熱休克預(yù)處理骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)化療性卵巢早衰的療效觀察

陳小瑩，李欣然，王清，汪慶如，付霞霏

隨著化療藥物在惡性腫瘤、自身免疫性疾病中的廣泛應(yīng)用，相關(guān)疾病患者的生存期明顯延長(zhǎng)，但同時(shí)也使其中的女性患者面臨著化療藥物所致卵巢早衰引起的低雌激素癥狀及不孕等問(wèn)題[1-2]。近年來(lái)，隨著干細(xì)胞移植的興起及深入研究，化療性卵巢早衰的治療取得了一定進(jìn)展。臨床研究表明，干細(xì)胞移植能有效治療心肌梗死等損傷性疾病[3]，恢復(fù)損傷組織、器官的功能。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究也表明，間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)移植能部分恢復(fù)化療藥物所致的卵巢損傷[4]。但是干細(xì)胞移植的治療效果并沒(méi)有達(dá)到預(yù)期，移植后細(xì)胞丟失是其主要原因，如何提高移植細(xì)胞的存活率是提高療效的關(guān)鍵所在。熱休克預(yù)處理作為一種提高細(xì)胞抗凋亡能力的有效方法得到深入研究，有文獻(xiàn)報(bào)道其可通過(guò)上調(diào)熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)如HSP27、HSP70的表達(dá)來(lái)提高細(xì)胞的抗凋亡能力[5-6]。本研究建立了化療性卵巢早衰大鼠模型，并對(duì)其進(jìn)行了熱休克預(yù)處理后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)移植，檢測(cè)移植后大鼠卵巢結(jié)構(gòu)和內(nèi)分泌功能的變化，以探討熱休克預(yù)處理BMSCs在化療性卵巢早衰中的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 Wistar大鼠BMSCs及其完全培養(yǎng)基購(gòu)自中國(guó)廣州賽業(yè)生物科技有限公司，胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，Cell Count Kit-8 (CCK-8)試劑盒購(gòu)自日本Dojindo公司，PBS緩沖液購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司，CM-Dil標(biāo)記液購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 125只近交系SPF級(jí)Wistar雌性大鼠(體重180～200g)，另5只4～5周齡雌性Wistar大鼠(體重80～100g)用于分離培養(yǎng)BMSCs，均購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào)：SYXK(粵)2011-0074]。

1.3 BMSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定 無(wú)菌條件下分離大鼠雙側(cè)股骨及脛骨，用剪刀從中間剪斷股骨及脛骨，用注射器抽取適量含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)液反復(fù)沖洗骨髓腔至髓腔變白，用完全培養(yǎng)液調(diào)節(jié)將所得細(xì)胞濃度為約1×109/ml后直接接種于25cm2塑料透氣培養(yǎng)瓶中。將培養(yǎng)瓶放置在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，48h后觀察到有少量細(xì)胞貼壁后半量更換細(xì)胞生長(zhǎng)液，以后每2～3d全量更換新鮮培養(yǎng)液，待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶約80%時(shí)可進(jìn)行1:2傳代，用0.25%胰酶消化，以5×104/ml細(xì)胞濃度傳代擴(kuò)增。取第3代BMSCs，制成單細(xì)胞懸液，采用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞表面標(biāo)志CD44、CD45、CD29、CD34進(jìn)行鑒定。選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第3代BMSCs進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4 熱休克預(yù)處理BMSCs 細(xì)胞貼壁狀態(tài)下，將培養(yǎng)瓶用封口膜封口，再用塑料袋密封整個(gè)培養(yǎng)瓶。將整個(gè)培養(yǎng)瓶置于42℃恒溫水浴箱水浴1h，取下塑料袋及封口膜，更換新鮮培養(yǎng)液，放置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)48h。

1.5 CM-Dil標(biāo)記熱休克BMSCs BMSCs熱休克處理后48h制成細(xì)胞懸液，按最終濃度4μg/ml加入適量1mg/ml的CM-Dil儲(chǔ)存液，37℃培養(yǎng)箱中孵育30min后，1000r/min離心5min，棄去上清液，PBS洗2次。

1.6 動(dòng)物分組及處理 實(shí)驗(yàn)前對(duì)大鼠進(jìn)行陰道涂片，選取具有正常動(dòng)情周期的大鼠納入實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前剪尾取血1ml，離心后收集血清，于–80℃保存，同批檢測(cè)性激素雌二醇(estrogen，E2)、卵泡刺激素(follicule-stimulating hormone，F(xiàn)SH)水平，并了解基礎(chǔ)內(nèi)分泌水平。

