蘇 可,劉艷玲,姜軍坡*,王世英*,梁亞男
(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,河北 保定 071001; 2.保定市徐水區(qū)農(nóng)業(yè)局,河北 保定 072550)
在獺兔集約化、規(guī)?;酿B(yǎng)殖中,由大腸桿菌等病原菌引起的傳染性腹瀉常發(fā)生于仔幼兔群,其具有傳染速度快、死亡率高、難治愈的特點(diǎn),嚴(yán)重阻礙了仔幼兔的生長發(fā)育[1-2]。為了避免仔幼兔腹瀉導(dǎo)致的大量死亡及經(jīng)濟(jì)損失,養(yǎng)殖戶一般采用在飼料中加入抗生素的方法來防治,但長期使用抗生素會造成耐藥菌產(chǎn)生[3-4]、腸道微生態(tài)破壞[5]及畜產(chǎn)品藥物殘留[6]等,直接或間接危害著人類的健康。微生態(tài)制劑作為合適的抗生素替代品具有無毒、無污染、無副作用、無殘留的特性,且成本較低,防治效果好[7-9]。Tu-1菌株是以大腸桿菌的拮抗活性為主要篩選指標(biāo),從健康兔盲腸中分離得到的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)[10]。本試驗(yàn)將Tu-1菌劑和預(yù)防劑量的硫酸黏桿菌素分別添加至斷奶獺兔飼料中,研究它們對獺兔腸道酶活力、盲腸菌群、生長性能及腹瀉的影響,為Tu-1菌劑替代抗生素飼料添加劑在養(yǎng)兔業(yè)中的應(yīng)用提供依據(jù)。
Tu-1微生物飼料添加劑由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)研制、河北眾邦生物技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)。其以枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)Tu-1菌株發(fā)酵制備,活菌(芽孢)含量1.0×1010cfu/g,以下簡稱Tu-1菌劑。
PCA培養(yǎng)基:按照GB/T 4789.2—2010配制,用于分離、計(jì)數(shù)細(xì)菌。EMB培養(yǎng)基:按照GB 4789.38—2012配制,用于鑒別、計(jì)數(shù)大腸桿菌。MRS培養(yǎng)基:按照GB/T4789.35—2010配制,用于鑒別、計(jì)數(shù)乳酸桿菌。BBL瓊脂培養(yǎng)基:按照GB/T4789.34—2012配制,用于分離、鑒別、計(jì)數(shù)雙歧桿菌。
根據(jù)生長狀況相似、公母各半的原則,選取60只40日齡健康斷奶獺兔,隨機(jī)分為對照組、抗生素組和菌劑組,每組5個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)4只(公母各半),分養(yǎng)于獺兔養(yǎng)殖籠內(nèi)。對照組飼喂基礎(chǔ)全價(jià)顆粒飼料;抗生素組飼喂添加20 mg/kg硫酸黏桿菌素制成的含抗生素的基礎(chǔ)全價(jià)顆粒飼料;菌劑組飼喂添加1.0‰Tu-1菌劑制成的含微生物飼料添加劑的基礎(chǔ)全價(jià)顆粒飼料?;A(chǔ)全價(jià)飼料組成及營養(yǎng)水平見表1。預(yù)試期5 d,正試期30 d。于正試期開始前和結(jié)束后對每只獺兔空腹稱始、末體質(zhì)量,并結(jié)算各組剩余飼料。每天觀察記錄獺兔腹瀉情況,計(jì)算各組獺兔腹瀉率。腹瀉率=∑(腹瀉兔數(shù)×兔腹瀉天數(shù))/(試驗(yàn)兔數(shù)×試驗(yàn)天數(shù))×100%。
兔舍自然通風(fēng),每天早、晚定時(shí)定量喂料2次,每次投喂量約50 g/只,試兔自由采食和飲水。每天打掃兔舍,保持干凈衛(wèi)生的飼養(yǎng)環(huán)境,并按照獺兔飼養(yǎng)要求統(tǒng)一免疫和驅(qū)蟲。飼養(yǎng)試驗(yàn)在河北省保定市大莊獺兔養(yǎng)殖場進(jìn)行。
