Tu-1菌劑替代抗生素對獺兔腸道消化酶活力、盲腸菌群及生長性能的影響

蘇 可，劉艷玲，姜軍坡*，王世英*，梁亞男

(1.河北農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院，河北 保定 071001； 2.保定市徐水區(qū)農(nóng)業(yè)局，河北 保定 072550)

在獺兔集約化、規(guī)模化的養(yǎng)殖中，由大腸桿菌等病原菌引起的傳染性腹瀉常發(fā)生于仔幼兔群，其具有傳染速度快、死亡率高、難治愈的特點，嚴重阻礙了仔幼兔的生長發(fā)育[1-2]。為了避免仔幼兔腹瀉導致的大量死亡及經(jīng)濟損失，養(yǎng)殖戶一般采用在飼料中加入抗生素的方法來防治，但長期使用抗生素會造成耐藥菌產(chǎn)生[3-4]、腸道微生態(tài)破壞[5]及畜產(chǎn)品藥物殘留[6]等，直接或間接危害著人類的健康。微生態(tài)制劑作為合適的抗生素替代品具有無毒、無污染、無副作用、無殘留的特性，且成本較低，防治效果好[7-9]。Tu-1菌株是以大腸桿菌的拮抗活性為主要篩選指標，從健康兔盲腸中分離得到的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)[10]。本試驗將Tu-1菌劑和預防劑量的硫酸黏桿菌素分別添加至斷奶獺兔飼料中，研究它們對獺兔腸道酶活力、盲腸菌群、生長性能及腹瀉的影響，為Tu-1菌劑替代抗生素飼料添加劑在養(yǎng)兔業(yè)中的應用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌劑

Tu-1微生物飼料添加劑由河北農(nóng)業(yè)大學研制、河北眾邦生物技術(shù)有限責任公司生產(chǎn)。其以枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)Tu-1菌株發(fā)酵制備，活菌(芽孢)含量1.0×1010cfu/g，以下簡稱Tu-1菌劑。

1.2 培養(yǎng)基

PCA培養(yǎng)基：按照GB/T 4789.2—2010配制，用于分離、計數(shù)細菌。EMB培養(yǎng)基：按照GB 4789.38—2012配制，用于鑒別、計數(shù)大腸桿菌。MRS培養(yǎng)基：按照GB/T4789.35—2010配制，用于鑒別、計數(shù)乳酸桿菌。BBL瓊脂培養(yǎng)基：按照GB/T4789.34—2012配制，用于分離、鑒別、計數(shù)雙歧桿菌。

1.3 試驗設(shè)計及飼養(yǎng)管理

根據(jù)生長狀況相似、公母各半的原則，選取60只40日齡健康斷奶獺兔，隨機分為對照組、抗生素組和菌劑組，每組5個重復，每個重復4只(公母各半)，分養(yǎng)于獺兔養(yǎng)殖籠內(nèi)。對照組飼喂基礎(chǔ)全價顆粒飼料；抗生素組飼喂添加20 mg/kg硫酸黏桿菌素制成的含抗生素的基礎(chǔ)全價顆粒飼料；菌劑組飼喂添加1.0‰Tu-1菌劑制成的含微生物飼料添加劑的基礎(chǔ)全價顆粒飼料?；A(chǔ)全價飼料組成及營養(yǎng)水平見表1。預試期5 d，正試期30 d。于正試期開始前和結(jié)束后對每只獺兔空腹稱始、末體質(zhì)量，并結(jié)算各組剩余飼料。每天觀察記錄獺兔腹瀉情況，計算各組獺兔腹瀉率。腹瀉率=∑(腹瀉兔數(shù)×兔腹瀉天數(shù))/(試驗兔數(shù)×試驗天數(shù))×100%。

兔舍自然通風，每天早、晚定時定量喂料2次，每次投喂量約50 g/只，試兔自由采食和飲水。每天打掃兔舍，保持干凈衛(wèi)生的飼養(yǎng)環(huán)境，并按照獺兔飼養(yǎng)要求統(tǒng)一免疫和驅(qū)蟲。飼養(yǎng)試驗在河北省保定市大莊獺兔養(yǎng)殖場進行。

