解淀粉芽孢桿菌gfj-4發(fā)酵上清液及其混劑對番茄早疫病菌抑制活性研究

段海明，余　利，孫甜甜，黃偉東，余海兵

（安徽科技學(xué)院農(nóng)學(xué)院，安徽　鳳陽　233100）

番茄早疫病制約番茄生產(chǎn)[1]。該病害為茄鏈格孢菌（Alternaria solani）引起多循環(huán)病害，腐生性強(qiáng)，可隨病殘體在土壤中越冬，產(chǎn)生大量孢子隨氣流傳播，適宜條件下連年發(fā)生，一般減產(chǎn)30%，嚴(yán)重可達(dá)50%以上。研究番茄早疫病高效防治具有重要意義[2-3]。

目前，番茄早疫病主要采取化學(xué)防治為主導(dǎo)病害控制模式，但化學(xué)農(nóng)藥過量、長期反復(fù)使用導(dǎo)致生態(tài)、抗性和食品安全問題，需更新傳統(tǒng)病害防控方式，發(fā)展綠色環(huán)保防控新技術(shù)，降低化學(xué)藥劑施用量[4]。生物防治和農(nóng)藥復(fù)配增效技術(shù)為化學(xué)農(nóng)藥減量施用重要措施[5]。楊蓉等篩選對番茄早疫病有顯著抑制效果萎縮芽孢桿菌（Bacillus atrophaeus）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），其發(fā)酵液對早疫病菌絲有顯著致畸作用，相對防效達(dá)35%以上[6]。馬桂珍等采用平板對峙法和打孔法測定1株多粘類芽孢桿菌L1-9菌株和無菌發(fā)酵液，培養(yǎng)4 d抑菌帶寬分別為17.6和15.8 mm，無菌發(fā)酵液可顯著降低孢子萌發(fā)率并抑制芽管伸長[7]。楊冬靜等采用杯碟法測定枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）NJ-18菌株對番茄早疫病菌菌絲生長有強(qiáng)烈拮抗作用，培養(yǎng)濾液使菌絲腫脹畸形[8]。目前，番茄早疫病生物防治相關(guān)研究主要以室內(nèi)抑菌活性為主，由于生防菌防效慢、效果不穩(wěn)定等因素導(dǎo)致其推廣受限，難以實現(xiàn)田間大規(guī)模使用。通過查詢農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所網(wǎng)站農(nóng)藥登記數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，防治番茄早疫病農(nóng)藥混配劑研發(fā)以兩種化學(xué)殺菌劑間復(fù)配為主，微生物源活性物質(zhì)和化學(xué)殺菌劑復(fù)配劑防治番茄早疫病研究未見報道。研究其混配組合防治作物病害對化學(xué)藥劑減量增效具有重要價值[9]。

本研究對前期篩選出的一株對番茄早疫病菌有較強(qiáng)抑制活性解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefa?ciens）gfj-4，初步探究接種量、發(fā)酵培養(yǎng)時間對生防菌產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)影響及發(fā)酵上清液和脂肽粗提物抑菌活性，開展解淀粉芽孢桿菌gfj-4發(fā)酵上清液和化學(xué)殺菌劑復(fù)配研究，旨在為番茄早疫病防治提供新途徑。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1供試殺菌劑

95%苯醚甲環(huán)唑原藥、96%腈菌唑原藥分別購自山東億嘉農(nóng)化有限公司和山東聯(lián)合農(nóng)藥工業(yè)有限公司；97%咪鮮胺原藥和96%戊唑醇原藥購自山東華陽農(nóng)藥化工有限公司；96%三唑酮原藥和95%嘧菌酯原藥購自山東濰坊潤豐化工股份有限公司；95.7%丙環(huán)唑原油購自江蘇豐登作物保護(hù)股份有限公司；97.5%吡唑醚菌酯原藥購自青島瀚生生物科技股份有限公司。殺菌劑原藥采用丙酮溶解，配制1.0×104μg·mL-1母液置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2供試菌株

番茄早疫病菌（A.solani）分離純化自安徽省鳳陽縣郊區(qū)番茄早疫病典型發(fā)病葉片，分離純培養(yǎng)。解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）gfj-4于2014年9月24日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC NO:M 2014444），已獲授權(quán)國家發(fā)明專利（ZL2014107885788）。

1.1.3供試培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200.0 g，葡萄糖18.0 g，瓊脂15.0 g，去離子水1 L。

