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    不同植物生長調(diào)節(jié)劑對藍(lán)果忍冬葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響

    2018-07-10 03:30:04霍俊偉薛曉曉劉慶帥劉化禹謝佳璇孫小娟員盎然
    關(guān)鍵詞:調(diào)節(jié)劑培養(yǎng)基誘導(dǎo)

    霍俊偉,薛曉曉,秦 棟,劉慶帥,劉化禹,謝佳璇,孫小娟,員盎然,陶 韜

    (東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院,哈爾濱 150030)

    藍(lán)果忍冬(Lonicera caerulea L.)為忍冬科(Capri?foliaceae)忍冬屬(Lonicera)小漿果,俗稱藍(lán)靛果,我國大小興安嶺、長白山山區(qū)野生資源豐富[1]。果實富含花色苷類、黃酮類及多酚類等生物活性物質(zhì),氨基酸、糖類、有機酸、礦物質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì),具有較高營養(yǎng)和醫(yī)療保健價值[2],可預(yù)防癌癥、心血管、糖尿病等疾病[3]。

    實際生產(chǎn)中藍(lán)果忍冬品種相對單一,缺乏優(yōu)質(zhì)苗木,難以滿足市場需求,提高育種效率,培育具有不同特點新品種,建立藍(lán)果忍冬組培快繁體系尤為必要。以離體再生技術(shù)為基礎(chǔ)的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)可提高育種效率,拓寬育種途徑,加快苗木繁育。愈傷組織誘導(dǎo)是建立離體再生體系必要步驟,也是研究藍(lán)果忍冬活性成分基礎(chǔ)。

    目前,藍(lán)果忍冬組織培養(yǎng)和離體再生方面研究主要包括兩方面:一是以帶芽莖段、腋芽、莖尖等為外植體建立組培快繁體系,探索各培養(yǎng)階段適合生長調(diào)節(jié)劑比例、合適基本培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件等[4-5]。二是以莖段和葉片誘導(dǎo)愈傷組織建立再生體系[6-7]。

    植物生長調(diào)節(jié)劑可影響外植體內(nèi)源激素水平,促進(jìn)離體器官生長和愈傷組織形成[8]。忍冬屬植物愈傷組織誘導(dǎo)可用BA、KT、IAA、NAA、2,4-D等,如單獨添加2,4-D各處理均可誘導(dǎo)金銀花葉片產(chǎn)生愈傷組織,以1.0 mg·L-1最佳,添加KT可改善愈傷組織狀態(tài),提高誘導(dǎo)率,不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MB+2.0 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1IBA[9]。細(xì)胞分裂素和生長素配合使用可有效誘導(dǎo)產(chǎn)生多種植物愈傷組織,但細(xì)胞分裂素濃度不易過高。MS培養(yǎng)基添加1.0 mg·L-1NAA和0.1 mg·L-16-BA可誘導(dǎo)藍(lán)果忍冬莖尖、莖段、葉片產(chǎn)生愈傷組織,誘導(dǎo)率最高達(dá)86.7%[6-7]。4.4 μmol·L-16-BA與2.26 μmol·L-12,4-D配比可有效誘導(dǎo)灰毛氈忍冬葉片產(chǎn)生愈傷組織,誘導(dǎo)率達(dá)86.7%[10]。CPPU、TDZ、ZT也廣泛應(yīng)用于愈傷組織誘導(dǎo)[11],均具有高活性,誘導(dǎo)效率較高。CPPU在誘導(dǎo)苧麻產(chǎn)生愈傷組織時活性高于6-BA,再生效率更高[11]。非洲菊葉片愈傷組織誘導(dǎo)選用2 mg·L-1TDZ結(jié)合0.05 mg·L-12,4-D,培養(yǎng)15 d出愈率達(dá)80%以上,愈傷組織增殖培養(yǎng)則減小TDZ濃度[12]。TDZ也有負(fù)面作用,TDZ添加使花楸外植體褐化[13]。ZT是天然植物激素,可用于藍(lán)莓組培快繁與再生[14]。此外KT、TDZ、ZT、6-BA等細(xì)胞分裂素相互組合再結(jié)合生長素類對某些植物誘導(dǎo)效果良好,6-BA 0.3 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1基礎(chǔ)上添加KT 0.2 mg·L-1有利于江南牡丹莖段愈傷組織分化[15]。MS+BA 1.0 mg·L-1+KT 0.5 mg·L-1有利于紅掌葉片愈傷組織分化[16]。

