H1N1亞型豬流感病毒3種譜系三重RT-PCR檢測方法的建立與應(yīng)用

蘭德松，魏 澍，侯振中

(1．東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030； 2．農(nóng)業(yè)部動物疫病病原生物學(xué)重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030； 3．遼寧省動物疫病預(yù)防控制中心，遼寧 沈陽 110164； 4．遼寧省動物醫(yī)學(xué)研究院，遼寧 沈陽 110164)

豬流感(Swine influenza，SI)是一種豬的常見急性和高度接觸性呼吸道傳染病，由豬流感病毒(Swine influenza virus，SIV)感染豬而發(fā)生。豬流感是長期以來危害養(yǎng)豬業(yè)的重要疫病之一，尤其在集約化養(yǎng)殖場中廣泛存在，根除極為困難。豬群單純感染SIV具有感染率高但死亡率低的特點，但SIV感染豬只后易造成其呼吸道上皮損傷，繼而造成其他細(xì)菌或病毒易于侵入豬體內(nèi)，造成繼發(fā)感染或混合感染，導(dǎo)致感染豬群豬只死亡率升高，帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。目前，在流感研究領(lǐng)域，豬已被廣泛證實為流感病毒的“混合器”及新亞型流感病毒毒株產(chǎn)生的“活載體”。當(dāng)豬只同時感染2種以上不同種類或亞型流感病毒毒株時，不同流感病毒可在其呼吸道上皮細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行增殖和重配，產(chǎn)生新的重配毒株且具有明顯的選擇優(yōu)勢，傳播能力顯著增強(qiáng)，危害也顯著增加[2-6]。歷史上人流感大暴發(fā)與SIV有著密不可分的聯(lián)系，如1957年、1968年和2009年暴發(fā)的人流感疫情均由豬身上產(chǎn)生的重組流感病毒引起[3]，因而其公共衛(wèi)生學(xué)意義重大。

目前，在世界范圍內(nèi)豬群中流行的SIV主要為H1N1(包括古典型H1N1、類禽型H1N1以及2009年暴發(fā)的甲型H1N1)、H1N2(包括不同基因型)、H3N2(包括類人型或類禽型H3N2、重組H3N2)等亞型[6-7]。其中，H1N1亞型SIV又分為古典型 (Classical swine H1N1，CS H1N1)、類人型(Human-like H1N1，Hu H1N1)、類禽型 (Avian-like H1N1，aH1N1)和2009年在人群中大流行的甲型H1N1 (2009 pandemic H1N1，pdm/09 H1N1) 4個譜系[8]，近年來，通過血清學(xué)監(jiān)測及病原分離鑒定的結(jié)果顯示，我國豬群中流行的SIV優(yōu)勢亞型毒株為H1N1亞型，包括pdm/09 H1N1、CS H1N1和aH1N1[5-6,9-10]，偶爾也有Hu H1N1感染豬群的報道[11-12]。通過SPF雞胚分離病毒是當(dāng)前流感病毒檢測最靈敏可靠的“金標(biāo)準(zhǔn)”方法，尤其是對病毒含量低的樣本，通過雞胚接種增殖病毒進(jìn)行病毒分離鑒定無疑是最有效的方法，但對于大量樣本的大批量檢測，該方法耗時費力，對實驗室生物安全條件的要求也高，普通實驗室很難開展該項工作。PCR方法是一種目前公認(rèn)的進(jìn)行病毒鑒定的可靠手段，國內(nèi)已有學(xué)者建立了鑒別診斷不同亞型SIV的PCR方法[13-15]，在SIV檢測和流行病學(xué)調(diào)查中發(fā)揮了重要作用，但尚未建立當(dāng)前在我國豬群中流行的主要優(yōu)勢毒株H1N1亞型pdm/09 H1N1、CS H1N1和aH1N1等3種主要譜系SIV的多重RT-PCR鑒別檢測方法。為此，本研究針對H1N1亞型3種譜系pdm/09 H1N1、CS H1N1和aH1N1 SIV的HA基因特異性序列，設(shè)計了3套特異性引物，建立了H1N1亞型三重RT-PCR鑒別診斷方法，為開展豬群中流行的H1N1亞型SIV感染及流行情況的調(diào)查研究提供技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 毒株、雞胚 aH1N1、pdm/09 H1N1毒株由遼寧省動物醫(yī)學(xué)研究院實驗室分離并保存；CS H1N1亞型SIV病毒核酸、不同亞型SIV標(biāo)準(zhǔn)抗原和血清均由哈爾濱獸醫(yī)研究所豬流感研究室提供；H5、H7和H9亞型流感病毒、PRRSV和CSFV核酸為購自匹基生物公司相應(yīng)試劑盒中的核酸陽性對照品；9～11日齡SPF雞胚購自遼寧益康生物股份有限公司。