表1 基礎(chǔ)全價顆粒飼料組成及營養(yǎng)水平

1.4 樣品采集

試驗期結(jié)束后，每組隨機選取10只獺兔屠宰，解剖分離得十二指腸、空腸、回腸、盲腸內(nèi)容物，現(xiàn)場測定盲腸內(nèi)容物10倍稀釋液的pH值[11]。其余立即放入滅菌后的離心管中，置于液氮中冷凍，帶回河北農(nóng)業(yè)大學實驗室放入-20 ℃冰箱中備測。

1.5 各腸段消化酶活力測定

待測樣品的制備：稱取腸段內(nèi)容物各0.5 g，加2.0 mL蒸餾水，8 000 r/min離心取上清液，即為5倍稀釋的待測酶液。

采用GB/T 28715—2012、GB/T 2440—2009、NY/T 912—2004和GB/T 23535—2009所示的方法分別測定待測酶液的酸性蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶和脂肪酶活力。

1.6 盲腸菌群數(shù)量測定

取盲腸內(nèi)容物，用滅菌生理鹽水進行10倍系列稀釋至10-7。選擇3個適當稀釋度溶液各0.1 mL分別涂布PCA、EMB、MRS和BBL瓊脂培養(yǎng)基平板，每種平板每個稀釋度涂布3個。PCA和EMB平板在36 ℃培養(yǎng)48 h，MRS和BBL瓊脂培養(yǎng)基平板需在36 ℃厭氧培養(yǎng)48 h。選擇30～300 cfu/皿的平板進行計數(shù)，結(jié)果以lg (cfu/g)表示。

1.7 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用Excel軟件整理，SPSS 18.0軟件進行單因素方差分析，LSD法進行組間差異顯著性檢驗。數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 Tu-1菌劑對獺兔腸道消化酶活力及pH值的影響

由表2可知，菌劑組的十二指腸、空腸、回腸和盲腸蛋白酶活力比對照組分別提高13.05%、17.95%、21.27%和31.58%(P<0.05)，菌劑組的十二指腸、空腸、回腸和盲腸淀粉酶活力比對照組分別提高13.93%、14.23%、45.51%和49.58%(P<0.05)，菌劑組的十二指腸、空腸、回腸和盲腸脂肪酶活力比對照組分別提高11.71%、18.17%、19.22%和26.84%(P<0.05)，菌劑組的十二指腸、空腸、回腸和盲腸纖維素酶活力比對照組分別提高69.84%、83.43%、111.06%和54.59%(P<0.01)；抗生素組的十二指腸、空腸、回腸和盲腸纖維素酶活力比對照組降低了16.67%、28.57%、12.90%和23.41%(P<0.05)，其他3種酶活力與對照組基本一致。

菌劑組盲腸的pH值比對照組降低0.72(P<0.05)，其他各腸段的pH值也略低于對照組(P>0.05)；抗生素組各腸段pH值與對照組相比無顯著變化。

2.2 Tu-1菌劑對獺兔盲腸菌群的影響

由表3的數(shù)據(jù)可知，菌劑組盲腸中大腸桿菌的數(shù)量比對照組極顯著降低(P<0.01)，而乳酸桿菌和雙歧桿菌的數(shù)量均比對照組顯著提高(P<0.05)，細菌總數(shù)變化不顯著；抗生素組盲腸中大腸桿菌和細菌總數(shù)均極顯著低于對照組(P<0.01)，而乳酸桿菌和雙歧桿菌數(shù)量比對照組略低(P>0.05)。

表2 Tu-1菌劑對獺兔腸道消化酶活力及pH值的影響

注：同列相同腸段不同小寫字母上標表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母上標表示差異極顯著(P<0.01)，下同。

表3 Tu-1菌劑對獺兔盲腸菌群數(shù)量的影響

2.3 Tu-1菌劑對獺兔生長性能及腹瀉率的影響

表4的結(jié)果表明，菌劑組和抗生素組的日增體質(zhì)量比對照組分別提高16.61%和13.74%(P<0.05)；菌劑組的料重比、腹瀉率與對照組相比分別降低了9.51%、68.11%(P<0.05)，抗生素組的料重比、腹瀉率比對照組分別降低了8.29%、64.03%(P<0.05)，且菌劑組和抗生素組之間無顯著差異。