NA培養(yǎng)基：蛋白胨5.0 g，牛肉浸膏3.0 g，酵母膏1.0 g，葡萄糖10.0 g，瓊脂15.0 g，pH 7.0（可不加瓊脂制成NB培養(yǎng)基）。

1.2　方法

1.2.1解淀粉芽孢桿菌gfj-4生長曲線制作

參照文獻(xiàn)[10]方法制作菌株gfj-4生長曲線，分別以 33 ℃、120 r·min-1振蕩培養(yǎng) 3、4、6、8、10、12、14和16 h，測量菌體密度（OD600值）。

1.2.2不同接種量解淀粉芽孢桿菌gfj-4發(fā)酵上清液抑制番茄早疫病菌活性測定

解淀粉芽孢桿菌gfj-4在NA培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)48 h，挑取單菌落菌苔轉(zhuǎn)接入NB液體培養(yǎng)基中，33 ℃、120 r·min-1搖培12 h，以體積比（V/V）為10%接種量接種到NB培養(yǎng)基中，于33℃、120 r·min-1各培養(yǎng)8 h，培養(yǎng)結(jié)束以10 000 r·min-1、4℃離心10 min獲得菌體，滅菌去離子水調(diào)節(jié)菌懸液OD600=1.0作為種子液，分別以0.125%、0.25%、0.50%、0.75%、1%和2%（V/V）接種量接種到100 mL NB培養(yǎng)基，然后以33 ℃、120 r·min-1搖培72 h，10 000 r·min-1、4℃離心20 min獲取發(fā)酵上清液，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后保存于4℃冰箱備用。采用菌絲生長速率法測定發(fā)酵上清液80倍稀釋液對番茄早疫病菌抑制率，接種結(jié)束后置于26℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)168 h，每一濃度處理3皿，重復(fù)3次，十字交叉法測量菌落直徑，計算不同接種量發(fā)酵上清液病菌抑制率[11]。

1.2.3不同發(fā)酵培養(yǎng)時間發(fā)酵上清液抑制番茄早疫病菌活性測定

按照1.2.2方法獲取種子液后以0.125%（V/V）接種量接入含100 mL NB發(fā)酵培養(yǎng)基250 mL三角瓶，分別以33 ℃、120 r·min-1搖培24、48、72、84、96和120 h，10 000 r·min-1、4 ℃離心20 min，獲取發(fā)酵上清液后經(jīng)0.22 μm濾膜過濾除菌后于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。計算不同發(fā)酵培養(yǎng)時間發(fā)酵上清液對番茄早疫病菌抑制率。

1.2.4不同稀釋倍數(shù)發(fā)酵上清液對番茄早疫病菌抑制活性測定

將發(fā)酵培養(yǎng)時間為72 h發(fā)酵上清液按比例與50℃PDA培養(yǎng)基充分混勻，此時發(fā)酵上清液在PDA培養(yǎng)基中含量分別為1.56、3.13、4.17、6.25、10.0和12.5 μL·mL-1，測定不同稀釋倍數(shù)發(fā)酵上清液對番茄早疫病菌抑制活性，SPSS 13.0軟件計算發(fā)酵上清液對番茄早疫病菌EC50。

1.2.5脂肽粗提物制備及抑制活性測定

按照1.2.3方法搖培72 h離心獲得發(fā)酵上清液，參照鄧建良等脂肽粗提物制備方法，甲醇萃取3次，合并提取液備用[12]。脂肽粗提物按比例與50℃PDA培養(yǎng)基充分混勻，脂肽粗提物含量分別為0.50、0.625、0.833、1.25和2.50 μL·mL-1，測定不同稀釋倍數(shù)脂肽粗提物對番茄早疫病菌抑制活性，計算脂肽粗提液對番茄早疫病菌EC50。

1.2.68種化學(xué)殺菌劑對番茄早疫病菌室內(nèi)毒力測定

采用菌絲生長速率法測定咪鮮胺、苯醚甲環(huán)唑、丙環(huán)唑、吡唑醚菌酯、腈菌唑、戊唑醇、三唑酮和嘧菌酯8種化學(xué)殺菌劑對番茄早疫病菌抑制活性（見表1）[11]。接種完畢后置于26℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)168 h，十字交叉法測量菌落直徑。SPSS 13.0軟件計算8種化學(xué)殺菌劑毒力回歸方程、EC50、95%置信區(qū)間和R2。

