(chǎn)期蒙古牛外周血清中P4質(zhì)量濃度

2.2.5 GC質(zhì)量濃度 由圖5可知，蒙古牛分娩前8～0 d GC質(zhì)量濃度逐漸升高，0 d達到峰值，分娩后0～2 d迅速下降，分娩后2 d之后無明顯變化。這表明隨著分娩臨近，GC活性逐漸升高，分娩當天活性最強，分娩后2 d降低至正常生理水平，之后變化不明顯。

圖5 圍產(chǎn)期蒙古牛外周血清中GC質(zhì)量濃度

2.3 PMNs凋亡相關(guān)基因mRNA表達水平

2.3.1Bax基因 由圖6可知，蒙古牛分娩前22～0 dBax基因mRNA表達量逐漸下降，分娩當天降至最低，分娩后0～14 d逐漸升高。這表明隨著分娩臨近，Bax基因表達抑制作用顯著增強，分娩當天最明顯，產(chǎn)后表達量逐漸升高。

圖6 Bax基因相對表達量

2.3.2Bcl-2基因 由圖7可知，蒙古牛分娩前22～0 dBcl-2 mRNA表達量逐漸上升，分娩當天升至最高，分娩后0～14 d逐漸降低。這表明，隨著分娩的臨近，Bcl-2基因表達抑制作用逐漸減弱，分娩當天作用最明顯，分娩后抑制作用逐漸增強，表達量逐漸下降。

圖7 Bcl-2基因相對表達量

2.3.3P53基因P53 mRNA表達量總體的變化趨勢如圖8，蒙古牛分娩前22～0 dP53 mRNA表達量逐漸下降，分娩當天降至最低，分娩后0～14 d逐漸升高。其中，分娩后0～8 dP53 mRNA表達量逐漸升高，8～14 d升高趨勢相對平緩，無明顯差異；與分娩后8、10、14 d相比，分娩前22、18、14、10 dP53表達量較高，即產(chǎn)前表達量明顯高于產(chǎn)后。這說明隨著分娩臨近，P53基因表達抑制作用逐漸增強，分娩時最明顯，產(chǎn)后抑制作用逐漸消除，表達量逐漸升高。

圖8 P53基因相對表達量

2.3.4Cyt-c基因 由圖9可知，蒙古牛分娩前22～0 dCyt-cmRNA表達量逐漸下降，并呈現(xiàn)一定的時間依賴性，分娩當天降至最低，分娩后0～14 d逐漸升高。這表明隨著分娩臨近，Cyt-c基因表達抑制作用明顯增強，分娩當天最明顯，分娩后表達抑制作用逐漸解除，表達量逐漸升高。

圖9 Cyt-c基因相對表達量

2.4 PMNs凋亡相關(guān)蛋白的表達水平

PMNs凋亡相關(guān)蛋白P53、Bax、Cyt-c、Bcl-2的相對表達量及變化趨勢如圖10。對目的條帶進行灰度分析，結(jié)果如圖11—14。由圖10和11可知，Bax蛋白表達趨勢與BaxmRNA基本一致。分娩前Bax蛋白表達量呈現(xiàn)下降趨勢，分娩后明顯升高。這表明隨著分娩的臨近，機體啟動分娩過程，明顯抑制了Bax蛋白的表達，分娩當天抑制作用最明顯，分娩后隨著抑制作用的解除表達量逐漸升高。

1—15：妊娠蒙古牛分娩前22、18、14、10、8、6、4、2 d及分娩當天及產(chǎn)后2、4、6、8、10、14 d圖10 PMNs凋亡相關(guān)蛋白的Western blot 檢測結(jié)果

圖11 Bax蛋白相對表達量

由圖10和12可知，Bcl-2蛋白表達變化趨勢與Bcl-2 mRNA基本一致。分娩前Bcl-2蛋白表達量明顯上升，分娩后呈現(xiàn)下降趨勢。這說明隨著分娩臨近，Bcl-2蛋白表達抑制作用逐漸解除，分娩當天最明顯，分娩后抑制作用逐漸增強，表達量下降。

圖12 Bcl-2蛋白相對表達量

由圖10和13可知，Cyt-c蛋白表達變化趨勢與Cyt-cmRNA基本一致。分娩前6～0 d Cyt-c蛋白表達量較分娩前22～6 d明顯下降，分娩后0～6 d較6～14 d明顯上升。這表明隨著分娩臨近，Cyt-c蛋白表達抑制作用逐漸增強，分娩當天最明顯，產(chǎn)后隨著抑制作用的逐漸解除，表達量逐漸升高。

