反相液相色譜法對米糠油中四種生育酚含量的測定

李晴 周曉晴 陳沙 喻俊磊

摘要：建立了反相液相色譜法同時測定植物油中4種生育酚的方法。樣品用甲醇超聲提取，離心后取上清液氮吹至干，甲醇定容后過有機相濾膜，PEF柱（150 mm×3.0 mm，2.6 μm）分離，甲醇∶水（88∶12）作流動相等度洗脫，流速0.4 mL/min；柱溫30 ℃；熒光檢測（λex=294 nm，λem=328 nm）進樣5 μL，外標法定量，在20 min內(nèi)同時分離出α-、β-、γ-和δ- 4種生育酚異構(gòu)體。4種生育酚的質(zhì)量濃度在0.5～50.0 μg/mL與峰面積呈良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)大于0.999。在3個添加水平下的平均加標回收率在84.47%～116.50%，相對標準偏差≤6.0%（n=6），α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚及δ-生育酚的方法檢出限分別為0.10、0.05、0.05、0.04 mg/kg，表明該方法靈敏度高，回收率好，可應用于實際樣品的分析。

關(guān)鍵詞：反相高效液相色譜；熒光檢測；生育酚；米糠油

中圖分類號：O657.7+2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2018）11-0087-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.11.021

Abstract： The method of simultaneous determination of 4 kinds of tocopherol in vegetable oil was established by reversed-phase liquid chromatography.After sample ultrasonic extraction with methanol，centrifugal supernatant liquid nitrogen blow to dry，the capacity after the methanol organic phase filter membrane，PEF column（150×3.0 mm，2.6microns） separation，methanol and water （88∶12） elution flow equal degree，velocity 0.4 mL/min；Column temperature 30 ℃；The fluorescence detection （a） of the sample volume was 5 μL，the external standard method was quantitatively determined，and the two types of paroxygenol isomers were isolated at the same time in 20 min. The mass concentration of 4 kinds of tocopherol was in a good linear relationship with the peak area within the range of 0.5～50.0 μg/mL，and the linear correlation coefficient was greater than 0.999. Adding in the three levels with respect to the average recovery was 84.47%～116.50%，relative standard deviation（RSD） for 6.0% or less（n=6），alpha tocopherol，beta tocopherol，gamma tocopherol and delta-tocopherol，method detection limit （LOD） were respectively 0.10，0.05，0.05，0.04 mg/kg. The method is accurate，sensitive and reliable，and can be applied to the analysis of actual samples.

Key words： inverse phase high performance liquid chromatography； fluorescence detection； tocopherol； rice bran oil

生育酚（Tocopherol）俗稱維生素E，是人體代謝所必需的一種植物源性脂溶維生素，室溫下為油狀液體，橙黃或淡黃色，在熱、酸等環(huán)境比較穩(wěn)定，遇堿不穩(wěn)定，易氧化。根據(jù)甲基的數(shù)目和位置的不同分為α-、β-、γ-和δ- 4種不同形式（結(jié)構(gòu)式見圖1）。4種生育酚的生物活性強度不同，如α-生育酚分布最廣、生物活性最高，δ-生育酚抗氧化能力最強。生育酚對人體有重要的生理功能，具有抗氧化、抗衰老、抗不育、調(diào)節(jié)免疫力等作用，對生殖功能、細胞代謝均有影響[1]，對一些臨床疾病有積極的預防作用。植物油中含有豐富的生育酚[2-5]，但不同植物油中生育酚的種類和含量有所不同。橄欖油、葵花子油、葡萄子油主要含有α-生育酚，核桃油、菜子油、亞麻子油、玉米油、大豆油中主要為γ-生育酚，另外大豆油中含有相對較高的δ-生育酚，米糠油含有最齊全的4種維生素E組分[6，7]。在發(fā)達國家，米糠油是一種與橄欖油齊名的健康營養(yǎng)油，深受高血脂、心腦血管疾患人群喜愛，并早已成為西方家庭的日常健康食用油，隨著中國稻米精深加工業(yè)整體水平的提高，以及人們對油類產(chǎn)品的營養(yǎng)保健作用的重視，米糠油的產(chǎn)業(yè)鏈正在逐步形成，其市場潛力將逐步釋放，由于米糠油本身穩(wěn)定性良好，適合作為煎炸用油，還可制作人造奶油、起酥油以及高級營養(yǎng)油等。選用米糠油作為研究對象，并對生育酚在煎炸過程中的穩(wěn)定性進行研究。

目前食品中生育酚測定常用的檢測方法有分光光度法、高效液相色譜法（Highperformance liquid chromatography，HPLC）、氣相色譜法（Gas chromatography，GC）及傅里葉變換紅外光譜法（Fourier transform infrared spectrometry，F(xiàn)TIR）等。其中，應用最廣泛的為高效液相色譜法，包括正相液相色譜法[8-10]和反相液相色譜法[11-15]。新國標GB 5009.82-2016[16]與GB/T26635-2011[17]均采用正相色譜法測定α-、β-、γ-及δ-生育酚，但是正相高效液相色譜法有許多缺點，如流動相揮發(fā)性強、一些溶劑強致癌性、重復性差、分析時間長及穩(wěn)定性差等，加之正相液相色譜在應用上不如反相色譜廣泛。故有必要建立一種反相液相色譜的分析方法用于4種生育酚檢測。