表4 Tu-1菌劑對獺兔生長性能及腹瀉率的影響

3 結(jié)論與討論

本試驗結(jié)果表明，Tu-1菌劑能夠顯著提高獺兔腸道消化酶活力，抑制盲腸大腸桿菌，促進乳酸桿菌和雙歧桿菌等有益菌的生長；硫酸黏桿菌素對腸道蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活力沒有影響，顯著降低獺兔腸道纖維素酶活力，硫酸黏桿菌素顯著降低盲腸中大腸桿菌數(shù)量和細菌總數(shù)，對乳酸桿菌、雙歧桿菌無明顯抑制作用。Tu-1菌劑在提高獺兔日增體質(zhì)量，降低料重比和腹瀉率方面優(yōu)于硫酸黏桿菌素，但二者無顯著差異。因此，Tu-1菌劑在提高獺兔生產(chǎn)性能和腸道消化酶活力，維護腸道微生態(tài)平衡和降低腹瀉率方面優(yōu)于硫酸黏桿菌素。

本試驗結(jié)果表明，Tu-1菌劑和硫酸黏桿菌素均能顯著提高獺兔生長性能并顯著降低腹瀉率，但二者對腸道消化酶和盲腸菌群的影響有明顯不同，這提示二者的作用機制可能不同。Tu-1菌劑進入獺兔腸道后，經(jīng)自身生長繁殖產(chǎn)生或促進腸道產(chǎn)生蛋白酶、淀粉酶等各種消化酶，提高飼料各種主要營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，并通過競爭附著位點、生物奪氧、營養(yǎng)競爭、產(chǎn)生抑菌物質(zhì)等方式抑制病原菌生長，調(diào)節(jié)維護腸道微生態(tài)[12-13]；而硫酸黏桿菌素則是通過改變腸壁組織結(jié)構(gòu)狀態(tài)促進營養(yǎng)物質(zhì)吸收，殺滅包括病原菌在內(nèi)的部分腸道微生物，降低微生物對宿主營養(yǎng)物質(zhì)的競爭起到促生長的作用[14]。

顧雅君等[15]在Tu-1菌株的基礎(chǔ)上進一步分離篩選得到Tu-2菌株，制備了Tu-2制劑，并將Tu-2制劑添加至飼料中，研究其對肉兔糞便消化酶活性和生長性能的影響，結(jié)果表明，添加該制劑后肉兔糞便中纖維素酶、蛋白酶、α-淀粉酶和脂肪酶的平均活力比對照組分別提高36.65%、31.81%、20.99%和23.08%，平均增體質(zhì)量提高16.40%，料重比降低l4.15%。這與本試驗中Tu-1菌劑顯著提高獺兔各腸段消化酶的活力，顯著提高獺兔生長性能的試驗結(jié)果相一致。本試驗中，Tu-1菌劑可顯著降低獺兔盲腸中大腸桿菌的數(shù)量，主要是因為Tu-1菌株是利用大腸桿菌的拮抗性為主要篩選指標從健康獺兔盲腸中分離得到的芽孢桿菌[10]，而乳酸桿菌和雙歧桿菌的數(shù)量比對照組均顯著提高，可能是由于Tu-1菌劑進入腸道后，利用腸道內(nèi)環(huán)境進行生長繁殖，消耗腸道內(nèi)過多氧氣，制造厭氧環(huán)境，促進厭氧菌生長的緣故[16-17]。硫酸黏桿菌素使盲腸中大腸桿菌和細菌總數(shù)極顯著低于對照組，而對乳酸桿菌和雙歧桿菌數(shù)量基本無影響，其原因是硫酸黏桿菌素主要殺滅腸道中敏感的革蘭氏陰性菌[18-19]，對乳酸桿菌和雙歧桿菌等革蘭氏陽性菌幾乎無作用。

本試驗測得對照組獺兔(75日齡)各腸段的pH值變化規(guī)律為回腸>空腸>十二指腸>盲腸，這與高振華等[20]研究獺兔消化道pH值的變化規(guī)律得到的結(jié)果一致。與對照組相比，Tu-1菌劑能夠顯著降低盲腸內(nèi)容物的pH值，這可能是因為該菌株在盲腸中產(chǎn)生了較多纖維素酶，分解纖維素產(chǎn)生葡萄糖等小分子糖類后又被微生物利用產(chǎn)生較多的有機酸所致。但在腸道的前段菌株尚未充分生長繁殖，影響較小，因此十二指腸、空腸、回腸的pH值只是稍有下降，未達到顯著水平。