1.2.7殺菌劑新型混劑毒性比率測定

采用陳福良等方法設(shè)計菌株gfj-4發(fā)酵上清液和化學(xué)殺菌劑混配試驗，以發(fā)酵上清液和不同化學(xué)殺菌劑對番茄早疫病菌EC50為基礎(chǔ)，按其EC50劑量比例分別設(shè)置0∶10、1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4，7∶3、8∶2、9∶1、10∶0計11個配比，以不加藥劑處理為對照，采用菌絲生長速率法測定各配比抑菌率和毒性比[13]。

表1　8種化學(xué)殺菌劑濃度設(shè)置Table 1　Concentration gradient of eight fungicides

2　結(jié)果與分析

2.1　解淀粉芽孢桿菌gfj-4生長曲線

由圖1可知，菌株gfj-4在3～4 h為延滯期，4～12 h為對數(shù)生長期，12～14 h為穩(wěn)定期，14 h后進(jìn)入衰退期。確定對數(shù)生長中期即培養(yǎng)8 h為后續(xù)研究種子液培養(yǎng)時間。

2.2　不同接種量種子液對解淀粉芽孢桿菌gfj-4發(fā)酵上清液抑菌活性影響

由圖2可知，隨菌株gfj-4種子液接種量增加，生防菌所產(chǎn)發(fā)酵上清液對番茄早疫病菌抑制率呈逐漸下降趨勢。接種量（V/V）為0.125%和0.25%制得發(fā)酵上清液對病菌抑制率分別達(dá)78.57%和78.52%（P＜0.05）。但接種量繼續(xù)增加，菌株所產(chǎn)發(fā)酵上清液對病菌抑制率逐步下降，當(dāng)接種量為2%時抑制率降至65.70%。

2.3　不同發(fā)酵培養(yǎng)時間對菌株gfj-4產(chǎn)發(fā)酵上清液抑制番茄早疫病菌影響

不同培養(yǎng)時間對菌株gfj-4發(fā)酵上清液抑菌活性影響見圖3。

圖1　解淀粉芽孢桿菌gfj-4生長曲線Fig.1　Growth curve of Bacillus amyloliquefaciens gfj-4

圖2　不同接種量對菌株gfj-4發(fā)酵上清液抑菌活性影響Fig.2　Effects of different inoculation amount on antifungal activity of strain gfj-4 fermentation supernatant

圖3　不同培養(yǎng)時間對菌株gfj-4發(fā)酵上清液抑菌活性影響Fig.3　Effects of different culture time on antifungal activity of strain gfj-4 fermentation supernatant

由圖3可知，隨菌株gfj-4發(fā)酵培養(yǎng)時間延長，生防菌產(chǎn)發(fā)酵代謝活性物質(zhì)對番茄早疫病菌抑制率先升后降。培養(yǎng)時間72 h時發(fā)酵上清液對病菌抑制率最大為78.50%（P＜0.05）。培養(yǎng)時間繼續(xù)增加，所產(chǎn)發(fā)酵上清液對病菌抑制率下降，培養(yǎng)時間為120 h時抑制率降至64.54%。

2.4　不同稀釋倍數(shù)發(fā)酵上清液對番茄早疫病菌抑制活性的影響

由表2可知，解淀粉芽孢桿菌gfj-4發(fā)酵上清液濃度由1.56 μL·mL-1增至12.5 μL·mL-1，接種番茄早疫病菌培養(yǎng)168 h對病菌抑制率由22.0%增至78.6%，高濃度發(fā)酵液抑制效果較好。SPSS 13.0軟件分析得出發(fā)酵上清液對番茄早疫病菌EC50為3.774 μL·mL-1（R2=0.94）。經(jīng)解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵上清液處理番茄早疫病菌絲擴(kuò)展緩慢，生長稀疏，發(fā)酵上清液EC80濃度處理菌絲與對照相比可知，對照菌絲光滑，生長點(diǎn)較多，處理菌絲呈現(xiàn)扭曲、散亂的畸形狀，原生質(zhì)濃縮，出現(xiàn)色素沉積（見圖4）。

表2　不同稀釋倍數(shù)發(fā)酵上清液對番茄早疫病菌抑制率Table 2　Inhibition rate of different dilution times of B.amyloliquefaciens fermentation supernatant to A.solani

圖4　不同稀釋倍數(shù)發(fā)酵上清液對番茄早疫病菌抑制效果Fig.4　Inhibitory effect of different dilution times of B.amyloliquefaciens gfj-4 fermentation supernatant to A.solani

