創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞素對小鼠骨髓來源巨噬細(xì)胞壞死性凋亡的作用及機制

帥維正，劉劍飛，吳成林，劉妍，蒲倩，王欲曉，周麗君，張志成，段蘊鈾

創(chuàng)傷弧菌(Vibrio vulnificus)是我國沿海常見的致病性海洋弧菌，通常以經(jīng)消化道感染多見，但也可通過傷口沾染后致病，如海上作業(yè)和訓(xùn)練時破損的皮膚黏膜接觸含菌海水即可發(fā)生嚴(yán)重感染[1-2]。創(chuàng)傷弧菌感染機體后除導(dǎo)致局部癥狀和損傷外，膿毒癥是其造成的嚴(yán)重后果之一[3]，文獻(xiàn)提示一旦發(fā)生創(chuàng)傷弧菌感染所致膿毒癥，病死率可超過50%[4]。創(chuàng)傷弧菌的主要致病因子包括溶細(xì)胞素、金屬蛋白酶、軟骨素酶、透明質(zhì)酸酶等細(xì)胞外產(chǎn)物[5]，其中針對創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞素(Vibrio vulnificus cytolysin，VVc)的研究較多，VVc可對不同細(xì)胞產(chǎn)生致傷致死作用，導(dǎo)致細(xì)胞溶解、凋亡等。目前的研究多集中在VVc所致細(xì)胞凋亡的機制等方面，但凋亡作為非炎癥性的細(xì)胞死亡方式，不能解釋創(chuàng)傷弧菌引起的劇烈炎癥反應(yīng)，尤其是膿毒癥休克。壞死性凋亡(necroptosis)是新近發(fā)現(xiàn)的一種可調(diào)節(jié)炎癥性細(xì)胞壞死方式，其在具有程序性死亡特性的同時，還具有可以引起并擴大炎癥反應(yīng)的特點。近年來研究顯示壞死性凋亡在許多人類疾病中起重要作用，而壞死性凋亡是否在創(chuàng)傷弧菌的致病過程中發(fā)揮作用，目前尚無報道。本研究探討VVc在永生化小鼠骨髓來源的巨噬細(xì)胞(immortalized bone marrow-derived macrophage，iBMDM)壞死性凋亡中的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及材料 iBMDM由邵峰院士惠贈，DMEM培養(yǎng)液及磷酸鹽緩沖液(PBS)購自美國Hyclone公司，胎牛血清(FBS)購買于美國Gibco公司，CytoTox 96?非放射性細(xì)胞毒性檢測試劑盒購自美國Promega公司，Annexin V-FITC/PI試劑盒購自德國美天旎公司，caspase1、caspase11抗體購自圣克魯斯生物技術(shù)有限公司，GSDMD(gasdermin D protein)、混合系列蛋白激酶樣結(jié)構(gòu)域(mixed lineage kinase domain-like protein，MLKL)、磷酸化MLKL(pMLKL)抗體購自美國Abcam公司。受體相互作用蛋白1(receptor-interacting protein 1，RIP1)抑制劑necrostatin-1(Nec-1)購自美國Sigma公司。

1.2 VVc蛋白制備 使用本單位前期制備的VVc蛋白， 根據(jù)GenBank中公布的VVc(GenBank=NC_005140.1)序列設(shè)計擴增目的基因引物。Pvvf1：5'-GCGGATC CATGAAAAAAATGACTCTGTTT-3'(BamH Ⅰ)；Pvvr2：5'-CCCTCGAGGAGTTTGACTTGTTGTAAT GT-3'(Xho Ⅰ)，由上海生工進行基因的克隆與鑒定，并構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒，獲得在大腸埃希菌中的高效表達(dá)并行SDSPAGE鑒定，將純化VVc蛋白置于–70℃保存?zhèn)溆肹6]。