1.1.2 主要試劑及儀器 M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、dNTP(2.5 mmol/L)、RNase Inhibitor、DTT(0.1 mmol/L)、Premix ExTaq試劑盒、DL2000 DNA Marker均購自寶生物(大連)有限公司，病毒DNA/RNA提取試劑購自天隆科技有限公司，Multiskan GO全波長酶標(biāo)儀為賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品，普通PCR儀、電泳儀、Gel Doc XR+型凝膠成像系統(tǒng)為美國伯樂公司產(chǎn)品。

1.1.3 臨床樣品采集 2012—2017年采集遼寧地區(qū)屠宰場和疑似SIV發(fā)病豬場豬鼻咽拭子樣品3 310份。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設(shè)計及合成 根據(jù)GenBank上登錄的SIV的HA基因序列(收錄號分別為：GQ259909、FJ789832、JQ319648)，設(shè)計特異性擴(kuò)增pdm/09 H1N1、CS H1N1和aH1N1亞型SIV的HA基因的3對特異性引物(表1)，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 pdm/09 H1N1、CS H1N1和aH1N1亞型SIV的HA基因的引物序列

1.2.2 病毒總RNA 的提取 取已鑒定的H1N1亞型不同譜系SIV尿囊液樣品各200 μL，按照核酸提取試劑說明書進(jìn)行總RNA的提取。

1.2.3 單重和三重RT-PCR方法的建立

1.2.3.1 反轉(zhuǎn)錄 反轉(zhuǎn)錄引物為Uni12：5′-AGCAAAAGCAGG-3′。反應(yīng)體系為(25 μL)：11.5 μL ddH2O(經(jīng)DEPC處理)、2 μL dNTP(2.5 mmol/L)、1 μL Uni12 (20 μmol/L)、2.5 μL DTT(0.1 mmol/L)、5 μL 5×Reverse Transcriptase XL Buffer、0.5 μL M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、0.5 μL RNase Inhibitor、2 μL總RNA。反應(yīng)條件為：37 ℃水浴1 h，70 ℃水浴15 min。

1.2.3.2 單重和三重RT-PCR反應(yīng)體系及條件的優(yōu)化 通過梯度試驗對引物終濃度、模板濃度等反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，確定3種不同譜系單重RT-PCR反應(yīng)體系為(25 μL)：12.5 μL Premix ExTaq，10.5 μL ddH2O，1 μL cDNA，上、下游引物各0.5 μL。三重RT-PCR反應(yīng)體系為(25 μL)：12.5 μL Premix ExTaq，6.5 μL ddH2O，3 μL cDNA混合物(3種譜系各1 μL)，3種譜系上、下游引物各0.5 μL(共3 μL)。反應(yīng)條件為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL點樣于1 %瓊脂糖凝膠孔中，進(jìn)行電泳鑒定。

1.2.4 三重RT-PCR方法的特異性試驗 將3 310份采自遼寧地區(qū)屠宰場和疑似發(fā)病豬場的豬鼻咽拭子樣品處理后進(jìn)行雞胚接種，收取尿囊液，進(jìn)行HA-HI試驗[16]，鑒定分離得到亞型毒株39株；提取分離鑒定的SIV及H5、H7、H9亞型流感病毒、PRRSV、CSFV核酸，應(yīng)用本試驗建立的三重RT-PCR方法進(jìn)行檢測，對該方法的可靠性和特異性進(jìn)行驗證。