    本文針對藍(lán)果忍冬組培快繁技術(shù)選擇不同消毒條件組合探討組培成活率[17],藍(lán)果忍冬愈傷組織誘導(dǎo)中未見使用CPPU、TDZ、ZT及幾種生長調(diào)節(jié)劑組合處理,不同生長調(diào)節(jié)劑對藍(lán)果忍冬葉片愈傷組織誘導(dǎo)影響未見報道。

    本試驗選用兩個引自俄羅斯藍(lán)果忍冬鮮食品種為試材,通過培養(yǎng)無菌苗,采取葉片,添加一種和多種生長調(diào)節(jié)劑誘導(dǎo)葉片愈傷組織,以期為藍(lán)果忍冬葉片再生體系建立奠定基礎(chǔ),為組培快繁研究提供科學(xué)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料及培養(yǎng)

    試驗于2017~2018年在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院完成,以兩個引自俄羅斯鮮食品種邱雷姆和娜雷姆為試材,MS培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)30 d,取無菌苗中上部葉片,接種時在葉片正面橫切形成劃痕,葉片背面接觸培養(yǎng)基,接種到添加蔗糖30 g·L-1,瓊脂7 g·L-1,pH 5.8,附加不同生長調(diào)節(jié)劑MS培養(yǎng)基,于人工氣候室暗培養(yǎng)相應(yīng)時間后轉(zhuǎn)移至光下培養(yǎng),培養(yǎng)40 d。暗培養(yǎng)條件為濕度75%,溫度(25±1)℃。

    1.2 試驗處理及方法

    1.2.1單一植物生長調(diào)節(jié)劑誘導(dǎo)葉片愈傷組織

    以兩品種無菌苗葉片為材料,以MS為基本培養(yǎng)基,選用6-BA、2,4-D、TDZ、ZT和CPPU 5種激素設(shè)計單因素試驗,濃度均為0.5、1.0、2.0 mg·L-1。暗處理15 d后置于光下培養(yǎng)。葉片經(jīng)培養(yǎng)基培養(yǎng)40 d后觀察愈傷組織誘導(dǎo)情況。

    1.2.2兩種植物生長調(diào)節(jié)劑組合誘導(dǎo)葉片愈傷組織

    選用6-BA和2,4-D激素組合,TDZ和ZT激素組合,設(shè)計兩個復(fù)因素試驗:暗處理15 d后置于光下培養(yǎng)。葉片在培養(yǎng)基培養(yǎng)40 d后觀察愈傷組織誘導(dǎo)情況。

    6-BA設(shè)2個水平:1.0、2.0 mg·L-1;2,4-D設(shè)3個水平:0.2、0.5、1.0 mg·L-1設(shè)計6個水平組合完全隨機試驗。TDZ設(shè)2個水平:1.0、2.0 mg·L-1;ZT設(shè)3個水平:0.1、0.3、1.0 mg·L-1設(shè)計6個水平組合完全隨機試驗。

    1.2.33種植物生長調(diào)節(jié)劑組合誘導(dǎo)葉片愈傷組織

    MS培養(yǎng)基中添加6-BA(0.5、1.0、1.5 mg·L-1),IBA(0.1、0.2、0.3 mg·L-1)和KT(0.5、1.0、1.5 mg·L-1),采用3因素3水平正交設(shè)計,按照L9(34)前3列安排試驗,共9個處理組合(見表1)。暗處理35 d,統(tǒng)計出愈率,褐化率,觀察愈傷組織狀態(tài)。

    1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與處理

    出愈率(%)=愈傷組織數(shù)/外植體數(shù)×100%,褐化率(%)=褐化葉片數(shù)/外植體數(shù)×100%。

    所有試驗均重復(fù)3次,數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析及作圖采用SPSS 19.0和Excel 2007軟件。

    表1 藍(lán)果忍冬葉片愈傷組織誘導(dǎo)正交設(shè)計Table 1 Orthogonal design of the blue honeysuckle leaves callus induction (mg·L-1)