圖13 Cyt-c蛋白相對表達量

由圖10和14可知， P53蛋白表達變化趨勢與P53 mRNA基本一致。分娩前P53蛋白表達量呈下調(diào)趨勢，分娩后表達抑制作用解除，表達量逐漸升高。

圖14 P53蛋白相對表達量

3 結(jié)論與討論

圍產(chǎn)期是牛繁殖障礙性疾病的高發(fā)期，其免疫抑制主要表現(xiàn)為外周血免疫細胞分布、數(shù)量及功能的改變，尤其是PMNs的顯著增加及其功能性基因表達的上調(diào)或下調(diào),從而誘發(fā)多種疾病[8]。外周血中PMNs的生命周期一般為6～8 h，隨即發(fā)生細胞凋亡或遷移至組織、器官參與炎性反應，但是當?shù)竭_炎癥部位參與炎癥反應時，PMNs的生命周期將延長2～4倍[9]。因此，認為外周血PMNs的分布和功能變化與細胞凋亡密切相關(guān)，即促進細胞凋亡利于維持免疫系統(tǒng)穩(wěn)定，反之抑制細胞凋亡可致免疫抑制[1]。Bax、P53、Cyt-c等促細胞凋亡基因以及Bcl-2等抗細胞凋亡基因是參與細胞凋亡調(diào)控的兩大類主要基因。本試驗結(jié)果表明，圍產(chǎn)期蒙古牛外周PMNs的Bcl-2 mRNA和蛋白表達量均以分娩當天為拐點先升后降，分娩前22 d和分娩后14 d明顯低于0 d；Bax、P53和Cyt-cmRNA和蛋白表達趨勢與Bcl-2相反。表明整個圍產(chǎn)期外周PMNs免疫活性經(jīng)歷了以分娩為節(jié)點的抑制加劇與減緩過程。

此外，大量試驗證實了圍產(chǎn)期免疫抑制、細胞功能與外周血主要類固醇激素P4、E2和GC質(zhì)量濃度的變化密切相關(guān)[10-12]。本研究結(jié)果表明，外周血血清E2質(zhì)量濃度于分娩前22 d逐漸升高，分娩前2 d升至最高；P4質(zhì)量濃度于分娩前22 d開始逐漸下降，分娩當天迅速下降；GC質(zhì)量濃度于分娩前22 d逐漸升高，分娩當天升至最高。GC刺激T細胞和B細胞的增殖、抑制相關(guān)因子的產(chǎn)生[11]，使產(chǎn)后牛外周PMNs的氧化狀態(tài)發(fā)生改變；E2通過Bcl-2家族成員誘發(fā)外周淋巴細胞凋亡、促進巨噬細胞炎性介導因子和細胞因子的產(chǎn)生；而P4能夠直接抑制T淋巴細胞促炎性因子的產(chǎn)生[6,12-14]。同時，E2、P4和GC依賴其特異性受體雙向調(diào)節(jié)PMNs活性，即低濃度時增強細胞活性而高濃度則抑制細胞活性。外周血PMNs和MC總數(shù)從分娩前22 d開始逐漸增多，分娩前10 d達最大值，而淋巴細胞數(shù)量在此期間并未出現(xiàn)明顯變化，這可能提示了PMNs的增多明顯抑制了淋巴細胞的增殖分化，致使機體出現(xiàn)免疫抑制，導致免疫應答反應相關(guān)分子表達發(fā)生明顯變化。同時，圍產(chǎn)期類固醇激素及激素間相互作用，共同調(diào)控凋亡相關(guān)基因的表達，例如P4可抑制Bax表達，上調(diào)Bcl-2表達；GC降低BaxmRNA豐度[10]。本試驗中促/抗細胞凋亡基因Bax/Bcl-2下調(diào)/上調(diào)趨勢與類固醇激素質(zhì)量濃度變化趨勢基本一致。

本試驗探究了類固醇激素水平和凋亡因子表達的動態(tài)變化特征，以及PMNs凋亡相關(guān)基因表達調(diào)控之間的關(guān)系，對臨床應用及科學研究具有一定的指導意義。需要指出的，為了進一步闡明圍產(chǎn)蒙古牛外周類固醇激素-受體表達與PMNs動態(tài)變化及相關(guān)分子表達的關(guān)系，本課題組正在開展PMNs類固醇激素核/膜受體及CD11b等信號分子表達研究，找到直接證據(jù)以支持本研究結(jié)果，也為闡明圍產(chǎn)牛機體免疫狀態(tài)及相關(guān)分子表達信號通路提供依據(jù)。