大鼠隨機(jī)分為5組：正常對(duì)照組(不注射藥物)、模型組、假手術(shù)組、BMSCs組、熱休克BMSCs組，每組25只。除正常對(duì)照組外，其余4組建立化療性卵巢早衰動(dòng)物模型，建模方案為在給予環(huán)磷酰胺首次負(fù)荷劑量50mg/kg腹腔注射后，以8mg/(kg·d)的劑量連續(xù)腹腔注射14d[7]。在建模結(jié)束后第1天，BMSCs組雙側(cè)卵巢各注射含有1×l06個(gè)BMSCs的20μl細(xì)胞懸液，熱休克BMSCs組雙側(cè)卵巢各注射含有1×l06個(gè)熱休克預(yù)處理BMSCs的20μl細(xì)胞懸液，假手術(shù)組則雙側(cè)卵巢各注射20μl生理鹽水。移植時(shí)以2%戊巴比妥鈉0.025ml/10g劑量進(jìn)行腹腔注射麻醉大鼠，無(wú)菌條件下開(kāi)腹直接注射移植至雙側(cè)卵巢。

1.7 觀察指標(biāo) 移植后第1、15、30、45、60天所有大鼠在發(fā)情間期采血留取血清，且各組各時(shí)間點(diǎn)分批處死大鼠5只，留取卵巢標(biāo)本。

1.7.1 大鼠陰道涂片觀察動(dòng)情周期變化 每天早上8:00進(jìn)行陰道涂片，自然風(fēng)干后滴加適量亞甲藍(lán)染液，經(jīng)1～2min后用水漂洗，自然干燥后置于顯微鏡下觀察。

1.7.2 血清E2、FSH檢測(cè) 用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)血清E2、FSH水平，按試劑盒說(shuō)明書操作。

1.7.3 卵泡計(jì)數(shù) 卵巢組織常規(guī)進(jìn)行石蠟包埋，切片(5μm)，取每第12張石蠟切片進(jìn)行HE染色計(jì)算卵泡數(shù)。卵泡分類根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行：①始基卵泡，含有單層梭形顆粒細(xì)胞；②初級(jí)卵泡，單層顆粒細(xì)胞中至少有3個(gè)立方形顆粒細(xì)胞；③次級(jí)卵泡，至少有兩層顆粒細(xì)胞而沒(méi)有卵泡腔；④竇卵泡，至少含有兩層顆粒細(xì)胞并且有卵泡腔[8]。

1.7.4 顆粒細(xì)胞凋亡檢測(cè) 用TUNEL法檢測(cè)卵巢顆粒細(xì)胞凋亡情況，按試劑盒說(shuō)明書操作。顯微鏡下計(jì)數(shù)染色的凋亡顆粒細(xì)胞個(gè)數(shù)，至少在8個(gè)不同部位計(jì)數(shù)100個(gè)顆粒細(xì)胞，計(jì)算凋亡顆粒細(xì)胞所占比例。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行分析。正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；行×列表計(jì)數(shù)資料以率表示，多組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法，進(jìn)一步兩兩比較采用χ2分割檢驗(yàn)，校對(duì)后的檢驗(yàn)水平α=0.0045。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠動(dòng)情周期的變化 大鼠正常的動(dòng)情周期為4～5d，分為動(dòng)情前期、動(dòng)情期、動(dòng)情后期和動(dòng)情間期(圖1)。實(shí)驗(yàn)中，正常對(duì)照組大鼠動(dòng)情周期無(wú)改變；模型組和假手術(shù)組大鼠在實(shí)驗(yàn)中動(dòng)情周期持續(xù)紊亂。細(xì)胞移植后16～30d，熱休克BMSCs組與BMSCs組大鼠開(kāi)始恢復(fù)正常動(dòng)情周期；熱休克BMSCs組恢復(fù)正常動(dòng)情周期的大鼠只數(shù)雖多于BMSCs組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P1-15d=1.0，P16-30d=0.358，P31-45d=0.325，P46-60d=0.5，表1)。

表1 各組各時(shí)間點(diǎn)具有正常動(dòng)情周期的大鼠只數(shù)Tab.1 The number of rats having normal estrus cycle in each group at different time points

圖1 大鼠的動(dòng)情周期 (亞甲藍(lán)染色 ×200)Fig.1 Estrus cycle of rat (methylene blue staining ×200)A. Proestrus; B. Oestrus; C. Postestrus; D. Anestrus