1.3 乳酸脫氫酶(LDH)檢測評價細(xì)胞毒性 按不同濃度梯度(1、2、4μg/ml)VVc刺激iBMDM，采用細(xì)胞毒性檢測試劑盒測定細(xì)胞上清LDH水平。具體方法為：將50μl待測細(xì)胞上清轉(zhuǎn)移至96孔酶分析板中，每孔均加入50μl底物，用鋁箔紙覆蓋，室溫孵育30min；加入50μl終止液，檢測490nm波長處吸光度(OD)值。死亡率(%)=(實驗組OD值－陰性組OD值)/(陽性組OD值－陰性組OD值)×100%。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 根據(jù)上述結(jié)果將iBMDM分為5組：對照組、VVc 2μg/ml組、VVc 2μg/ml+Nec-1 5μmol/L組、VVc 4μg/ml組和VVc 4μg/ml+Nec-1 5μmol/L。用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，加入青霉素(100U/ml)和鏈霉素(100μg/ml)，置于5% CO2、37℃、恒溫、恒濕的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。VVc組以相應(yīng)濃度VVc刺激iBMDM細(xì)胞，RIP1抑制劑組在VVc處理前1h加入5μmol/L的Nec-1，2h后收集細(xì)胞和培養(yǎng)基上清。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測iBMDM凋亡情況 采用流式細(xì)胞檢測試劑盒測定細(xì)胞狀態(tài)。具體方法為：收集待測細(xì)胞，加入1ml結(jié)合緩沖液漂洗細(xì)胞，300×g離心10min，棄上清；加入100～150μl結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，加入10μl annexin V，混勻避光室溫孵育15min；再加入1ml結(jié)合緩沖液，300×g離心10min，棄上清；加入500μl結(jié)合緩沖液重懸；加入5μl PI，上機檢測。

1.6 Western blotting檢測焦亡與壞死性凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá) 收集各實驗孔細(xì)胞，提取蛋白，行12% SDS-PAGE凝膠電泳；采用濕轉(zhuǎn)方法，將蛋白轉(zhuǎn)印至0.2μm孔徑的PVDF膜上：將轉(zhuǎn)印好的PVDF膜在TBST配制的5%BSA中室溫封閉3h，TBST洗膜3次，每次5min；加入一抗[MLKL(1:1000)，pMLKL(1:1000)，Actin(1:10 000)]4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次5min；加入TBST配制的5%BSA，再加入二抗(均為HRP標(biāo)記山羊抗兔抗體1:10 000)室溫水平搖床孵育1h，TBST洗膜3次，每次5min。采用化學(xué)發(fā)光劑ECL顯色，GE化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進行圖像采集，采用Image J軟件對灰度值進行分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 LDH法評價VVc對iBMDM細(xì)胞的毒性情況采用1、2、4μg/ml不同濃度VVc刺激iBMDM細(xì)胞2h，如圖1所示，LDH水平隨VVc濃度升高而上調(diào)，提示細(xì)胞死亡率增加，其中4μg/ml濃度處理后LDH明顯上升，而2μg/ml濃度次之；加入Nec-1預(yù)處理后，細(xì)胞上清LDH水平明顯降低(P＜0.05)。

2.2 流式細(xì)胞儀檢測iBMDM凋亡情況 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，iBMDM接受VVc處理后，Annexin V/PI雙染色陽性細(xì)胞比例增加，使用Nec-1預(yù)處理后，雙陽性染色細(xì)胞的比例下降(P＜0.05，圖2)。

圖1 LDH法評價VVc處理對iBMDM細(xì)胞的毒性(n=3)Fig.1 Analysis of LDH levels in supernatant of iBMDM cells following the VVc challenge (n=3)

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測iBMDM凋亡情況Fig.2 Effect of VVc on iBMDM cells (Flow cytometry)

2.3 Western blotting檢測焦亡與壞死性凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá) Western blotting檢測結(jié)果顯示，iBMDM在接受VVc刺激后，存在磷酸化MLKL(pMLKL/MLKL)表達(dá)上調(diào)，而這一磷酸化過程可被Nec-1預(yù)處理所抑制(P＜0.05，圖3A)。VVc刺激后，caspase1、caspase11以及GSDMD等凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)量有所變化，但均未見其活化剪切體表達(dá)(圖3B)。

3 討 論

VVc是具有創(chuàng)傷弧菌種屬特征性的外毒素，是創(chuàng)傷弧菌感染的重要致病因子[7]。研究表明，VVc通過誘導(dǎo)產(chǎn)生超氧陰離子，介導(dǎo)鈣離子內(nèi)流以及刺激合成一氧化氮合酶(NOS)等方式啟動細(xì)胞凋亡信號通路的活化[8-10]。此外，也有報道提示VVc可通過誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞TNF-α和IL-6表達(dá)，上調(diào)機體炎癥反應(yīng)水平[11]，但是否會導(dǎo)致炎癥性細(xì)胞程序性死亡則未見明確報道。