表1 基礎(chǔ)全價(jià)顆粒飼料組成及營養(yǎng)水平
試驗(yàn)期結(jié)束后,每組隨機(jī)選取10只獺兔屠宰,解剖分離得十二指腸、空腸、回腸、盲腸內(nèi)容物,現(xiàn)場測定盲腸內(nèi)容物10倍稀釋液的pH值[11]。其余立即放入滅菌后的離心管中,置于液氮中冷凍,帶回河北農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)室放入-20 ℃冰箱中備測。
待測樣品的制備:稱取腸段內(nèi)容物各0.5 g,加2.0 mL蒸餾水,8 000 r/min離心取上清液,即為5倍稀釋的待測酶液。
采用GB/T 28715—2012、GB/T 2440—2009、NY/T 912—2004和GB/T 23535—2009所示的方法分別測定待測酶液的酸性蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶和脂肪酶活力。
取盲腸內(nèi)容物,用滅菌生理鹽水進(jìn)行10倍系列稀釋至10-7。選擇3個(gè)適當(dāng)稀釋度溶液各0.1 mL分別涂布PCA、EMB、MRS和BBL瓊脂培養(yǎng)基平板,每種平板每個(gè)稀釋度涂布3個(gè)。PCA和EMB平板在36 ℃培養(yǎng)48 h,MRS和BBL瓊脂培養(yǎng)基平板需在36 ℃厭氧培養(yǎng)48 h。選擇30~300 cfu/皿的平板進(jìn)行計(jì)數(shù),結(jié)果以lg (cfu/g)表示。
試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel軟件整理,SPSS 18.0軟件進(jìn)行單因素方差分析,LSD法進(jìn)行組間差異顯著性檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。
由表2可知,菌劑組的十二指腸、空腸、回腸和盲腸蛋白酶活力比對照組分別提高13.05%、17.95%、21.27%和31.58%(P<0.05),菌劑組的十二指腸、空腸、回腸和盲腸淀粉酶活力比對照組分別提高13.93%、14.23%、45.51%和49.58%(P<0.05),菌劑組的十二指腸、空腸、回腸和盲腸脂肪酶活力比對照組分別提高11.71%、18.17%、19.22%和26.84%(P<0.05),菌劑組的十二指腸、空腸、回腸和盲腸纖維素酶活力比對照組分別提高69.84%、83.43%、111.06%和54.59%(P<0.01);抗生素組的十二指腸、空腸、回腸和盲腸纖維素酶活力比對照組降低了16.67%、28.57%、12.90%和23.41%(P<0.05),其他3種酶活力與對照組基本一致。
菌劑組盲腸的pH值比對照組降低0.72(P<0.05),其他各腸段的pH值也略低于對照組(P>0.05);抗生素組各腸段pH值與對照組相比無顯著變化。
由表3的數(shù)據(jù)可知,菌劑組盲腸中大腸桿菌的數(shù)量比對照組極顯著降低(P<0.01),而乳酸桿菌和雙歧桿菌的數(shù)量均比對照組顯著提高(P<0.05),細(xì)菌總數(shù)變化不顯著;抗生素組盲腸中大腸桿菌和細(xì)菌總數(shù)均極顯著低于對照組(P<0.01),而乳酸桿菌和雙歧桿菌數(shù)量比對照組略低(P>0.05)。
表2 Tu-1菌劑對獺兔腸道消化酶活力及pH值的影響
注:同列相同腸段不同小寫字母上標(biāo)表示差異顯著(P<0.05),不同大寫字母上標(biāo)表示差異極顯著(P<0.01),下同。
表3 Tu-1菌劑對獺兔盲腸菌群數(shù)量的影響
表4的結(jié)果表明,菌劑組和抗生素組的日增體質(zhì)量比對照組分別提高16.61%和13.74%(P<0.05);菌劑組的料重比、腹瀉率與對照組相比分別降低了9.51%、68.11%(P<0.05),抗生素組的料重比、腹瀉率比對照組分別降低了8.29%、64.03%(P<0.05),且菌劑組和抗生素組之間無顯著差異。