1.2.5 三重RT-PCR方法的敏感性試驗 對測定濃度的pdm/09 H1N1、CS H1N1和aH1N1亞型3種譜系SIV的cDNA產(chǎn)物進(jìn)行10倍梯度稀釋至10-5，進(jìn)行RT-PCR方法的敏感性試驗。

1.2.6 RT-PCR方法對臨床樣品的檢測 對采自遼寧地區(qū)屠宰場和疑似發(fā)病豬場的豬鼻咽拭子樣品3 310份，采用雞胚接種進(jìn)行病毒分離鑒定；應(yīng)用本試驗建立的三重RT-PCR方法對鑒定的毒株進(jìn)行pdm/09 H1N1、CS H1N1和aH1N1亞型不同譜系SIV檢測，計算RT-PCR方法與病毒分離結(jié)果的符合率。

2 結(jié)果與分析

2.1 單重和三重RT-PCR方法的建立結(jié)果

結(jié)果表明，3種譜系單重和三重RT-PCR方法均能特異性地擴(kuò)增出目的基因，pdm/09 H1N1 RT-PCR方法、CS H1N1 RT-PCR方法和aH1N1 RT-PCR方法均能特異性檢測出相應(yīng)譜系的SIV核酸，分別在476 bp、293 bp和997 bp位置出現(xiàn)目的條帶；三重RT-PCR方法能特異性地檢測出pdm/09 H1N1、CS H1N1和aH1N1病毒核酸混合物，在相應(yīng)位置出現(xiàn)目的條帶，與預(yù)期大小一致(圖1)。

M：DL2000 DNA Marker；1：aH1N1；2：CS H1N1；3：pdm/09 H1N1；4：pdm/09 H1N1、CS H1N1、aH1N1 SIV混合物；5：陰性對照圖1 H1N1亞型SIV不同譜系單重和三重RT-PCR電泳結(jié)果

2.2 三重RT-PCR方法的特異性試驗結(jié)果

試驗表明，H1N1亞型三重RT-PCR方法能特異性地檢測出pdm/09 H1N1、CS H1N1和aH1N1亞型SIV，而與H5、H7、H9亞型流感病毒、PRRSV和CSFV均無交叉反應(yīng)(圖2)。對3個譜系SIV的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別進(jìn)行回收純化后，經(jīng)測序進(jìn)一步確定為目的基因，表明本試驗建立的三重RT-PCR方法特異性強(qiáng)。

1：pdm/09 H1N1、CS H1N1、aH1N1 SIV混合物；2：H5亞型流感病毒；3：H7亞型流感病毒；4：H9亞型流感病毒；5：PRRSV；6：CSFV；7：陰性對照；M：DL2000 DNA Marker圖2 H1N1亞型SIV三重RT-PCR特異性試驗結(jié)果

2.3 三重RT-PCR方法的敏感性試驗結(jié)果

試驗結(jié)果表明，H1N1亞型SIV三重RT-PCR方法可檢測出稀釋至10-5的pdm/09 H1N1和CS H1N1模板cDNA，可檢測出稀釋至10-4的aH1N1模板cDNA(圖3)；經(jīng)Multiskan GO全波長酶標(biāo)儀測定DNA濃度發(fā)現(xiàn)，該方法可檢測出pdm/09 H1N1、CS H1N1和aH1N1 SIV核酸的極限拷貝量分別為1 460拷貝/μL、1 700拷貝/μL和1 950拷貝/μL。

M：DL2000 DNA Marker；1—6：100～10-5的cDNA模板；7：陰性對照圖3 H1N1亞型SIV三重RT-PCR敏感性試驗結(jié)果

2.4 三重RT-PCR方法對臨床樣品的檢測結(jié)果

對采自遼寧地區(qū)屠宰場、疑似發(fā)病豬場的豬鼻咽拭子3 310份，通過雞胚接種分離到具有血凝活性的樣品39份，陽性率為1.18 %。經(jīng)HI試驗鑒定，其中21份樣品為aH1N1亞型SIV，10份樣品為pdm/09 H1N1亞型，8份為H1N2亞型SIV，未分離到CS H1N1亞型SIV。本研究建立的三重RT-PCR方法對雞胚分離鑒定為aH1N1亞型陽性SIV的21份樣品和pdm/09 H1N1陽性SIV的10份樣品的3代尿囊液進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，結(jié)果與雞胚接種分離鑒定結(jié)果完全一致(表2)。