壞死性凋亡和焦亡均屬于程序性細(xì)胞死亡(programmed cell death，PCD)，目前認(rèn)為GSDMD和MLKL是焦亡和壞死性凋亡的最終執(zhí)行蛋白，當(dāng)其轉(zhuǎn)化為激活狀態(tài)時標(biāo)志著各自細(xì)胞程序性死亡的發(fā)生[12]。雖然同屬PCD，但兩者也有著明顯的差異。首先，調(diào)控途徑不同，在壞死性凋亡發(fā)生的過程中，MLKL由于受到壞死復(fù)合物(necrosome)關(guān)鍵組分中RIP1和RIP3的調(diào)控而出現(xiàn)磷酸化，進而發(fā)生寡聚化并轉(zhuǎn)位于細(xì)胞膜上，激活相關(guān)離子通道。而在焦亡的進程中，炎癥型半胱氨酸天冬酶caspase-1和caspase-11通過剪切GSDMD蛋白使其產(chǎn)生具有活性的氮段蛋白片段(GSDMD-NT)，GSDMD-NT形成聚合物后在細(xì)胞膜內(nèi)面上的脂質(zhì)雙分子層形成小孔。其次，作用方式不同，雖然兩者同樣為細(xì)胞膜完整性受損，表現(xiàn)為細(xì)胞PI染色陽性。但磷酸化的MLKL在細(xì)胞膜上產(chǎn)生具有選擇性的離子通道開放，而GSDMD-NT卻形成的是非選擇性的小孔[13]。本研究中，雖然細(xì)胞接受處理后死亡現(xiàn)象明顯，焦亡相關(guān)蛋白原形形式(caspase-1、caspase-11、GSDMD)有表達(dá)量的變化，卻均未見活性剪切體的出現(xiàn)，因此無法證明其中發(fā)生了焦亡，有待后續(xù)研究對其進行深入探討。

圖3 Western blotting檢測各組焦亡與壞死性凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)Fig.3 Expression of pyroptosis and pyroptosis-related proteins (Western blotting)

壞死性凋亡發(fā)生時，相關(guān)信號通路導(dǎo)致MLKL發(fā)生磷酸化激活，也使得其空間構(gòu)象出現(xiàn)改變，MLKL通過N端的四螺旋束形成寡聚化，并轉(zhuǎn)位至細(xì)胞膜。pMLKL與TRMP7 細(xì)胞膜離子通道和Na+離子通道結(jié)合，引起Ca2+、Na+內(nèi)流進而導(dǎo)致細(xì)胞腫脹、崩解[14]。MLKL的磷酸化即意味著壞死性凋亡的執(zhí)行。

目前的研究發(fā)現(xiàn)壞死性凋亡參與了多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程。例如在實驗中觀察到，當(dāng)抑制了RIP1的激活后，可以減輕腦、腎臟和心臟組織的缺血再灌注損傷程度[15-17]。

而在使用腫瘤壞死因子建立的全身炎癥反應(yīng)綜合征的動物模型中，相較于野生型動物組，壞死性凋亡抑制組動物存活率較高，臟器損害和炎癥反應(yīng)水平也較低[18]。在VVc處理iBMDM細(xì)胞后，Western blotting檢測中可見pMLKL的表達(dá)水平上調(diào)，結(jié)合細(xì)胞上清LDH測定以及流式細(xì)胞檢測結(jié)果提示其中可能發(fā)生了壞死性凋亡。為證實這一結(jié)果，本研究采用壞死性凋亡抑制劑對此進行了反向驗證。

RIP1激酶在細(xì)胞壞死性凋亡通路中被激活后，RIP1暴露RHIM結(jié)構(gòu)域，與RIP3相互結(jié)合形成巨大的淀粉樣結(jié)構(gòu)，進而導(dǎo)致MLKL磷酸化，促發(fā)細(xì)胞發(fā)生程序性壞死及炎癥因子產(chǎn)生。所以RIP1是調(diào)控壞死性凋亡信號通路的關(guān)鍵因子。在實驗中，當(dāng)使用RIP1的特異性抑制劑Nec-1對iBMDM細(xì)胞進行預(yù)處理后，VVc所引起的細(xì)胞死亡率和pMLKL蛋白磷酸化水平受到抑制，這一結(jié)果從另一方面證實了VVc可導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)壞死性凋亡并且是通過RIP1信號通路激發(fā)。

本研究通過Western blotting觀察到了MLKL的磷酸化水平上調(diào)，證實了壞死性凋亡的發(fā)生，且當(dāng)使用RIP1的特異性抑制劑Nec-1抑制了RIPK1激酶的激活后，細(xì)胞死亡水平相應(yīng)降低，提示RIP1相關(guān)的細(xì)胞壞死得到了抑制，而pMLKL相對表達(dá)量的降低則進一步揭示了Nec-1是通過RIP1/MLKL途徑抑制iBMDM細(xì)胞受到VVc作用后發(fā)生的壞死性凋亡。這對進一步理解創(chuàng)傷弧菌的致病機制，以及針對創(chuàng)傷弧菌所致膿毒癥的治療提供了一條新的思路。

致謝：感謝邵峰院士、高文青博士無償惠贈iBMDM細(xì)胞并對本研究予以幫助。

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