表4 Tu-1菌劑對獺兔生長性能及腹瀉率的影響
本試驗(yàn)結(jié)果表明,Tu-1菌劑能夠顯著提高獺兔腸道消化酶活力,抑制盲腸大腸桿菌,促進(jìn)乳酸桿菌和雙歧桿菌等有益菌的生長;硫酸黏桿菌素對腸道蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活力沒有影響,顯著降低獺兔腸道纖維素酶活力,硫酸黏桿菌素顯著降低盲腸中大腸桿菌數(shù)量和細(xì)菌總數(shù),對乳酸桿菌、雙歧桿菌無明顯抑制作用。Tu-1菌劑在提高獺兔日增體質(zhì)量,降低料重比和腹瀉率方面優(yōu)于硫酸黏桿菌素,但二者無顯著差異。因此,Tu-1菌劑在提高獺兔生產(chǎn)性能和腸道消化酶活力,維護(hù)腸道微生態(tài)平衡和降低腹瀉率方面優(yōu)于硫酸黏桿菌素。
本試驗(yàn)結(jié)果表明,Tu-1菌劑和硫酸黏桿菌素均能顯著提高獺兔生長性能并顯著降低腹瀉率,但二者對腸道消化酶和盲腸菌群的影響有明顯不同,這提示二者的作用機(jī)制可能不同。Tu-1菌劑進(jìn)入獺兔腸道后,經(jīng)自身生長繁殖產(chǎn)生或促進(jìn)腸道產(chǎn)生蛋白酶、淀粉酶等各種消化酶,提高飼料各種主要營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收,并通過競爭附著位點(diǎn)、生物奪氧、營養(yǎng)競爭、產(chǎn)生抑菌物質(zhì)等方式抑制病原菌生長,調(diào)節(jié)維護(hù)腸道微生態(tài)[12-13];而硫酸黏桿菌素則是通過改變腸壁組織結(jié)構(gòu)狀態(tài)促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)吸收,殺滅包括病原菌在內(nèi)的部分腸道微生物,降低微生物對宿主營養(yǎng)物質(zhì)的競爭起到促生長的作用[14]。
顧雅君等[15]在Tu-1菌株的基礎(chǔ)上進(jìn)一步分離篩選得到Tu-2菌株,制備了Tu-2制劑,并將Tu-2制劑添加至飼料中,研究其對肉兔糞便消化酶活性和生長性能的影響,結(jié)果表明,添加該制劑后肉兔糞便中纖維素酶、蛋白酶、α-淀粉酶和脂肪酶的平均活力比對照組分別提高36.65%、31.81%、20.99%和23.08%,平均增體質(zhì)量提高16.40%,料重比降低l4.15%。這與本試驗(yàn)中Tu-1菌劑顯著提高獺兔各腸段消化酶的活力,顯著提高獺兔生長性能的試驗(yàn)結(jié)果相一致。本試驗(yàn)中,Tu-1菌劑可顯著降低獺兔盲腸中大腸桿菌的數(shù)量,主要是因?yàn)門u-1菌株是利用大腸桿菌的拮抗性為主要篩選指標(biāo)從健康獺兔盲腸中分離得到的芽孢桿菌[10],而乳酸桿菌和雙歧桿菌的數(shù)量比對照組均顯著提高,可能是由于Tu-1菌劑進(jìn)入腸道后,利用腸道內(nèi)環(huán)境進(jìn)行生長繁殖,消耗腸道內(nèi)過多氧氣,制造厭氧環(huán)境,促進(jìn)厭氧菌生長的緣故[16-17]。硫酸黏桿菌素使盲腸中大腸桿菌和細(xì)菌總數(shù)極顯著低于對照組,而對乳酸桿菌和雙歧桿菌數(shù)量基本無影響,其原因是硫酸黏桿菌素主要?dú)缒c道中敏感的革蘭氏陰性菌[18-19],對乳酸桿菌和雙歧桿菌等革蘭氏陽性菌幾乎無作用。
本試驗(yàn)測得對照組獺兔(75日齡)各腸段的pH值變化規(guī)律為回腸>空腸>十二指腸>盲腸,這與高振華等[20]研究獺兔消化道pH值的變化規(guī)律得到的結(jié)果一致。與對照組相比,Tu-1菌劑能夠顯著降低盲腸內(nèi)容物的pH值,這可能是因?yàn)樵摼暝诿つc中產(chǎn)生了較多纖維素酶,分解纖維素產(chǎn)生葡萄糖等小分子糖類后又被微生物利用產(chǎn)生較多的有機(jī)酸所致。但在腸道的前段菌株尚未充分生長繁殖,影響較小,因此十二指腸、空腸、回腸的pH值只是稍有下降,未達(dá)到顯著水平。