散發(fā)性結(jié)直腸癌組織MMR蛋白表達變化及其與患者臨床病理參數(shù)和預后的關(guān)系

宋蒨，石紅建，任景麗，黃優(yōu)華，徐強，孫鐘武，張中平

(1 江蘇大學附屬武進醫(yī)院，江蘇常州213002；2 鄭州大學第二附屬醫(yī)院)

據(jù)統(tǒng)計，約95%結(jié)直腸癌為散發(fā)性結(jié)直腸癌(SCC)[1,2]，而15% SCC是由錯配修復基因(MMR)蛋白表達缺失引起的[3]。目前在人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的MMR有9種，即hMLH1、hMLH3、hPMS1、hPMS2、hMSH2、hMSH3、hMSH4、hMSH5、hMSH6，其作用主要是識別錯配位點并予以糾正，以保證DNA復制的準確性。如MMR發(fā)生突變，將引起機體錯配修復功能缺失，導致整個基因組不穩(wěn)定，從而使某些癌基因或突變的抑癌基因快速聚集，繼而形成腫瘤[4]。在MMR中，hMLH1、hMSH2、hMSH6突變約占MMR突變的90%以上[5，6]。本研究觀察了SCC組織MMR蛋白表達變化，現(xiàn)分析其表達變化與患者臨床病理參數(shù)和預后的關(guān)系。

1 臨床資料

1.1 基本資料 研究對象為2009年6月～2012年6月在江蘇大學附屬武進醫(yī)院行手術(shù)治療的SCC患者180例，均經(jīng)術(shù)后組織病理檢查明確診斷?；颊吣?8例、女82例，年齡60～86(70.89±8.13)歲；腫瘤直徑：≥5 cm 76例，<5 cm 104例；腫瘤形態(tài)：潰瘍型95例，隆起型47例，浸潤型38例；腫瘤部位：右半結(jié)腸106例，左半結(jié)腸或直腸74例；病理類型：腺癌136例，黏液腺癌或其他類型44例；TNM分期[7]：Ⅱ期86例，Ⅲ期94例；組織分化程度：高分化68例，中低分化112例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移94例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移86例。術(shù)后每3個月隨訪1次，隨訪方式包括門診及住院復查、電話隨訪等。隨訪截至2017年6月，中位隨訪時間60個月，死亡68例。

1.2 統(tǒng)計學方法 采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗。生存分析采用Kaplan-Meier法，生存率比較采用Log-rank檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

1.3 SCC組織hMLH1、hMSH2、hMSH6蛋白表達檢測 取手術(shù)切除的SCC組織，采用免疫組化法檢測hMLH1、hMSH2、hMSH6蛋白表達。以正常結(jié)直腸黏膜上皮作為陽性對照，用PBS代替一抗作為陰性對照。結(jié)果判斷：MMR蛋白定位于細胞核，以細胞核出現(xiàn)棕黃色或黃褐色顆粒為陽性細胞。隨機選取5個200倍視野，每個視野計數(shù)100個細胞，計算陽性細胞所占比例。根據(jù)染色強度和陽性細胞所占比例綜合判斷MMR蛋白表達。染色強度：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽性細胞所占比例：無陽性細胞為0分，≤10%為1分，>10%～≤50%為2分，>50%～≤75%為3分，>75%為4分。兩項評分的乘積>3分為MMR蛋白表達正常，≤3分為MMR蛋白表達缺失。hMLH1、hMSH2、hMSH6蛋白均正常表達為正常表達(pMMR)，至少一項蛋白表達缺失即為陰性表達(dMMR)。本組MMR蛋白表達缺失29例，表達缺失率為16.1%。其中hMLH1蛋白表達缺失19例，hMSH2蛋白表達缺失13例，hMSH6蛋白表達缺失10例；僅hMLH1蛋白表達缺失11例，僅hMSH2蛋白表達缺失4例，僅hMSH6蛋白表達缺失3例，hMLH1、hMSH2蛋白表達均缺失4例，hMSH2、hMSH6蛋白表達均缺失3例，hMLH1、hMSH6蛋白表達均缺失2例，hMLH1、hMSH2、hMSH6蛋白表達均缺失2例。本組pMMR 29例，dMMR151例。

1.4 SCC組織MMR蛋白表達與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 見表1。

表1 SCC組織MMR蛋白表達與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系(例)