    2 結(jié)果與分析

    2.1 單一植物生長調(diào)節(jié)劑對葉片愈傷組織誘導(dǎo)影響

    添加不同單一生長調(diào)節(jié)劑對藍(lán)果忍冬葉片愈傷組織誘導(dǎo)效果不同。2,4-D、ZT、CPPU誘導(dǎo)葉片產(chǎn)生愈傷組織,但添加6-BA和TDZ無法誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織(數(shù)據(jù)未列出);2,4-D、ZT、CPPU可誘導(dǎo)葉片產(chǎn)生愈傷組織,但出愈率和愈傷組織顏色、質(zhì)地等差異較大(見表2~4,圖1)。

    3種調(diào)節(jié)劑中以2,4-D誘導(dǎo)效果最好,邱蕾姆和娜蕾姆出愈率均達(dá)90%以上,當(dāng)2,4-D濃度達(dá)1.0 mg·L-1以上時,出愈率達(dá)100%;ZT和CPPU誘導(dǎo)率較低,ZT處理僅誘導(dǎo)邱雷姆出現(xiàn)少量愈傷組織,濃度2.0 mg·L-1處理下,邱雷姆葉片出愈率僅為13%,且愈傷組織呈黃色或棕褐色(見圖1I~L),量極少,易褐化,污染嚴(yán)重,娜雷姆無愈傷組織產(chǎn)生且褐化污染嚴(yán)重。CPPU處理組誘導(dǎo)效果稍優(yōu)于ZT處理,邱雷姆0.5、2.0 mg·L-1處理均可產(chǎn)生愈傷組織,出愈率分別為15%、21%,娜雷姆僅2.0 mg·L-1時有愈傷組織出現(xiàn),出愈率為15%,同樣量少易褐化,污染嚴(yán)重。3種調(diào)節(jié)劑相比,ZT和CPPU啟動葉片產(chǎn)生愈傷組織時間長,出愈率低且有褐化和污染現(xiàn)象,不適合作藍(lán)果忍冬葉片愈傷組織誘導(dǎo)劑。

    2,4-D誘導(dǎo)愈傷組織形態(tài)復(fù)雜。接種一周劃痕處出現(xiàn)顆粒狀突起,愈傷啟動,接種10 d葉片劃痕處形成淡黃色透明愈傷組織(見圖1A)。隨后5 d暗培養(yǎng),愈傷組織快速增大,將愈傷組織轉(zhuǎn)移至光周期16 h/8 h光下培養(yǎng),愈傷組織漸漸轉(zhuǎn)綠,部分愈傷組織質(zhì)地變硬,部分愈傷組織顏色變?yōu)橄≤浖t棕色(見圖1B~H)。隨2,4-D濃度升高,邱雷姆愈傷量先增后減,娜雷姆愈傷量先減后增(見表2)。

    從愈傷量比較,邱雷姆2,4-D濃度1.0 mg·L-1時誘導(dǎo)效果最佳,娜雷姆2,4-D濃度2.0 mg·L-1時誘導(dǎo)效果最佳。若考慮愈傷組織后續(xù)再生芽誘導(dǎo)培養(yǎng),則娜雷姆選2,4-D濃度0.5 mg·L-1時較好,此濃度下愈傷組織致密緊實,呈顆粒狀,有利于不定芽再生。

    2.2 添加兩種植物生長調(diào)節(jié)劑對葉片愈傷組織誘導(dǎo)影響

    由圖2、表5、6可知,不同生長調(diào)節(jié)劑組合對藍(lán)果忍冬葉片愈傷組織誘導(dǎo)效果不同。6-BA與2,4-D各組合均可有效誘導(dǎo)葉片產(chǎn)生愈傷組織,但TDZ和ZT組合誘導(dǎo)率極低,僅邱雷姆出現(xiàn)少量愈傷且呈黃棕色,易褐化(見圖2J)。