2.2 各組大鼠E2、FSH水平變化 各組大鼠基礎(chǔ)E2、FSH水平無(wú)明顯差異(FE2=0.671，PE2=0.614；FFSH=1.773，PFSH=0.139)。細(xì)胞移植后第1天，與正常對(duì)照組比較，其余4組E2水平明顯降低，而FSH則明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(FE2=9.419，PE2=0.000；FFSH=64.122，PFSH=0.000)。但模型組、假手術(shù)組、BMSCs組、熱休克BMSCs組間比較，E2、FSH水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此后，模型組和假手術(shù)組E2水平持續(xù)下降，F(xiàn)SH水平持續(xù)上升。細(xì)胞移植后15d，熱休克BMSCs組與BMSCs組大鼠的E2水平開(kāi)始明顯高于模型組與假手術(shù)組(P＜0.05)，但兩組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。細(xì)胞移植后15d，熱休克BMSCs組及BMSCs組大鼠FSH明顯低于模型組及假手術(shù)組(P＜0.05)，但隨后BMSC組FSH水平轉(zhuǎn)而呈緩慢上升趨勢(shì)。移植第30、45、60天，熱休克MSC組E2水平明顯高于BMSC組(P＜0.05)，但仍低于正常對(duì)照組(P＜0.05)；而FSH水平則明顯低于BMSC組(P＜0.05)，卻高于正常對(duì)照組(P＜0.05，圖2)。

圖2 各組大鼠E2 (A)及FSH(B)的變化曲線Fig.2 The curve of E2 (A) and FSH (B) in each group of rats

2.3 各組大鼠卵巢各級(jí)卵泡計(jì)數(shù)情況 細(xì)胞移植后第1天及第15天，模型組、假手術(shù)組、BMSCs組、熱休克BMSCs組各級(jí)卵泡數(shù)均明顯少于正常對(duì)照組(FD1，始基卵泡=3.491，PD1，始基卵泡=0.026；FD1，初級(jí)卵泡=4.367，PD1，初級(jí)卵泡=0.011；FD1，次級(jí)卵泡=3.065，PD1，次級(jí)卵泡=0.040；FD1，竇卵泡=4.039，PD1，竇卵泡=0.015；FD15，始基卵泡=9.147，PD15，始基卵泡=0.000；FD15，初級(jí)卵泡=13.088，PD15，初級(jí)卵泡=0.000；FD15，次級(jí)卵泡=6.657，PD15，次級(jí)卵泡=0.001；FD15，竇卵泡=13.423，PD15，竇卵泡=0.000)，但模型組、假手術(shù)組、BMSCs組、熱休克BMSCs組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。細(xì)胞移植第30天，BMSCs組和熱休克BMSCs組大鼠各級(jí)卵泡數(shù)較前無(wú)明顯減少，而模型組及假手術(shù)組各級(jí)卵泡數(shù)仍繼續(xù)減少，但4組間各級(jí)卵泡數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。細(xì)胞移植第45天及第60天，BMSCs組和熱休克BMSCs組大鼠各級(jí)卵泡數(shù)均明顯高于模型組及假手術(shù)組(P＜0.05)，且熱休克BMSCs組大鼠各級(jí)卵泡數(shù)均高于BMSCs組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但仍明顯低于正常對(duì)照組(P＜0.05，圖3)。2.4 各組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡情況 細(xì)胞移植后第1天，模型組、假手術(shù)組、BMSCs組、熱休克BMSCs組的卵巢顆粒細(xì)胞凋亡指數(shù)均明顯高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=43.574，P=0.000)，但模型組、假手術(shù)組、BMSCs組、熱休克BMSCs組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。細(xì)胞移植第15、30、45、60天，BMSCs組和熱休克BMSCs組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡指數(shù)均較細(xì)胞移植后第1天明顯降低，且明顯低于模型組及假手術(shù)組(P＜0.05)；而熱休克BMSCs組顆粒細(xì)胞凋亡指數(shù)低于BMSCs組(P＜0.05)，但仍高于正常對(duì)照組(P＜0.05，圖4)。

圖3 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)的各級(jí)卵泡數(shù)Fig.3 The amount of primordial follicles (A), primary follicles (B), secondary follicles (C) and antral follicles (D) in each group of rats at different time points

圖4 細(xì)胞移植后第1(A)、60天(B)各組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡指數(shù)Fig.4 Apoptotic index of ovarian granulosa cells in each group of rats at the first day (A) and sixty days (B) after cell transplantation

3 討 論

自化療藥物應(yīng)用于臨床治療以來(lái)，在為腫瘤及免疫性疾病患者帶來(lái)希望的同時(shí)，也給其中的女性患者帶來(lái)了嚴(yán)重的遠(yuǎn)期危害。化療性卵巢早衰患者的低雌激素癥狀嚴(yán)重影響了其生活質(zhì)量，而卵巢早衰帶來(lái)的不孕問(wèn)題更是對(duì)年輕女性及其家庭造成了嚴(yán)重影響[9]。目前化療性卵巢早衰的治療方法包括激素補(bǔ)充治療[10]、卵巢冷凍移植[11]、卵子捐贈(zèng)體外受精-胚胎移植等，但這些方法均有其局限性：激素補(bǔ)充治療能緩解患者的圍絕經(jīng)期癥狀，但并不能從根本上進(jìn)行治療；卵巢冷凍移植技術(shù)目前尚未成熟，仍有待進(jìn)一步研究；卵子捐贈(zèng)則存在倫理學(xué)問(wèn)題。