表2 三重RT-PCR與SPF雞胚病毒分離對臨床樣品檢測結(jié)果的比較

3 結(jié)論與討論

自1918年首次報道北美豬群中發(fā)生豬流感疫情，至今已經(jīng)整整100 a，盡管單純發(fā)生SIV感染導(dǎo)致的豬只死亡率并不高，但由于其造成的免疫損傷極易導(dǎo)致其他病毒或細(xì)菌的繼發(fā)感染，進(jìn)而造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失；同時由于豬在流感病毒流行、傳播中的“中間宿主”及“基因混合器”的特殊地位，豬流感現(xiàn)在已越來越引起人們的重視，多個國家也加強(qiáng)了對豬流感的監(jiān)測工作。

20世紀(jì)70年代以前，監(jiān)測到豬群中流行的SIV均為CS H1N1，自1979年，比利時首先在豬群中分離到aH1N1病毒，此后，該亞型病毒迅速代替CS H1N1病毒成為歐洲豬群中流行的優(yōu)勢亞型毒株，并一直流行至今[2,17-18]。在我國，Guan等[19]于1993年首次分離到aH1N1亞型病毒，隨后，在全國多個省份均發(fā)現(xiàn)該亞型病毒。近年來，其已成為我國豬群中流行的優(yōu)勢SIV毒株。另外，aH1N1亞型SIV已具備感染人的能力，2011年江蘇[20]以及2012年河北[21]各有1例患病死亡的男童，分別從他們體內(nèi)分離到的流感病毒經(jīng)鑒定均為H1N1亞型毒株，在抗原性和遺傳性上與歐洲和當(dāng)前中國豬群中流行的aH1N1亞型SIV關(guān)系密切。2009年，pdm/09 H1N1在墨西哥出現(xiàn)并從豬傳播到人類，導(dǎo)致全球范圍內(nèi)超過10萬人死亡，近年來該型病毒在我國豬群中也廣泛存在[9-10,22]。遺傳分析表明，該型病毒為三源重配病毒，其HA和NS基因來源于CS H1N1 SIV，NA和M基因來源于aH1N1 SIV，另外4個內(nèi)部基因來源于北美三源重配流感病毒(禽流感、人流感和豬流感病毒)，在疫情暴發(fā)前pdm/09 H1N1病毒未曾在豬體內(nèi)檢測到，但是該病毒的前體已在豬群中流行長達(dá)17 a之久[23]。

本研究通過對當(dāng)前流行的SIV優(yōu)勢毒株主要抗原相關(guān)基因HA基因序列分析，設(shè)計了針對H1N1亞型3種譜系pdm/09 H1N1、CS H1N1和aH1N1的3套特異性引物對，經(jīng)過優(yōu)化反應(yīng)體系和條件，建立了H1N1亞型三重RT-PCR方法，敏感性和特異性試驗結(jié)果表明，該方法敏感性較高、特異性良好，從核酸提取到電泳檢測目的條帶，全程大約4 h即可完成，相比單重RT-PCR節(jié)省了試劑成本與反應(yīng)時間。應(yīng)用本試驗建立的三重RT-PCR方法，對通過雞胚分離病毒獲得的SIV臨床陽性樣品進(jìn)行檢測表明，該方法能有效實現(xiàn)對臨床樣品中H1N1亞型3種譜系的檢測，2種方法的符合率達(dá)到100%。但該方法也存在一定的局限性，即檢測限較熒光定量RT-PCR偏高10倍左右，難以實現(xiàn)病毒的痕量檢出。另外，本方法對臨床樣品的檢測是通過雞胚接種傳代后的尿囊液，其病毒含量較直接采樣的鼻咽拭子中高得多，其對臨床采集的豬鼻咽拭子中的SIV陽性檢出率與雞胚分離病毒的符合率究竟能達(dá)到多大程度，尚需進(jìn)一步試驗驗證。