大孔樹脂分離對(duì)銀杏外種皮多酚抗氧化及抑菌活性的影響

郭佩佩 張雪娟 馬永珍 徐艷

摘要：以銀杏（Ginkgo biloba L.）外種皮為原料，乙醇回流提取粗多酚，選擇D-101型大孔樹脂純化，分別用30%、50%、70%、90%乙醇洗脫，考察不同洗脫物的多酚含量及抗氧化抑菌活性，研究大孔吸附樹脂純化對(duì)銀杏外種皮多酚抗氧化及抑菌活性的影響。結(jié)果表明，90%乙醇洗脫物多酚含量最高，抗氧化活性最強(qiáng)。胡蘿卜汁產(chǎn)生菌的抑菌結(jié)果表明，90%乙醇洗脫物的抑菌活性明顯高于粗提物。D-101型大孔樹脂適用于銀杏外種皮多酚的初步純化。

關(guān)鍵詞：銀杏（Ginkgo biloba L.）果肉質(zhì)種皮；多酚；抗氧化；抑菌活性；大孔樹脂

中圖分類號(hào)：R931.6；R282 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2018）11-0075-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.11.018

Abstract： The total polyphenols were extracted by ethanol reflux method， and the D-101 macroporous resin was used to purify the total polyphenols to study the effect of antioxidation and antibacterial activities on polyphenols from ginkgo（Ginkgo biloba L.） fruit sarcotesta separation by macroporous adsorption resin. The macroporous adsorption resin was eluted by 30%，50%，70%，90% ethanol and to inspect the polyphenol content and the antioxidant and antibacterial activity of different elution. Results showed that 90% ethanol elution had the highest polyphenol content and the highest antioxidant activity. The results showed that the antibacterial activity of 90% ethanol elution on the bacteria from carrot juice was significantly higher than that of crude extract. D-101 macroporous resin is suitable for the preliminary purification of polyphenols from ginkgo fruit sarcotesta.

Key words： ginkgo（Ginkgo biloba L.） fruit sarcotesta；polyphenol；antioxidant；antibacterial activity；macroporous resin

隨著人們對(duì)疾病的深入研究發(fā)現(xiàn)，一些慢性疾病如心血管疾病、癌癥、衰老等均是體內(nèi)自由基失衡對(duì)機(jī)體產(chǎn)生氧化性損害，如果這種損害不能及時(shí)修復(fù)并且逐漸積累到一定程度，往往就會(huì)導(dǎo)致疾病的出現(xiàn)[1]。外源性抗氧化劑有助維持人體內(nèi)自由基的平衡。但人工合成抗氧化劑毒副作用較大，對(duì)人體肝、脾、肺等均有不利影響。通過對(duì)具有抗氧化活性的天然物質(zhì)進(jìn)行篩選，可開發(fā)出有效的抗氧化藥物和天然保健食品[2]。

天然多酚類化合物是植物體內(nèi)最豐富的次生代謝產(chǎn)物，其分子結(jié)構(gòu)中含有若干個(gè)酚羥基，研究表明多酚類化合物具有降血糖、降血脂、抗炎抗菌、抗病毒和抗癌等多種活性[3]，而且還具有較強(qiáng)的抗氧化作用和清除自由基的能力[4，5]，其多酚含量與抗氧化能力大小成正比[6，7]。銀杏（Ginkgo biloba L.）果，俗稱白果，由于其營(yíng)養(yǎng)豐富，自古以來被當(dāng)作養(yǎng)生延年的上品[8]。對(duì)銀杏葉和果的研究，尤其是對(duì)銀杏葉黃酮的研究，已取得了多項(xiàng)成果，但對(duì)銀杏外種皮的研究還較少，銀杏種子硬殼外面的肉質(zhì)部分，長(zhǎng)期以來被視為廢物丟棄，研究和實(shí)施從銀杏外種皮中提取有用的成分，充分利用銀杏副產(chǎn)物，變廢為寶，還可以解決銀杏產(chǎn)區(qū)銀杏外種皮對(duì)環(huán)境的污染[9]。本研究以沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)校園內(nèi)銀杏外種皮為材料，研究D-101型大孔吸附樹脂純化對(duì)多酚抗氧化活性的影響，為銀杏多酚天然抗氧化劑的生產(chǎn)提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