1 材料與方法

1.1 樣品材料

米糠油（市售）。

1.2 試劑

生育酚標準品：α-生育酚（純度99.9%，Dr.Ehrenstorfer GmbH）；β-生育酚（純度95.2%，BePure）；γ-生育酚（純度94.6%，BePure）；δ-生育酚（純度95.2%，SUPELCO）。

甲醇、正己烷（SCHARLAB S.L公司）均為色譜純；試驗用水為超純水。

1.3 儀器與設備

高效液相色譜系統(tǒng)（美國戴安公司）；離心機（德國Sarorius公司）；恒溫氮吹儀（江西華科精密儀器有限公司）；振蕩器（上海愛朗儀器有限公司）；超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）；電子分析天平（精度為0.000 1 g，德國Sarorius公司）。

1.4 方法

1.4.1 生育酚標準儲備液 準確稱取生育酚標準品50 mg于50 mL棕色容量瓶中，用乙醇溶液溶解后，定容至刻度，得到1 000 μg/mL的標準儲備液，-20 ℃避光保存，臨用前校正。

1.4.2 生育酚標準工作液 分別移取不同體積中間工作液到50 mL棕色容量瓶，用乙醇定容至刻度，稀釋配制濃度為0.500、1.00、5.00、10.00、20.00、50.00 μg/mL的系列標準工作液，臨用前校正。

1.4.3 樣品前處理 稱取0.50 g植物油樣于50 mL離心管中，加入10.00 mL甲醇，振蕩提取10 min，以4 000 r/min離心5 min，取5.00 mL液體，避光氮吹干，用1.00 mL甲醇定容，過0.25 μm有機相濾膜，待測。

1.4.4 標準曲線的繪制 分別將“1.4.2”中系列標準工作液按試驗方法進樣，記錄得到的峰面積，以峰面積為縱坐標，以標準液濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

1.5 色譜條件

PEF色譜柱（150 mm×3.0 mm×2.6 μm），柱溫為室溫，甲醇-水（88∶12）作流動相等度洗脫，流速0.4 mL/min，熒光檢測（激發(fā)波長為294 nm、發(fā)射波長為328 nm）進樣量5 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法的優(yōu)化

2.1.1 提取條件的優(yōu)化 采用正相液相色譜法測定食品中的生育酚，前處理簡單但是進樣過程繁瑣、耗時長且重復性較差，本方法采用甲醇和乙腈進行反相液相色譜法提取和分析，結(jié)果顯示用甲醇做為溶劑進行提取時提取率較高且樣品圖譜無干擾性雜峰（圖2）。為了獲得更好的提取率，對甲醇的提取體積進行考察，其回收率見圖3。其中用10 mL甲醇作為萃取溶劑時，萃取率最高。因此，選擇10 mL的甲醇做溶劑。

2.1.2 檢測器的選擇 對比熒光檢測器與紫外檢測器對生育酚的靈敏度（圖4），結(jié)果表明熒光檢測器對生育酚的靈敏度更強。

2.2 線性關(guān)系考察

2.2.1 生育酚標準曲線 將α-、β-、γ-及δ-生育酚系列標準工作液進高效液相色譜儀進行測定，結(jié)果見表1。結(jié)果表明，δ-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚在0.1～50.0 μg/mL，α-生育酚在0.5～50.0 μg/mL具有良好的線性關(guān)系。

2.2.2 精密度試驗 對同一樣品進行6次重復進樣，δ-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚和α-生育酚相對標準偏差結(jié)果見表2。

2.2.3 回收率試驗 對米糠油樣品進行3個添加水平的加標，按照“1.4.3”中的方法處理后進高效液相色譜儀，高、中、低回收率見表3。4種生育酚的加標回收率在84.47%～116.50%，表明該方法回收率良好，結(jié)果準確。

2.3 樣品穩(wěn)定性測試

對不同煎炸時間米糠油的含量進行測定，結(jié)果見表4。由表4可以看出，煎炸米糠油中各種生育酚含量隨煎炸時間的延長而降低，至煎炸32 h，生育酚含量基本喪失，僅存微量的α-生育酚。

3 結(jié)論

本研究建立了反相高效液相色譜法同時測定米糠油中4種生育酚的分析方法，該方法操作簡單、線性良好、穩(wěn)定性好及回收率滿足分析要求且該方法中4種生育酚的檢出限及定量限均低于國家標準GB5009.82-2016規(guī)定的檢出限要求，既節(jié)約了成本又節(jié)省了時間，因此該方法可用于實際樣品的檢測。

隨著油炸時間延長，4種生育酚的活性明顯降低，而地溝油是由植物油經(jīng)高溫煎炸反復使用后得到，因此可將生育酚含量作為地溝油篩選的指標之一。

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