1.5 不同MMR表達者5年無病生存率及5年總生存率比較 采用Kaplan-Meier法繪制生存時間曲線，經(jīng)Log-rank檢驗，dMMR者與pMMR者5年無病生存率分別為75.9%(22/29)、43.7%(66/151)，5年總生存率分別為82.8%(24/29)、58.3%(88/151)，兩者比較差異均有統(tǒng)計學意義(χ2分別為10.872、6.044，P均<0.01)。見圖1、2。

2 討論

1993年Lothe等[8]發(fā)現(xiàn)了一條新的可導致SCC途徑——MMR途徑。MMR蛋白的主要功能是保證基因復制的精確性，在DNA復制過程中出現(xiàn)堿基錯配時，MMR識別并予以修復，以保證基因組穩(wěn)定性。如MMR發(fā)生突變，將引起錯配修復功能缺失，導致整個基因組不穩(wěn)定，從而使某些癌基因或突變的抑癌基因快速聚集，繼而形成腫瘤[4]。

圖1 不同MMR表達SCC患者無病生存時間曲線

圖2 不同MMR表達SCC患者總生存時間曲線

目前已在人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了9種MMR蛋白，任意一個MMR蛋白表達缺失，均會導致MMR系統(tǒng)功能缺失。在MMR突變中，hMLH1、hMSH2、hMSH6突變超過90%。hMLH1、hMSH2、hMSH6多形成異源二聚體發(fā)揮作用，可特異性識別核苷酸鏈上的錯配位點，并進行切除、修復。hMLH1蛋白在錯配修復過程中主要參與核酸內(nèi)切酶激活，在切開堿基及解除雙螺旋過程中發(fā)揮重要作用，并參與合成新的核苷酸鏈；還可與hPMS1形成Mutlα，糾正錯誤插入的堿基。hMSH2是最早發(fā)現(xiàn)的MMR蛋白，其表達于所有正常結(jié)直腸黏膜，通過與hMLH1蛋白結(jié)合形成異源二聚體hMutLα，hMutLα識別并結(jié)合錯配修復的堿基，繼而激活核酸內(nèi)切酶，切除錯配的堿基。hMSH6具有ATP酶活性，在錯配修復過程中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，還可與hMSH2蛋白形成二聚體，接受ATP供能，與相應的錯配堿基結(jié)合并將其游離。在DNA復制過程發(fā)生堿基錯配后，MMR系統(tǒng)啟動修復。修復過程包括錯配堿基識別、MMR蛋白聚集、錯配堿基修復。相應的MMR蛋白在形成異二聚體后，切除包含錯配堿基的DNA片段，然后補充新合成的正確DNA片段，以確?；蛐畔蚀_。當MMR基因發(fā)生突變或修飾后，MMR蛋白表達缺失，繼而MMR功能缺失，最終導致腫瘤發(fā)生[9]。MMR蛋白低表達可降低基因錯配修復功能，增加腫瘤發(fā)生的易感性。其引起腫瘤發(fā)生的機制：①MMR功能缺失可引起基因組變化，造成簡單重復序列的累積，發(fā)生微衛(wèi)星不穩(wěn)定，而微衛(wèi)星不穩(wěn)定可造成某些癌基因的激活，進一步誘發(fā)腫瘤[10]；②MMR系統(tǒng)缺陷會直接造成某些原癌基因和抑癌基因突變，如無法及時糾正，將導致癌基因異常表達、累積，最終導致腫瘤發(fā)生。

本研究結(jié)果顯示，SCC組織MMR蛋白表達缺失率達16.1%，與Ghanipour等[11]研究結(jié)果基本一致。既往研究發(fā)現(xiàn)，MMR蛋白表達缺失與腫瘤某些臨床病理特征有關(guān)[12，13]。本研究發(fā)現(xiàn)，MMR蛋白表達缺失與腫瘤直徑、TNM分期、組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，與既往研究[14，15]結(jié)果基本一致。有研究發(fā)現(xiàn)，MMR蛋白表達變化與腫瘤患者預后密切相關(guān)[14，16]；以5-Fu為基礎的化療可延長結(jié)直腸癌患者生存時間，提高患者5年生存率[17]。但也有研究認為，dMMR者無法從以5-Fu為基礎的化療方案中獲益，對TNM分期為Ⅱ期的dMMR者甚至有害[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，dMMR者5年無病生存率及總生存率均高于pMMR者。提示dMMR者預后相對較好，可能與MMR可增強患者免疫監(jiān)視功能有關(guān)[19]，也可能與腫瘤組織胸苷合成酶和二氫嘧啶脫氫酶過表達有關(guān)[13]。

綜上所述，SCC組織可出現(xiàn)MMR蛋白表達缺失，其表達變化與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及患者預后有關(guān)。

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