外果皮：銀杏果，2016年10月采自沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)校園內(nèi)，去核，于-25 ℃冰箱中凍存?zhèn)溆谩?/p>

試劑：D101大孔樹脂（批號(hào)：20110527）；沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)藥品生物制品定所，純度98%）；大孔樹脂（西安藍(lán)曉科技有限公司）；氯化硝基四氮唑藍(lán)（上海恒星應(yīng)用化學(xué)研究所）；核黃素（北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司）；DPPH（A Johnson Matthey Company）。

儀器：722型可見分光光度計(jì)（上海光譜儀器有限公司）；日光燈反應(yīng)箱，自制；CJ-2N超凈工作臺(tái)（哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司）；I-IPX-9272MBE電熱培養(yǎng)箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）。

1.2 方法

1.2.1 銀杏果多酚的提取 稱取銀杏外種皮，乙醇回流提取，提取2次，過濾，濾液濃縮離心，蒸干，蒸干物三氯化鐵檢測(cè)呈陽(yáng)性，得到銀杏果多酚粗提物。

1.2.2 大孔樹脂對(duì)銀杏果多酚的吸附洗脫

1）大孔樹脂預(yù)處理。準(zhǔn)確稱取一定量的D-101大孔樹脂，無(wú)水乙醇浸泡24 h，用去離子水洗去乙醇至無(wú)醇味，然后用1 mol/L的NaOH溶液浸泡24 h，去離子水洗至中性，再用1 mol/L的HCl浸泡24 h，去離子水洗至中性備用[10]。

2）靜態(tài)吸附的動(dòng)力學(xué)曲線。取處理好的D-101大孔吸附樹脂2 g裝入250 mL具塞磨口三角瓶中，加入已知濃度的粗提液50 mL，置于振蕩器中，使吸附飽和，每間隔1 h取樣，過濾，收集流出液，測(cè)定多酚含量，繪制出銀杏果多酚靜態(tài)吸附的動(dòng)力學(xué)曲線[11]。

3）不同乙醇體積分?jǐn)?shù)洗脫液及用量對(duì)多酚得率的影響。取處理好的樹脂，濕法裝柱，加入拌樣樹脂，去離子水洗脫至無(wú)色，分別用30%、50%、70%、90%乙醇洗脫，每種體積分?jǐn)?shù)乙醇洗脫1 BV后收集洗脫液，干燥，測(cè)定干燥物中多酚含量。

1.2.3 多酚含量的測(cè)定 采用福林-酚法測(cè)定多酚含量[12]。稱取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品1.000 g，用去離子水溶解并定容至1 000 mL。從中分別移取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于100 mL 容量瓶中，定容。分別吸取上述溶液1 mL，加入到10 mL容量瓶中，各加入5.0 mL 10%福林酚試劑，振搖，反應(yīng)6 min后加入4.0 mL 7.5%碳酸鈉溶液，用去離子水定容，搖勻，靜置1 h后于766 nm處測(cè)定吸光度，得到?jīng)]食子酸濃度與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。將待測(cè)物質(zhì)設(shè)置成濃度梯度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測(cè)物質(zhì)多酚含量。

1.2.4 抗氧化活性的測(cè)定 清除DPPH·活性的測(cè)定采用提取物與穩(wěn)定自由基DPPH·反應(yīng)的分析方法[13]。清除超氧自由基活性的測(cè)定采用光照核黃素體系產(chǎn)生超氧自由基法[14]。清除羥自由基活性的測(cè)定參考文獻(xiàn)[15]。還原力的測(cè)定采用鐵離子還原法（FRAP）和鐵氰化鉀還原法[16]。

1.2.5 抑菌活性的測(cè)定 取胡蘿卜汁中長(zhǎng)出的菌體于直徑9 cm牛肉膏蛋白胨平板中劃線，37 ℃活化24 h。將菌苔刮入去離子水中制成菌懸液，用微量進(jìn)樣器抽取100 μL菌懸液接入牛肉膏蛋白胨平板中，均勻涂布。將牛津杯用鑷子輕輕夾取，放置于鋪好培養(yǎng)基的平板上，再用微量定量移液器準(zhǔn)確吸取0.2 mL供試品小心移入6 mm×10 mm牛津杯中，杯中分別加入丙酮、10 mg/mL山梨酸、粗提物，大孔樹脂洗脫物各200 μL。平穩(wěn)放置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)37 ℃下培養(yǎng)16 h。待出現(xiàn)明顯抑菌圈后，量取抑菌圈直徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔樹脂最佳工藝條件的確定