    6-BA與2,4-D組合各處理誘導(dǎo)率均可達(dá)100%,且愈傷組織多呈綠色、黃綠色、深綠色或淡黃色,表面有瘤狀突起,顆粒狀,質(zhì)地緊實,愈傷量多,愈傷組織生長快,無褐化(見圖2A~F)。這與單獨添加2,4-D誘導(dǎo)的愈傷組織有差異,可能是細(xì)胞分裂素與生長素相互作用結(jié)果。各處理愈傷量略有差異,當(dāng)6-BA濃度為1.0 mg·L-1時,邱雷姆葉片愈傷量隨2,4-D濃度升高而增多,娜雷姆愈傷量則先增后減,2,4-D濃度0.5 mg·L-1時愈傷量達(dá)最多,但少于邱雷姆。6-BA濃度為2.0 mg·L-1時,兩品種均在2,4-D濃度0.5 mg·L-1時達(dá)最大愈傷量。各處理娜雷姆愈傷量少于邱雷姆,原因是品種差異所致。

    表2 2,4-D對葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響Table 2 Effect of 2,4-D on callus induction of leaf

    表3 ZT對葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響Table 3 Effect of ZT on callus induction of leaf

    表4 CPPU對葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響Table 4 Effect of CPPU on callus induction of leaf

    圖1 2,4-D、ZT、CPPU誘導(dǎo)的葉片愈傷組織Fig.1 Leaf callus induced by 2,4-D,ZT and CPPU

    表5 6-BA與2,4-D組合對葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響Table 5 Effect of combination of growth regulators(6-BA,2,4-D)on callus induction of leaf

    表6 TDZ與ZT組合對葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響Table 6 Effect of combination of growth regulators(TDZ,ZT)on callus induction of leaf

    圖2 兩種生長調(diào)節(jié)劑組合誘導(dǎo)的愈傷組織Fig.2 Leaf callus induced by a combination of two growth regulators

    2.3 添加3種植物生長調(diào)節(jié)劑對葉片愈傷組織誘導(dǎo)影響

    3種調(diào)節(jié)劑6-BA、IBA、KT的9種組合處理對藍(lán)果忍冬不同品種葉片愈傷組織誘導(dǎo)效果不同(見表7),方差分析表明,影響邱雷姆葉片愈傷組織誘導(dǎo)主次因素為IBA>6-BA>KT,影響娜雷姆葉片愈傷組織誘導(dǎo)主次因素為KT>IBA>6-BA(見表8~9)。兩品種存在差異,可能與不同品種對細(xì)胞分裂素敏感性有關(guān)。MS+6-BA 1.0 mg·L-1+IBA 0.3 mg·L-1+KT 0.5 mg·L-(1處理6)對兩品種誘導(dǎo)率均達(dá)95%以上,可作為通用體系。

    3種調(diào)節(jié)劑組合各處理誘導(dǎo)的愈傷組織形態(tài)基本相同,均為黃色顆粒狀,質(zhì)地較硬(見圖3)。結(jié)合表7和圖3,從誘導(dǎo)率、愈傷量或褐化比較,邱雷姆誘導(dǎo)效果均好于娜雷姆,可能與品種差異有關(guān)。

    表7 6-BA、IBA、KT組合對葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響Table 7 Effect of combination of growth regulators(6-BA,IBA,KT)on callus induction

    表8 娜雷姆葉片愈傷誘導(dǎo)率結(jié)果方差分析Table 8 ANOVE analysis result of leaf callus induction rate in Nareim

    表9 邱雷姆葉片愈傷誘導(dǎo)率結(jié)果方差分析Table 9 ANOVE analysis result of leaf callus induction rate in Qiuleimu

    圖3 3種生長調(diào)節(jié)劑組合誘導(dǎo)的愈傷組織Fig.3 Leaf callus induced by a combination of three growth regulators

    2.4 3種不同添加方式對藍(lán)果忍冬葉片愈傷組織誘導(dǎo)比較

    通過圖1~3愈傷組織形態(tài)對比及表2、5、7數(shù)據(jù)對比,不同方法愈傷組織誘導(dǎo)效果不同。添加單一生長調(diào)節(jié)劑,2,4-D是誘導(dǎo)藍(lán)果忍冬葉片產(chǎn)生愈傷組織最有效物質(zhì),濃度范圍0.5~2.0 mg·L-1均有效,6-BA、TDZ、ZT、CPPU效果較差。

    添加兩種調(diào)節(jié)劑處理優(yōu)于單一調(diào)節(jié)劑處理,2,4-D處理各濃度下出愈率均為100%,但愈傷組織質(zhì)地多為淡黃色或綠色水漬狀,較軟,而2,4-D和6-BA配合處理下愈傷組織顏色多為綠色顆粒狀,質(zhì)地緊實致密,有利于后期培養(yǎng)和不定芽誘導(dǎo),且愈傷量高于2,4-D單獨處理。