2.5　不同稀釋倍數(shù)脂肽粗提物對番茄早疫病菌抑制活性的影響

由表3和圖5可知，脂肽粗提物濃度由0.50 μL·mL-1增至2.5 μL·mL-1，接種番茄早疫病菌培養(yǎng)168 h對病菌抑制率由39.1%增至62.8%，經(jīng)SPSS 13.0軟件分析得脂肽粗提物對番茄早疫病菌EC50為0.943 μL·mL-1（R2=0.94）。與對照相比可知，經(jīng)解淀粉芽孢桿菌gfj-4產(chǎn)脂肽粗提物處理番茄早疫病菌絲擴(kuò)展緩慢，高濃度發(fā)酵脂肽粗提物處理使菌絲顏色轉(zhuǎn)變?yōu)樯詈稚?。脂肽粗提液EC80濃度處理菌絲與對照相比可知，對照菌絲光滑、生長點(diǎn)多，處理菌絲顏色加深，表面粗糙，呈串珠狀腫脹，菌絲原生質(zhì)濃縮，色素沉積較多，部分菌絲頂端和中部出現(xiàn)膨大囊泡。

表3　不同稀釋倍數(shù)脂肽粗提物對番茄早疫病菌抑制率Table 3　Inhibition rate of different dilution times of lipopeptide crude extract to A.solani

圖5　不同稀釋倍數(shù)脂肽粗提液對番茄早疫病菌抑制效果Fig.5　Inhibitory effect of different dilution times of lipopeptide crude extract to A.solani

2.6　8種化學(xué)殺菌劑對番茄早疫病菌抑制活性測定

結(jié)果見表4。

由表4可知，番茄早疫病菌對咪鮮胺、苯醚甲環(huán)唑和丙環(huán)唑敏感性較高。其中，咪鮮胺對番茄早疫病菌抑制活性最高，EC50達(dá)0.095 μg·mL-1；其次為吡唑醚菌酯和腈菌唑?qū)Σ【鶨C50分別為2.910和3.230 μg·mL-1。番茄早疫病菌對戊唑醇為中度敏感水平，EC50為11.762 μg·mL-1。三唑酮和嘧菌酯對病菌抑制活性較差，EC50分別為42.833和112.403 μg·mL-1。

表4　8種化學(xué)殺菌劑對番茄早疫病菌毒力測定Table 4　Toxicity levels of eight chemical fungicides to A.solani

2.7　解淀粉芽孢桿菌gfj-4發(fā)酵上清液與化學(xué)殺菌劑復(fù)配組合毒性比測定

由表5～8可知，解淀粉芽孢桿菌gfj-4發(fā)酵上清液和4種麥角甾醇生物合成抑制劑咪鮮胺、苯醚甲環(huán)唑、丙環(huán)唑和腈菌唑以一定比例復(fù)配對番茄早疫病菌抑制活性主要表現(xiàn)為拮抗作用。

表5　解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵上清液與咪鮮胺復(fù)配對番茄早疫病菌毒性比Table 5　Toxicity ratio of B.amyloliquefaciens fermentation supernatant and prochloraz to A.solani

表6　解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵上清液與苯醚甲環(huán)唑復(fù)配對番茄早疫病菌毒性比Table 6　Toxicity ratio of B.amyloliquefaciens fermentation supernatant and difenoconazole to A.solani

表7　解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵上清液與丙環(huán)唑復(fù)配對番茄早疫病菌毒性比Table 7　Toxicity ratio of B.amyloliquefaciens fermentation supernatant and propiconazole to A.solani

表8　解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵上清液與腈菌唑復(fù)配對番茄早疫病菌毒性比Table 8　Toxicity ratio of B.amyloliquefaciens fermentation supernatant and myclobutanil to A.solani

由表9可知，發(fā)酵上清液和戊唑醇混配主要表現(xiàn)為相加作用，其中以1:9比例混配毒性比最高為1.15。

由表10可知，發(fā)酵上清液和三唑酮混配在發(fā)酵上清液含量較高時主要表現(xiàn)為相加作用，而發(fā)酵上清液含量較低時主要表現(xiàn)為拮抗作用，其中以6:4比例混配毒性比最高為1.15。