2.1.1 靜態(tài)吸附的動(dòng)力學(xué)曲線 由靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線（圖1）可以看出，4 h后，吸附質(zhì)量濃度隨時(shí)間的增加變化很小，即大孔樹脂已基本達(dá)到飽和。說明大孔樹脂對(duì)銀杏果多酚的吸附屬于快速平衡型，快速吸附可縮短生產(chǎn)周期，這在工業(yè)上是有利的。

2.1.2 不同體積分?jǐn)?shù)乙醇洗脫液及用量對(duì)多酚含量的影響 將銀杏果肉質(zhì)種皮醇溶性粗提物上大孔樹脂柱，分別采用水洗，30%、50%、70%、90%乙醇進(jìn)行洗脫，每種體積分?jǐn)?shù)的乙醇洗脫1 BV后收集洗脫液，干燥，測(cè)定干燥物中多酚含量。收集各洗脫液，結(jié)果分別為水洗液無(wú)色，30%乙醇洗脫液B（乳白色），50%乙醇洗脫液C（黃色），70%乙醇洗脫液D（黃褐色），90%乙醇洗脫液D（褐色），將各洗脫液蒸干，由于水洗物和30%乙醇洗脫物含量過少，無(wú)法進(jìn)行測(cè)試，將50%、70%、90%乙醇洗脫物及粗提物進(jìn)行多酚含量和抗氧化活性測(cè)定，結(jié)果見圖2。

從圖2可以看出，50%、70%乙醇洗脫物多酚含量較少，90%乙醇洗脫物多酚含量較高。當(dāng)洗脫劑用量達(dá)到5 BV樹脂體積時(shí)，洗脫液中多酚含量已經(jīng)接近0，可認(rèn)為所用體積分?jǐn)?shù)的乙醇將大孔樹脂上的多酚已基本洗脫完全，可以停止洗脫。

2.2 大孔樹脂洗脫物抗氧化活性的測(cè)定

從圖3、圖4、圖5可以看出，大孔樹脂50%、70%、90%乙醇洗脫物對(duì)DPPH自由基、氧自由基、羥自由基均具有一定的清除能力，且90%乙醇洗脫物的清除能力明顯高于其他2種洗脫物，而且90%乙醇洗脫物的清除能力還高于乙醇粗提物，說明經(jīng)過大孔樹脂分離純化后，銀杏果肉質(zhì)種皮醇溶性提取物對(duì)自由基的清除能力得到了提高。

從圖6可知，大孔樹脂50%、70%、90%乙醇洗脫物對(duì)Fe3+均具有一定的還原能力，說明其中均含有一定的還原性物質(zhì)。各樣品對(duì)Fe3+的還原能力隨樣品量的增加而增強(qiáng)。90%乙醇洗脫物還原性最強(qiáng)，明顯高于乙醇粗提物，這也進(jìn)一步驗(yàn)證了還原力與抗氧化活性呈正相關(guān)。

2.3 大孔樹脂洗脫物對(duì)胡蘿卜汁產(chǎn)生菌的抑制作用

采用平板法考察了銀杏外種皮多酚對(duì)胡蘿卜汁中混合菌的抑制效果。從抑菌圈試驗(yàn)可以看出，丙酮、山梨酸、粗提物和90%乙醇洗脫物的抑菌圈直徑分別為0、1.6、1.3、1.6 cm。粗提物雖有抑菌作用，但大孔樹脂90%乙醇洗脫物抑菌活性明顯提高，與抑菌劑山梨酸抑菌活性相同。

3 結(jié)論

銀杏外種皮多酚抗氧活性研究結(jié)果表明，銀杏果多酚對(duì)DPPH·、超氧陰離子自由基和羥基自由基均有很強(qiáng)的清除效果，說明銀杏果多酚具有較強(qiáng)的抗氧化活性。將D-101大孔吸附樹脂應(yīng)用于銀杏外種皮多酚的吸附分離，結(jié)果所得產(chǎn)物抗氧化、抑菌活性均有提高，可用于銀杏外種皮中有效成分的富集分離。

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