    6-BA、IBA、KT3種調(diào)節(jié)劑組合誘導(dǎo)率低于2,4-D和6-BA組合處理,且愈傷啟動時間長,愈傷組織生長緩慢,該方案兩個品種誘導(dǎo)效果差異較大,娜雷姆誘導(dǎo)率低,最低為處理4(59%),結(jié)果見表7。愈傷量很少且褐化率高(見圖3F),邱雷姆愈傷量較多(見圖3A~C),與單獨添加2,4-D及添加6-BA和2,4-D組合處理誘導(dǎo)的愈傷量相當(dāng),但質(zhì)地更為緊實,相反6-BA和2,4-D組合處理則更加松脆(見圖2~3)。

    3 討論

    早熟禾種子單獨添加2,4-D即可誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織,1.0~2.0 mg·L-1誘導(dǎo)效果較好[18],0.1或0.2 mg·L-12,4-D與3 mg·L-16-BA組合誘導(dǎo)效果明顯優(yōu)于2,4-D單獨處理。本試驗結(jié)果表明,邱雷姆和娜雷姆分別在2,4-D濃度1.0和2.0 mg·L-1時誘導(dǎo)效果最佳,且6-BA與2,4-D組合處理優(yōu)于2,4-D單獨處理。與丁路明等研究結(jié)果類似。

    一般高濃度2,4-D不利于愈傷組織誘導(dǎo)分化[19],黑果枸杞愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+2,4-D 2.0 mg·L-1+6-BA 0.5 mg·L-1,愈傷組織分化培養(yǎng)基為MS+2,4-D 1.0 mg·L-1+6-BA 0.5 mg·L-1,即低濃度2,4-D利于分化[20],本研究結(jié)果表明,娜雷姆在2,4-D濃度0.5 mg·L-1時,愈傷組織更為致密,有利于愈傷組織進(jìn)一步分化。單獨使用6-BA無法誘導(dǎo)杜仲葉片產(chǎn)生愈傷組織,6-BA與生長素NAA配合使用可誘導(dǎo)產(chǎn)生較好愈傷組織[21]。本研究結(jié)果表明,單獨添加6-BA時葉片愈傷組織誘導(dǎo)率為0,但與生長素2,4-D結(jié)合效果較好,表明細(xì)胞分裂素類和生長素類配合使用愈傷組織誘導(dǎo)效果更好。

    單獨添加細(xì)胞分裂素6-BA、TDZ、CPPU均可誘導(dǎo)毛桃葉片產(chǎn)生愈傷組織[22]。1.0 mg·L-1ZT可誘導(dǎo)矮叢藍(lán)莓莖段直接器官再生,5.0 mg·L-1ZT可誘導(dǎo)外植體通過愈傷組織途徑再生[14]。本研究結(jié)果表明,CPPU、TDZ、ZT雖然活性較高,但對藍(lán)果忍冬葉片愈傷組織誘導(dǎo)效果不佳,可能與物種不同有關(guān)。本研究表明該組合效果較差,不適于藍(lán)果忍冬離體誘導(dǎo)及再生。

    曹磊等研究表明,在6-BA與生長素NAA組合基礎(chǔ)上添加KT,金鐵鎖帶芽莖段出愈率和芽叢分化率均高達(dá)100%[23]。本研究采用6-BA、2,4-D、KT組合處理時兩品種誘導(dǎo)率均達(dá)60%以上,且邱雷姆在大部分處理下誘導(dǎo)率為100%,說明KT對藍(lán)果忍冬愈傷組織誘導(dǎo)效果顯著。

    利用葉片作愈傷組織誘導(dǎo)具有取材廣,效率高等特點,提高苗木快繁效率,是離體再生體系建立基礎(chǔ)。本試驗探討不同生長調(diào)節(jié)劑對葉片愈傷組織的誘導(dǎo),由愈傷組織到可實際應(yīng)有的完整植株,還需經(jīng)愈傷組織分化不定芽及生根培養(yǎng)、煉苗移栽等多個環(huán)節(jié)。

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