由表11可知，發(fā)酵上清液和吡唑醚菌酯混配時主要表現(xiàn)為相加和增效作用，毒性比率均＞1，其中以8:2比例混配毒性比最高，達(dá)1.26。

由表12可知，發(fā)酵上清液占比較高時和嘧菌酯混配主要表現(xiàn)為增效和相加作用，其中以9:1比例混配毒性比最高，達(dá)1.26；而發(fā)酵上清液含量較低時（2∶8和1∶9）混配毒性比＜1，表現(xiàn)為拮抗作用。

表9　解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵上清液與戊唑醇復(fù)配對番茄早疫病菌毒性比Table 9　Toxicity ratio of B.amyloliquefaciens fermentation supernatant and tebuconazole to A.solani

表10　解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵上清液與三唑酮復(fù)配對番茄早疫病菌毒性比Table 10　Toxicity ratio of B.amyloliquefaciens fermentation supernatant and triadimefon to A.solani

表11　解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵上清液與吡唑嘧菌酯復(fù)配對番茄早疫病菌毒性比Table 11　Toxicity ratio of B.amyloliquefaciens fermentation supernatant and pyraclostrobin to A.solani

表12　解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵上清液與嘧菌酯復(fù)配對番茄早疫病菌毒性比Table 12　Toxicity ratio of B.amyloliquefaciens fermentation supernatant and azoxystrobin to A.solani

3　討論與結(jié)論

茄鏈格孢菌（A.solani）可侵染番茄葉、果實和莖稈等，嚴(yán)重時引起落葉和果實腐爛，且產(chǎn)生鏈格孢毒素，危害人體健康[15]。傳統(tǒng)化控方法增強(qiáng)病原菌抗性，降低番茄品質(zhì)和產(chǎn)量，污染環(huán)境[16]。因此，開展番茄早疫病生物防治和新型混配劑研究十分必要[17-18]。

何建清等分離到一株腐生鏈霉菌（Streptomyces saprophyticus），其發(fā)酵液5倍稀釋液在活體植株上對番茄早疫病有生防作用，防效為70.9%[19]。高偉等研究表明，海洋芽胞桿菌（Bacillus marinus）B-9987活菌液對茄鏈格孢菌最低抑菌濃度均為4 μL·mL-1[20]。任璐等測定植物內(nèi)生細(xì)菌yc8發(fā)酵液對番茄早疫病孢子萌發(fā)有較強(qiáng)抑制作用，EC50為4.22%，對菌絲生長亦有一定抑制作用，yc8發(fā)酵液處理的孢子與芽管交接處呈不正常腫大，發(fā)酵液處理后可致病原菌胞內(nèi)物質(zhì)外泄和細(xì)胞壁崩潰[21]。張曉琴等從西洋參種植土壤中分離獲得一株枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），采用杯碟法測定其對番茄早疫病抑制率達(dá)82.2%，培養(yǎng)濾液可導(dǎo)致番茄早疫病菌絲畸變、枯萎或者斷裂，阻礙菌絲生長[22]。

研究發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌gfj-4制得發(fā)酵上清液對番茄早疫病菌EC50為3.774 μL·mL-1，抑菌效果更強(qiáng)，從生防菌發(fā)酵上清液中提取的脂肽類物質(zhì)對病菌抑制活性進(jìn)一步提升，EC50達(dá)0.943 μL·mL-1。脂肽類物質(zhì)誘導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)膜成孔和離子通道形成，破壞膜完整性、擾亂膜滲透性而起抑菌作用，對植物病原真菌拮抗活性良好，利用價值較高，作為“綠色農(nóng)藥”在植物保護(hù)中已引起關(guān)注[23]。微生物源殺菌劑雖然低毒、無污染，但同時存在防治效果不穩(wěn)定、防治譜較窄等缺點(diǎn)，將拮抗微生物次級代謝產(chǎn)物與化學(xué)殺菌劑相結(jié)合篩選增效組合，對拓寬微生物源殺菌劑使用范圍具有重要意義[24-25]。

研究篩選的解淀粉芽孢桿菌gfj-4發(fā)酵上清液和嘧菌酯、吡唑醚菌酯混配組合對番茄早疫病菌表現(xiàn)較強(qiáng)增效作用，可能是發(fā)酵液中含抑菌活性物質(zhì)與甲氧丙烯酸酯類殺菌劑抑菌機(jī)制不同導(dǎo)致[26]。發(fā)酵活性物質(zhì)和上述兩種化學(xué)殺菌劑混配組合開發(fā)，有待后續(xù)深入研究。