目前已有多個(gè)研究顯示干細(xì)胞移植可改善化療藥物所致的卵巢功能受損[4,12]，但移植后細(xì)胞存活率低，嚴(yán)重影響了其治療效果。研究顯示，干細(xì)胞移植后的存活率僅10%～20%，而其凋亡、壞死多發(fā)生于移植后的4d內(nèi)[13]。因此，如何提高移植干細(xì)胞的存活力并保持其生物學(xué)活性成為目前亟須解決的問(wèn)題，是當(dāng)今干細(xì)胞研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。

1962 年Ritossa[14]最早發(fā)現(xiàn)熱休克反應(yīng)的存在，他觀察到在環(huán)境溫度升高時(shí)果蠅染色體發(fā)生蓬松現(xiàn)象，并具有轉(zhuǎn)錄活性。隨后1974年Tissieres等[15]證實(shí)Ritossa當(dāng)時(shí)所猜測(cè)的這種物質(zhì)是一組特殊蛋白質(zhì)，并把這組蛋白質(zhì)命名為HSP。進(jìn)一步體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)熱休克處理可提高移植細(xì)胞的抗凋亡能力，F(xiàn)eng等[16]證實(shí)熱休克處理的BMSCs移植后存活率明顯提高，從而能更有效地改善心臟功能及減少小鼠缺血心肌的纖維化。因此，熱休克可作為細(xì)胞移植前一種較為理想的預(yù)處理方法。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)BMSCs進(jìn)行熱休克預(yù)處理，用于治療大鼠化療性卵巢早衰。陰道涂片結(jié)果顯示，熱休克BMSCs組在細(xì)胞移植后16～30d即有大鼠恢復(fù)正常動(dòng)情期，但大鼠動(dòng)情周期恢復(fù)率與BMSCs組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。血清E2及FSH檢測(cè)結(jié)果顯示細(xì)胞移植30d后，熱休克BMSCs組大鼠E2水平逐漸升高，且與BMSCs組相比升高更為明顯，而FSH則明顯下降。卵泡計(jì)數(shù)結(jié)果顯示細(xì)胞移植第45天后，熱休克BMSCs組大鼠各級(jí)卵泡數(shù)均多于BMSCs組。上述結(jié)果表明，BMSCs經(jīng)熱休克預(yù)處理后能更好地改善化療所致的受損卵巢的內(nèi)分泌功能，并具有更強(qiáng)大的減少卵泡閉鎖、修復(fù)損傷卵巢結(jié)構(gòu)的效果。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，熱休克BMSCs組與BMSCs組相比卵巢顆粒細(xì)胞凋亡減少更明顯，這提示熱休克預(yù)處理BMSCs通過(guò)減少卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡從而發(fā)揮修復(fù)損傷卵巢的作用。

HSP作為分子伴侶在應(yīng)激狀態(tài)下具有重要作用，能在應(yīng)激狀態(tài)下幫助蛋白質(zhì)正確折疊，加快正常蛋白質(zhì)合成的恢復(fù)[17]。研究表明，BMSCs經(jīng)過(guò)一定程度的熱休克處理能在一定時(shí)間內(nèi)持續(xù)高表達(dá)HSP，如HSP27、70、90等[5,16,18]。這提示熱休克處理的細(xì)胞可通過(guò)高表達(dá)HSP而提高抗凋亡能力。且HSP能在細(xì)胞受到短暫刺激后長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)表達(dá)，幫助細(xì)胞度過(guò)移植后的凋亡高峰，從而增加移植細(xì)胞的存活率，提高細(xì)胞移植的治療效果。此外，干細(xì)胞能夠通過(guò)外泌體分泌具有生物活性的細(xì)胞因子或蛋白質(zhì)，從而改變宿主細(xì)胞的生物學(xué)特性[19]。而有研究證實(shí)，干細(xì)胞經(jīng)熱休克預(yù)處理后能旁分泌富含熱休克轉(zhuǎn)錄因子1的囊泡，從而重塑宿主細(xì)胞的相關(guān)染色體[16]。這也是經(jīng)熱休克處理的干細(xì)胞能更好地修復(fù)受損組織的可能機(jī)制之一。

綜上所述，本研究表明BMSCs經(jīng)熱休克處理后能減少卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡，減輕卵泡閉鎖，增加各級(jí)卵泡數(shù)量，改善激素水平，對(duì)化療藥物誘導(dǎo)的卵巢結(jié)構(gòu)及功能損傷具有更顯著的修復(fù)作用，為今后臨床應(yīng)用BMSCs移植治療卵巢早衰提供了一種有效的移植前處理方法。但熱休克處理對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用機(jī)制可能是多方面的，仍有待進(jìn)一步深入研究。

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